花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

杨贺英; 罗彩萍; 彭婷; 梁文仪; 沈颂章; 苏娟

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

杨贺英^1,,
罗彩萍²,
彭婷²,
梁文仪²,
沈颂章²,
苏娟^{1, 2, ,}

1.
上海大学医学院, 上海 200444
2.
海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

基金项目: 国家自然科学基金（82304813）；大学生创新能力培养项目（FH2023095）

详细信息

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1.
School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China
2.
National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

摘要: 目的优化大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺条件，并进行成分分析。方法单因素实验与正交试验相结合，以羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）含量为指标，确定最佳工艺参数。利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术定性分析生物碱类化学成分。结果最佳条件为选用三菱HP-20型大孔树脂，上样液浓度为0.2 g生药/ml，生药量与树脂体积比为1 g∶2.5 ml，树脂柱径高比为1∶7，以每小时4倍柱体积（BV）的速率动态吸附，静置1 h；20%乙醇2 BV除杂；80%乙醇5 BV洗脱。HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，共鉴定出20种生物碱。结论该方法稳定可行，得到高纯度多种类的花椒生物碱，可用于花椒生物碱的富集纯化。
- 花椒 /
- 生物碱 /
- 大孔树脂 /
- 正交设计 /
- 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱
Abstract: Objective To optimize the process conditions and analyze the components of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim（Z. bungeanum）using macroporous resin. Methods Combining single factor tests and orthogonal tests, the content of hydroxy-α-sanshool（HAS）and hydroxy-β-sanshool（HBS）were considered as indexes to determine the best process parameters. Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole tandem time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS^E）was used to identify the structures of alkaloids. Results The optimal conditions were Mitsubishi HP-20 macroporous resin, the loading solution concentration was 0.2 g crude drug/ml, the ratio of crude drug to resin volume was 1 g∶2.5 ml, the diameter/height ratio of resin column was 1∶7, the dynamic adsorption flow rate was 4 times of bed volume（BV）per hour, and the adsorption time was 1 h. Impurities were removed by using 2 BV of 20% ethanol, 5 BV of 80% ethanol was used to elution, and the content of HAS and HBS was 4.71% and 1.02%, respectively. A total of 20 alkaloids were identified from Z. bungeanum. Conclusion This method was stable and feasible, obtaining high purity and various kinds of alkaloids, which could be used for the enrichment and purification of alkaloids from Z. bungeanum.
- Zanthoxylum bungeanum Maxim /
- alkaloids /
- macroporous resin /
- orthogonal design /
- UPLC-Q-TOF-MS^E
辅酶Q₁₀（CoQ₁₀）是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，作为细胞中的辅酶，其具有重要且广泛的药理作用^[1]，目前主要用于预防心血管疾病和增强免疫力等方面^[2-4]。CoQ₁₀分子量高、水溶性低，口服生物利用度低，注射剂稳定性差，对光十分敏感^[5]，越来越多的研究表明静脉注射乳剂是其理想载体^[6]。

高油量可溶解更大量药物，对极难溶性药物的优势更为明显。但是目前对于含药静脉注射乳剂的研究中，油的质量体积比通常为10%^[7]，更高油量的研究相对较少。基于营养型脂肪乳剂的长期临床应用实践，高油量静脉注射乳剂的安全性已得到证实，具有广阔的发展空间和巨大的市场价值。同时乳剂不能经受冷冻也长期困扰着研究者们，卵磷脂与含亲水链段的乳化剂组合及恰当的油黏度是解决此问题的关键。本研究在乳剂经典处方中添加单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1），GM1含有一个较大的亲水头基，具有两亲性，利用其特殊的结构优势来解决乳剂不耐受冻融的难题。本研究旨在制备高油量、高载药量且耐冻融循环的CoQ₁₀乳剂，建立其HPLC含量分析方法，并进行物理化学性质表征和稳定性评价，以弥补CoQ₁₀现有制剂的不足，为高油量含药静脉注射乳剂的研究开发提供参考依据。

1.   仪器与试剂

BS124s电子分析天平（德国Sartorius公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；高速分散机（德国IKA T18 ULTRA TURRAX）；M-110L型微射流仪（美国Microfluidics公司）；垂直旋转自动高压灭菌器（沈阳天美达科学仪器有限公司）；Nicomp-380 激光粒度测定仪（美国Particle Sizing Systems公司）；PHS-2C型数字显示酸度计（上海伟业仪器厂）；CS120GXL型超速离心机（日本Hitachi公司）；UV228紫外-可见光检测器、P230高压恒流泵（大连依利特分析仪器有限公司）；高精度全自动交流稳压器（浙江中川电气科技有限公司）；AT-130柱温箱（天津市金洲科学仪器有限公司）；人工气候箱（德国MMM公司）。

CoQ₁₀（广东润和生物科技有限公司，批号：2017052405，纯度$\geqslant $98%），中链油（MCT，辽宁铁岭北亚药用油有限公司，注射级），大豆油（LCT，辽宁铁岭北亚药用油有限公司，注射级），蛋黄卵磷脂（E₈₀，德国Lipoid公司，注射级），GM1（重庆寰瑞生物制药有限公司，注射级），维生素E（V_E，BASF维生素有限公司），甘油（湖南尔康制药有限公司，注射级），聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯（HS15，德国BASF公司，注射级），葡萄糖注射液（昆明南疆制药有限公司），氯化钠注射液（吉林省都邦药业股份有限公司），灭菌注射用水（石家庄四药有限公司），其他试剂均为色谱纯。

