Analysis on flavonoid constituents of Pueraria lobata by UHPLC-Q-TOFMS
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摘要: 目的 通过超高效液相-单重四级杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOFMS)联用技术,对中药葛根的主要化学成分进行有效的鉴定。 方法 色谱分离采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),流动相组成分别为0.1%甲酸水溶液和乙腈,梯度洗脱,流速为0.4 ml/min;质谱定性采用飞行时间质谱,正离子模式扫描。 结果 在优化的液质联用条件下,通过单重四级杆-飞行时间质谱鉴定出葛根中18个成分。 结论 通过UHPLC-Q-TOFMS联用技术,为鉴定葛根中的化学成分建立起了一种快速、高效的分析方法。
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关键词:
- 葛根 /
- 