2.   方法与结果

2.1   CoQ₁₀乳剂的制备

油种类对乳剂的稳定性至关重要，LCT和MCT单独应用时均存在各自的缺陷，且乳剂不能经受冷冻，因此将二者联合应用，质量比为1∶1^[8]。结合静脉注射乳剂经典处方组成，CoQ₁₀乳剂按如下方法制备^[9]。称取质量体积比为30% LCT/MCT (质量比1∶1)、2% E₈₀、0.05% V_E和2% CoQ₁₀于60 ℃水浴中加热熔融、分散均匀。2.25%甘油和0.2% GM1溶解于适量重蒸水中，60 ℃加热搅拌至完全溶解。待两相温度平衡后，高剪切搅拌下（8000 r/min）将水相加入油相中，完全加入后继续分散5 min，即得初乳。待初乳冷却至室温后，加重蒸水定容至处方量。将初乳转移至微射流仪中，经6 000 psi均质3个循环，14 000 psi均质6个循环减小粒径。依次过0.80和0.45 μm微孔滤膜。将所得乳剂分装，充氮气，121 ℃灭菌8 min。

2.2   CoQ₁₀乳剂HPLC方法的建立

2.2.1   色谱条件^[10]

色谱柱：Betasil C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特）；流动相：甲醇-无水乙醇（体积比20∶80）；柱温：35 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；进样量：20 μl。

2.2.2   溶液的配制

精密称定CoQ₁₀ 25.0 mg，置于25 ml量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000.0 μg/ml的CoQ₁₀对照品储备液。精密移取CoQ₁₀乳剂0.1 ml，置于10 ml量瓶中，加入无水乙醇破坏乳剂并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得CoQ₁₀乳剂样品溶液。

2.2.3   专属性试验

取CoQ₁₀乙醇溶液20 μl进样，记录色谱图。将空白乳和CoQ₁₀乳剂分别加适量无水乙醇破乳，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取各续滤液20 μl进样，记录色谱图。在此色谱条件下辅料和溶剂对药物测定无干扰，见图1。

图 1 空白乳剂（A）、CoQ₁₀溶液（B）和CoQ₁₀乳剂（C）的HPLC图

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.2.4   线性关系考察

精密量取CoQ₁₀对照品储备液适量，用无水乙醇稀释成浓度为10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/ml的系列标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜，各取20 μl进样分析，记录峰面积A。以A对浓度C（μg/ml）进行线性回归，得线性方程为A=15738 C- 12584，r=0.999 8。结果表明CoQ₁₀在10.0 ~ 250.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.5   精密度试验

分别取低、中、高浓度（25.0、100.0、200.0 μg/ml）的CoQ₁₀对照品溶液，于2、4、6、8、10 h各测定一次，以峰面积求算日内精密度；于1、2、3、4、5天各测定一次，以峰面积求算日间精密度。结果表明RSD均小于2%，方法精密度良好。

2.2.6   稳定性试验

取“2.2.2”项下CoQ₁₀乳剂样品溶液室温下避光放置，于0、2、4、6、8、10、24 h分别取20 μl进样分析，记录峰面积。计算得各时间点峰面积为0 h测定值的100.45%、101.23%、99.27%、100.26%、99.34%及100.06%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.2.7   重复性试验

按“2.2.2”项下方法平行制备6份CoQ₁₀乳剂样品溶液。另精密称定CoQ₁₀适量，加乙醇溶解并稀释成浓度为200.0 μg/ml的溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得对照品溶液。精密量取样品和对照品溶液20 μl进样，记录峰面积。外标法计算得样品中药物浓度分别为201.3、199.6、198.2、200.7、199.2、198.4 μg/ml，RSD为0.62%，表明该方法重复性良好。

2.2.8   回收率试验

精密移取CoQ₁₀对照品储备液0.25、1.0和2.0 ml各3份于10 ml量瓶中，分别加入0.1 ml空白乳，再加乙醇破坏乳剂并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜。将上述各溶液进样分析，记录峰面积，按“2.2.4”项下标准曲线方程求得药物浓度，计算回收率。结果表明25、100和200 μg/ml CoQ₁₀样品溶液的平均回收率分别为100.04%、99.63%和100.49%，RSD分别为0.29%、0.80%和0.52%。

2.3   CoQ₁₀乳剂的质量评价

2.3.1   外观

按照“2.1”项下的处方工艺制备CoQ₁₀乳剂，观察其外观。CoQ₁₀乳剂外观为淡黄色均匀乳状液体，无油滴、不溶性成分或块状团聚物，见图2。

图 2 CoQ₁₀乳剂的外观

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.3.2   物理化学性质

取CoQ₁₀乳剂适量，用蒸馏水稀释至适宜浓度，采用激光散射粒径测定仪测定3批CoQ₁₀乳剂的粒径、粒径分布和Zeta电位。测定波长为632.8 nm，测定角为90°，测定温度为25 ℃。结果显示3批样品的平均粒径为（239.5±0.8）nm，未见大于5 μm的粒子，符合静脉注射液的要求；粒径为（0.300±0.011）nm；Zeta电位为（−32.28±2.04）mV。同时测定了CoQ₁₀乳剂的pH值为（5.86±0.02），符合注射剂质量要求。

2.3.3   含量测定

精密量取CoQ₁₀ 乳剂0.1 ml（含CoQ₁₀约2 mg）于10 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取20 μl进样，记录色谱图。另取相同浓度的药物溶液，同法测定。外标法计算乳剂中CoQ₁₀的含量，最终测得3批供试品的标示量百分比分别为99.18 %、101.50 %和101.08%，RSD为1.24%。

2.3.4   包封率测定

采用超速离心法测定CoQ₁₀乳剂的包封率。乳剂经过超速离心后，油相、乳化层和水相彻底分开，将油相与乳化层中的药物量合并考虑，通过测定水相中的药物量来计算包封率。精密移取CoQ₁₀乳剂0.1 ml至10 ml量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进行HPLC检测，外标法计算药物总量。移取CoQ₁₀乳剂4 ml至超速离心管中，温度为4 ℃，以50 000 r/min离心2 h。精密移取下层液体1.0 ml至10 ml量瓶中，乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进行HPLC检测，外标法计算水相中药物含量。按上述方法测得3批CoQ₁₀乳剂的平均包封率为（98.5%±1.1）%，表明药物绝大部分存在于制剂的油相和油水界面层中。

2.4   灭菌和冻融稳定性

将CoQ₁₀乳剂分装于西林瓶，充氮气密封，121 ℃灭菌8 min。参考《化学药物稳定性研究技术指导原则》中涉及乳剂冻融试验的方法，将灭菌后样品在−20 ℃冷冻48 h，40 ℃放置48 h为一个循环，共循环3次，每完成一个循环测定粒径。结果显示3批CoQ₁₀乳剂均具有良好的灭菌稳定性和冻融稳定性，见表1。

表 1 CoQ₁₀乳剂的灭菌和冻融试验结果

批次粒径（l/nm）
灭菌前灭菌后冻融1次冻融2次冻融3次

1 241.4 239.6 255.7 263.0 271.2
2 238.5 240.0 252.6 265.9 272.3
3 240.2 238.7 259.0 263.5 269.1

下载: 导出CSV
| 显示表格

2.5   稀释稳定性

以平均粒径和粒径分布为指标，考察CoQ₁₀乳剂在5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液中的稀释稳定性。将制剂用上述稀释介质进行50倍稀释，于0、2、4、6、8、10、12、24 h取样，测定粒径和粒径分布。结果见图3，制剂经5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液稀释后放置24 h，粒径和粒径分布均比较稳定，稀释稳定性良好。

图 3 CoQ₁₀乳剂用5%葡萄糖和0.9%氯化钠注射液稀释50倍后粒径和粒径分布的变化（n=3）

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.6   光降解试验

CoQ₁₀结构中含有大量不饱和双键，是典型的光敏性药物。以药物含量为主要指标，考察不同因素对CoQ₁₀乳剂光解速率的影响。将样品分装于透明西林瓶，置于人工气候箱中，于（25±2） ℃、（4500±500）lux条件下进行强制光解试验，调整样品与光源的距离约10 cm，使受光均匀，分别于0、24、48、72、96、120 h取样，HPLC法测定药物含量。绘制光降解曲线，并进行反应级数拟合，求出光解半衰期（t_1/2）。

2.6.1   载体对光照稳定性的影响

将适量CoQ₁₀用无水乙醇溶解并稀释，即得CoQ₁₀溶液。称取0.25% CoQ₁₀和3% HS₁₅于55 ℃水浴中加热熔融，分散均匀。搅拌状态下加入预热至相同温度的注射用水，搅拌10 min，即得CoQ₁₀胶束。制备相同药物浓度（1 mg/ml）的CoQ₁₀溶液、胶束和乳剂进行光解试验。光解曲线见图4，反应级数均为一级。对CoQ₁₀的光保护作用由强到弱依次为乳剂、胶束和溶液，t_1/2分别为239.0、50.6和29.4 h。

图 4 CoQ₁₀乳剂、胶束和溶液的光降解曲线（n=3）

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.6.2   稀释倍数对光照稳定性的影响

将CoQ₁₀乳剂（20 mg/ml）分别稀释0、2、4、10、20倍进行光解试验。光解曲线见图5，反应级数均为一级，稀释倍数由低到高，t_1/2分别为533.1、495.0、288.8、115.5和62.4 h。

图 5 不同稀释倍数CoQ₁₀乳剂的光降解曲线（n=3）

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.6.3   载药量对光照稳定性的影响

分别制备0.1%（1 mg/ml）和2.0%（20 mg/ml）载药量的CoQ₁₀乳剂，进行光解试验。光解曲线见图6，反应级数均为一级，0.1%和2.0%载药量乳剂的t_1/2分别为233.5和533.1 h。结果表明，光解速率与载药量呈反比，载药量越大，光解速率越小。

图 6 不同载药量CoQ₁₀乳剂的光降解曲线（n=3）

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.7   影响因素试验

CoQ₁₀乳剂需在冰箱（2~8 ℃）内储存，因此以下稳定性实验参照《中国药典》2020版中对温度特别敏感药物制剂的实验条件进行。

2.7.1   光照稳定性

将CoQ₁₀乳剂分装于棕色西林瓶中，充氮气、密封，在（25±2） ℃、（4 500±500） lux条件下，于第0、5、10天取样，以制剂外观、含量、粒径、pH为评价指标，考察CoQ₁₀乳剂的光照稳定性。结果(见表2)表明3批制剂的含量和pH略有下降，提示该乳剂需避光制备与储存。

表 2 CoQ₁₀乳剂的光照稳定性试验结果

天数（t/d）外观含量（%）粒径（l/nm） pH

0 良好 100.4 243.2 5.82
5 良好 97.7 239.8 5.79
10 良好 93.6 241.4 5.70

下载: 导出CSV
| 显示表格

2.7.2   40 ℃高温稳定性

将CoQ₁₀乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（40±2） ℃条件下避光放置，于第0、5、10天取样，以制剂外观、含量、粒径、pH为评价指标，考察CoQ₁₀乳剂在高温条件下的稳定性。结果(见表3)显示3批制剂的含量和pH随时间延长呈下降趋势。

表 3 CoQ₁₀乳剂在40 ℃的稳定性试验结果

天数（t/d）外观含量（%）粒径（l/nm） pH

0 良好 100.4 243.2 5.82
5 良好 100.2 245.2 5.57
10 良好 99.5 245.0 5.21

下载: 导出CSV
| 显示表格

2.8   25 ℃加速试验

取3批CoQ₁₀乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（25±2） ℃、相对湿度60%的条件下避光放置6个月，分别于第0、1、2、3、6个月取样，观察制剂外观，测定含量、粒径和pH值。结果表明，CoQ₁₀乳剂在（25±2） ℃条件下避光放置6个月，各指标均在合格范围内，稳定性良好。

2.9   长期稳定性试验

取3批CoQ₁₀乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（5±3） ℃条件下避光放置12个月，分别于第0、3、6、9、12个月取样，观察制剂外观，测定含量、粒径和pH值。结果表明，CoQ₁₀乳剂在（5±3） ℃条件下避光放置12个月，各指标均在合格范围内，稳定性良好。

3.   讨论

3.1   冻融稳定性

乳剂冷冻期间冰晶的形成会破坏乳化膜，从而引发小油滴聚集成大油滴，甚至导致浮油、破乳。解决乳剂冻融问题的主要手段为油相和乳化剂的合理选择。其一是油相要有恰当的黏度，将LCT与MCT联合应用既能克服单独使用存在的问题，又可取长补短，有利于乳剂冻融稳定性的提高。其二，牢固的乳化膜可增强乳剂的冻融稳定性，有研究^[11]发现卵磷脂与含亲水链段的乳化剂组合对提高冻融稳定性有至关重要的作用。本实验CoQ₁₀乳剂处方组成中的GM1是一种内源性糖脂，具有生物可降解、无免疫原性等特点^[12]，近年来已有研究将GM1应用于乳剂、脂质体和胶束的制备^[12-14]。GM1是两亲性物质，可与卵磷脂形成复合乳化膜，增加膜的韧性。其结构中的较大亲水头基形成的空间立体位阻，及结构中唾液酸的荷负电对提高乳剂的冻融稳定性也至关重要。此外，在水相中加入含羟基的醇类或糖类（冻融保护剂），可以增加水相黏度，减慢冰晶的生长速度和程度，增强乳剂的冻融稳定性。

3.2   光照稳定性

CoQ₁₀的光解具有浓度依赖性，起始浓度高时光解速率相对较慢，但当制剂稀释倍数增加时，其透光性大大增加，光解反应加剧。对于微粒给药系统，粒径是一个重要参数，同时其光解具有一定的粒径依赖性。本研究所制备的乳剂属于高油量低磷脂含量，与普通乳剂相比粒径较大，因此光稳定性要更好。推测原因为光不容易穿透大粒径制剂的内部，降低了药物的曝光率；此外，粒径大时粒子的曲率较低，比表面积小，因此曝光机会少，越不易光解^[10]。本实验证明了将CoQ₁₀包封入乳剂中可减少其曝光机会，对药物能起到一定的保护作用。但CoQ₁₀乳剂仍需低温氮气环境下保存，使用过程中避光处理，以减少光解的概率。

图 1 供试品溶液的HPLC图

1.羟基-α-山椒素；2.羟基-β-山椒素

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 三菱HP-20型大孔树脂动态吸附泄漏曲线

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 不同上样条件对HAS、HBS总得率的影响

A.上样液浓度；B树脂柱径高比；C吸附流速^*P<0.05,^**P<0.01，与白色组比较。

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 正离子模式下花椒生物碱BPI图

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

下载: 导出CSV

表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）

树脂类型	HAS、HBS 总浓度（mg/ml）	HAS、HBS 总含量（%）	$ \bar{X} $±SD（%）
APS-17	2.42	4.06	4.06±2.17
NKA-9	2.08	3.50	3.50±1.76
宝恩HP-20	3.68	6.19	6.19±1.09
AB-8	3.58	6.02	6.02±1.28
HPD-400	3.59	6.03	6.03±0.98
三菱HP-20	4.10	6.89	6.89±0.62

下载: 导出CSV

表 3 除杂条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	除杂溶剂（A）	除杂体积（B）	除杂流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	7.87
2	1	2	2	9.09
3	1	3	3	9.31
4	2	1	2	10.33
5	2	2	3	10.42
6	2	3	1	10.67
7	3	1	3	11.82
8	3	2	1	10.73
9	3	3	2	11.66
k1	8.75	10.06	9.71	−
k2	10.44	10.07	10.34	−
k3	11.37	10.48	10.52	−
R	2.62	0.64	0.81	−

下载: 导出CSV

表 4 洗脱条件L₉（3³）正交设计及结果

编号	因素			总得率（%）
编号	洗脱溶剂（A）	洗脱体积（B）	洗脱流速（C）	总得率（%）
1	1	1	1	2.55
2	1	2	2	5.38
3	1	3	3	7.15
4	2	1	2	5.75
5	2	2	3	8.11
6	2	3	1	9.57
7	3	1	3	9.20
8	3	2	1	8.28
9	3	3	2	6.36
k1	5.03	5.83	6.80	−
k2	7.81	7.26	5.83	−
k3	7.95	7.69	8.15	−
R	2.92	1.86	2.32	−

下载: 导出CSV

表 5 最佳工艺验证结果

编号	得膏率（%）	富集前总含量（%）	富集后总含量（%）	富集后总含量RSD（%）
1	6.88	0.82	5.73	0.87
2	6.91	0.81	5.72	0.87
3	6.95	0.82	5.64	0.87

下载: 导出CSV

表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果

峰号	保留时间（t/min）	化合物	分子式	离子模式	理论值（m/z）	实测值（m/z）	误差（ppm）	碎片离子（m/z）	参考文献
1	4.716	木兰花碱	C₂₀H₂₄NO₄⁺	[M]⁺	342.170 5	342.169 0	−4.38	342.169 0[M]⁺, 297.110 6[M-C₂H₇N]⁺, 282.088 2[M-C₂H₇N-CH₃]⁺, 265.085 2[C₁₇H₁₃O₃]⁺, 222.065 3[C₁₅H₁₀O₂]⁺, 191.084 6[C₁₅H₁₁]⁺, 194.071 4[C₁₄H₁₀O]⁺, 165.069 3[C₁₃H₉]⁺	[17]
2	5.483	ZP-amide D	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
3	5.877	ZP-amide E	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	320.182 5[M+Na]⁺	[18]
4	6.043	ZP-amide A	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na]⁺, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
5	6.724	ZP-amide B	C₁₆H₂₅NO₄	[M+Na]⁺	318.168 1	318.168 5	1.26	613.338 5[2M+Na]⁺, 319.169 2[M+H+Na]⁺, 318.168 5[M+Na^]+, 296.183 8[M+H]⁺, 278.175 6[M-OH]⁺	[18-19]
6	6.793	ZP-amide C	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18, 20]
7	7.222	ZP-amide L	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
8	7.902	ZP-amide K	C₁₆H₂₇NO₄	[M+Na]⁺	320.183 8	320.182 5	−4.06	321.186 4[M+H+Na]⁺, 320.182 5[M+Na]⁺	[18]
9	12.427	ZP-amide N	C₁₈H₃₁NO₄	[M+Na]⁺	348.215 1	348.213 0	−6.03	349.217 7[M+H+Na]⁺, 348.213 0[M+Na]⁺	[18]
10	16.168	茵芋碱	C₁₄H₁₃NO₄	[M+H]⁺	260.092 3	260.092 3	0.00	229.037 0[M-2CH₃]⁺, 227.056 6[C₁₃H₉NO₃]+, 202.046 8[C₁₁H₈NO₃]⁺, 199.062 5[C₁₂H₉NO₂], 184.037 9[C₁₁H₆NO₂]⁺, 156.043 4[C₁₀H₆NO]⁺, 77.037 7[C₆H₅]⁺	[21]
11	22.312	羟基-ε-山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	302.171 4[M+K]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[22]
12^*	22.701	羟基-α− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.184 4[M-OH]⁺	[23]
13^*	23.113	羟基-β− 山椒素	C₁₆H₂₅NO₂	[M+Na]⁺	286.178 3	286.178 3	0.00	287.179 5[M+H+Na]⁺, 286.178 3[M+Na]⁺, 246.187 5[M-OH]⁺	[23]
14	23.605	Zanthoamides A	C₁₈H₂₇NO₄	[M-OH]⁺	304.191 3	304.191 3	0.00	345.184 4[M+H+Na]⁺, 344.181 6[M+Na]⁺	[24]
15	26.156	羟基-γ−山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
16	26.379	羟基-γ− 异山椒素	C₁₈H₂₇NO₂	[M+Na]⁺	312.193 9	312.193 5	−1.28	601.398 7[2M+Na]⁺, 313.164 8[M+H+Na]⁺, 312.193 5[M+Na]⁺, 272.200 9[M-OH]⁺	[22]
17	26.786	bungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
18	26.957	isobungeanool	C₁₈H₂₉NO₂	[M-OH]⁺	274.217 1	274.216 5	−2.19	565.363 6[2M-OH]⁺, 314.210 3[M+Na]⁺	[15]
19	27.586	α−山椒素	C₁₆H₂₅NO	[M+H]⁺	248.201 4	248.201 2	−0.81	286.178 3[M+K]⁺	[23]
20	29.068	四氢花椒素	C₁₈H₃₃NO₂	[M+H]⁺	296.259 0	296.257 7	−4.39	318.237 8[M+Na]⁺, 279.137 4[M+H-OH]⁺	[25]
^*：为与对照品比对的化合物。

下载: 导出CSV

[1]	国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部) 2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 169-171.
[2]	SHAN C, SHU C, NIE W, et al. RETRACTED ARTICLE: Anti-aging effect of polysaccharides from the peel of Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc. on the nematode Caenorhabditis elegans[J]. Acta Agric Scand Sect B, 2022, 72:476-484.
[3]	杨成峻, 陈明舜, 刘成梅, 等. 花椒果皮多酚类成分鉴定及降血糖活性[J]. 食品科学, 2023, 44(2):271-278.
[4]	LIANG W Y, YANG H Y, LEI H X, et al. Phytochemistry and health functions of Zanthoxylum bungeanum Maxim and Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc as pharma-foods: a systematic review[J]. Trends Food Sci Technol, 2024, 143:104225. doi: 10.1016/j.jpgs.2023.104225
[5]	ZHANG B C, LUO S H, WU S S, et al. Anti-inflammatory and anti-osteoclastogenesis activities of different kinds of Zanthoxylum bungeanum seed oil in vitro[J]. Chem Biodivers, 2023, 20(5):e202201157. doi: 10.1002/cbdv.202201157
[6]	叶倩女, 石晓峰, 杨军丽. 花椒属植物中酰胺类成分的结构与功能研究进展[J]. 中国中药杂志, 2023, 48(9):2406-2418.
[7]	吴蓉蓉, 田书璎, 陈勇, 等. 青花椒生物碱类化学成分及生物活性研究[J]. 中草药, 2019, 50(6):1305-1309.
[8]	孟亚琴, 王雅, 郭涛. 花椒生物碱活性成分研究现状[J]. 中国食品工业, 2022,(10):110-113.
[9]	PENG W, HE C X, LI R L, et al. Zanthoxylum bungeanum amides ameliorates nonalcoholic fatty liver via regulating gut microbiota and activating AMPK/Nrf2 signaling[J]. J Ethnopharmacol, 2024, 318(Pt A): 116848.
[10]	胡迎丽, 夏璐, 雷福厚. 大孔吸附树脂在天然产物的分离纯化中的应用进展[J]. 化工技术与开发, 2021, 50(11):29-34.
[11]	刘岩, 陈伟豪, 亢迪, 等. 大孔树脂分离富集生物碱类成分研究进展[J]. 中草药, 2020, 51(6):1650-1659.
[12]	骆党委, 叶静, 黄雅燕, 等. AB-8大孔吸附树脂精制芦柑皮总黄酮及黄酮类化合物的分离[J]. 食品科学, 2014, 35(6):30-35.
[13]	蔡淑慧, 丁梦磊, 甘逸夫, 等. 附子总生物碱纯化工艺优化[J]. 中成药, 2023, 45(9):3023-3028.
[14]	贾凯, 刘俊, 耿晓桐, 等. 细叶十大功劳叶中总生物碱大孔树脂纯化及抗氧化研究[J]. 广西植物, 2023, 43(1):183-189.
[15]	ZHANG L L, ZHAO L, WANG H Y, et al. The relationship between alkylamide compound content and pungency intensity of Zanthoxylum bungeanum based on sensory evaluation and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry(UPLC-MS/MS)analysis[J]. J Sci Food Agric, 2019, 99(4):1475-1483. doi: 10.1002/jsfa.9319
[16]	LIU Y, MENG X, SUN L, et al. Protective effects of hydroxy-α-sanshool from the pericarp of Zanthoxylum bungeanum Maxim. On D-galactose/AlCl₃-induced Alzheimer’s disease-like mice via Nrf2/HO-1 signaling pathways[J]. Eur J Pharmacol, 2022, 914:174691. doi: 10.1016/j.ejphar.2021.174691
[17]	HUANG A H, CHI Y G, LIU J W, et al. Profiling and pharmacokinetic studies of alkaloids in rats after oral administration of Zanthoxylum nitidum decoction by UPLC-Q-TOF-MS/MS and HPLC-MS/MS[J]. Molecules, 2019, 24(3):585. doi: 10.3390/molecules24030585
[18]	CHEN J H, ZHANG T, ZHANG Q B, et al. Isobutylhydroxyamides from Sichuan pepper and their protective activity on PC12 cells damaged by corticosterone[J]. J Agric Food Chem, 2018, 66(13):3408-3416. doi: 10.1021/acs.jafc.7b06057
[19]	HATANO T, INADA K, OGAWA T O, et al. Aliphatic acid amides of the fruits of Zanthoxylum piperitum[J]. Phytochemistry, 2004, 65(18):2599-2604. doi: 10.1016/j.phytochem.2004.08.018
[20]	WANG Y, LIAO Z B, CAO R, et al. Isolation, structural characterization and neurotrophic activity of alkylamides from Zanthoxylum bungeanum[J]. Nat Prod Commun, 2017, 12(7): 1934578X1701200.
[21]	HUANG A H, XU H, ZHAN R T, et al. Metabolic profile of skimmianine in rats determined by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J]. Molecules, 2017, 22(4):489. doi: 10.3390/molecules22040489
[22]	BADER M, STARK T D, DAWID C, et al. All-trans-configuration in Zanthoxylum alkylamides swaps the tingling with a numbing sensation and diminishes salivation[J]. J Agric Food Chem, 2014, 62(12):2479-2488. doi: 10.1021/jf500399w
[23]	LI W L, WU Y, LIU Y S, et al. Chemical profiles and screening of potential α-glucosidase inhibitors from Sichuan pepper using ultra-filtration combined with UHPLC-Q-TOF[J]. Ind Crops Prod, 2020, 143:111874. doi: 10.1016/j.indcrop.2019.111874
[24]	WANG Y, LI C H, LUO B, et al. Isobutylhydroxyamides from Zanthoxylum bungeanum and their suppression of NO production[J]. Molecules, 2016, 21(10):1416. doi: 10.3390/molecules21101416
[25]	XIONG Q B, SHI D W, YAMAMOTO H, et al. Alkylamides from pericarps of Zanthoxylum bungeanum[J]. Phytochemistry, 1997, 46(6):1123-1126. doi: 10.1016/S0031-9422(97)84398-1

[1]	赵全公, 王国坤, 徐志云. 虾青素通过激活Nrf2/HO-1通路抑制瓣膜间质细胞钙化 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412057
[2]	舒飞, 孙蕊, 宋凯, 张元林, 闫家铭, 舒丽芯. 粉-液双室袋产品的综合评价 . 药学实践与服务, 2025, 43(2): 92-96. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202312009
[3]	吴若南, 汤文敏, 高林, 吴岳林, 罗川, 缪震元. RRx-001衍生物的合成和抗肿瘤活性研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408053
[4]	肖农, 陆诗依, 唐文雅, 居敏俐, 徐刚锋, 杨明华. 中成药微生物计数法前处理的影响因素和优化方法 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403014
[5]	宋泽成, 马闪闪, 胡巧灵, 仲华, 王彦. 小檗碱与氟康唑合用抗氟康唑耐受白念珠菌的研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(2): 87-91. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202409047
[6]	李惠萍, 陈璐, 张琪金, 黄宝康. 紫苏叶挥发油成分的生物合成、含量测定及生物活性研究进展 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-6. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202412058
[7]	施乔, 韩贵焱, 张俊腾, 刘娜. 新型Hsp90抑制剂的设计合成及其抗真菌和抗肿瘤活性研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(3): 124-135. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202501019
[8]	吴海韵, 杨甜, 张弛, 梁文仪, 苏娟. 气相色谱-离子迁移谱技术在中药研究中的应用进展 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-6. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202409007
[9]	陶宫佳, 陈林林, 宋泽成, 刘梦肖, 王彦. 苦参碱及衍生物的抗炎作用及其机制研究进展 . 药学实践与服务, 2025, 43(4): 163-168, 194. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202406035
[10]	吴若南, 叶爽, 李墨晨轩, 缪震元, 罗川. 冬凌草甲素磺酰脲衍生物的设计与抗炎活性的研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202401048
[11]	夏哲炜, 曾垣烨, 朱海菲, 李育, 陈啸飞. 核磁共振磷谱法测定磷酸氢钙咀嚼片中药物含量 . 药学实践与服务, 2024, 42(9): 399-401, 406. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404063
[12]	戴菲菲, 傅翔, 陈琼年, 俞苏纯. 上海某二级医院革兰阴性菌流行特征的回顾性分析 . 药学实践与服务, 2024, 42(12): 528-532. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305005
[13]	徐飞, 刘盈, 殷佳, 诸国樑, 练鲁英. 上海某三级公立医院药品管理内部控制评价实践研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(12): 542-548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202402003
[14]	赖立勇, 夏天爽, 徐圣焱, 蒋益萍, 岳小强, 辛海量. 中药青蒿抗氧化活性的谱效关系研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(5): 203-210, 216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211012
[15]	景凯, 杨慈荣, 张圳, 臧艺蓓, 刘霞. 黄芪甲苷衍生物治疗慢性心力衰竭小鼠的药效评价及作用机制研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(5): 190-197. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310004
[16]	张广雨, 杜晶, 刘梦珍, 朱丹妮, 闫慧, 刘冲. 新斯的明与山莨菪碱联合应用对肺型氧中毒的保护作用及其机制的研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(10): 433-438, 444. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310049
[17]	凯丽比努尔·奥布力艾散, 李倩, 谢志, 贾文彦, 尹东锋. 星点设计-效应面法优化仑伐替尼混合胶束的制备工艺 . 药学实践与服务, 2024, 42(11): 495-502. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403019

点击查看大图

图(4) / 表(6)

计量

文章访问数: 7467
HTML全文浏览量: 703
PDF下载量: 16
被引次数: 0

全文HTML

花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛^[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性^[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果^[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。

大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛^[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS^E）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。

1. 材料

1.1. 样品

花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。

1.2. 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。

HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。

2. 方法

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。

取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。

对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

2.1.2. 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。

2.1.3. 线性关系

取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。

2.1.4. 精密度

取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。

2.1.5. 稳定性

取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。

2.1.6. 重复性

按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。

2.1.7. 加样回收率

精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。

2.2.2. 上样量

湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

在单因素实验的基础上，采用L9（3³）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。

表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表

条件	水平	因素
条件	水平	A因素溶剂	B因素体积（BV）	C因素流速（BV/h）
除杂	1	蒸馏水	1	2
	2	10%乙醇	2	3
	3	20%乙醇	3	5
洗脱	1	55%乙醇	3	2
	2	70%乙醇	5	3
	3	80%乙醇	8	5

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.3.2. 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY HSS T₃柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。

2.3.3. 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×10⁵ Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~1500。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]⁻）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]⁺）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。

MassLynx V4.1工作站使用MS^E模式采集质谱数据。

4. 讨论

实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。

HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注^[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MS^E得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。

本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MS^E对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。

参考文献 (25)

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

批次	粒径（l/nm）
批次	灭菌前	灭菌后	冻融1次	冻融2次	冻融3次
1	241.4	239.6	255.7	263.0	271.2
2	238.5	240.0	252.6	265.9	272.3
3	240.2	238.7	259.0	263.5	269.1

天数（t/d）	外观	含量（%）	粒径（l/nm）	pH
0	良好	100.4	243.2	5.82
5	良好	97.7	239.8	5.79
10	良好	93.6	241.4	5.70

留言板

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. 仪器与试剂

2. 方法与结果

2.1 CoQ10乳剂的制备

2.2 CoQ10乳剂HPLC方法的建立

2.2.1 色谱条件[10]

2.2.2 溶液的配制

2.2.3 专属性试验

2.2.4 线性关系考察

2.2.5 精密度试验

2.2.6 稳定性试验

2.2.7 重复性试验

2.2.8 回收率试验

2.3 CoQ10乳剂的质量评价

2.3.1 外观

2.3.2 物理化学性质

2.3.3 含量测定

2.3.4 包封率测定

2.4 灭菌和冻融稳定性

2.5 稀释稳定性

2.6 光降解试验

2.6.1 载体对光照稳定性的影响

2.6.2 稀释倍数对光照稳定性的影响

2.6.3 载药量对光照稳定性的影响

2.7 影响因素试验

2.7.1 光照稳定性

2.7.2 40 ℃高温稳定性

2.8 25 ℃加速试验

2.9 长期稳定性试验

3. 讨论

3.1 冻融稳定性

3.2 光照稳定性

计量

出版历程

花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066

1. 上海大学医学院, 上海 200444 2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介: 杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏 娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

English Abstract

Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China 2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

全文HTML

1.1. 样品

1.2. 仪器与试剂

2.1. 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立

2.1.1. 溶液的配制

2.1.2. 色谱条件

2.1.3. 线性关系

2.1.4. 精密度

2.1.5. 稳定性

2.1.6. 重复性

2.1.7. 加样回收率

2.2. 大孔树脂纯化富集工艺优化

2.2.1. 树脂类型

2.2.2. 上样量

2.2.3. 单因素实验考察上样条件

2.2.4. 正交试验考察除杂、洗脱条件

2.3. 花椒生物碱的化学成分分析

2.3.1. 样品制备

2.3.2. 色谱条件

2.3.3. 质谱条件

3.1. HPLC图与方法学实验结果

3.1.1. 花椒生物碱的HPLC图

3.1.2. 线性关系考察结果

3.1.3. 精密度实验结果

3.1.4. 稳定性实验结果

3.1.5. 重复性实验结果

3.1.6. 加样回收率实验结果

3.2. 大孔树脂纯化富集工艺

3.2.1. 树脂类型的确定

3.2.2. 上样量的确定

3.2.3. 上样条件的确定

3.2.4. 除杂、洗脱条件的确定

3.2.5. 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

2.1 CoQ₁₀乳剂的制备

2.2 CoQ₁₀乳剂HPLC方法的建立

2.2.1 色谱条件^[10]

2.3 CoQ₁₀乳剂的质量评价

1. 上海大学医学院, 上海 200444

2. 海军军医大学军事药学国家级实验教学示范中心, 上海 200433

作者简介:
杨贺英，硕士研究生，研究方向：中药活性成分，Email: yhy991231_zd@163.com

通讯作者: 苏　娟，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分，Email: juansu_2008@126.com

1. School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

2. National Demonstration Center for Experimental Military Pharmacy Education, Naval Medical University, Shanghai 200433, China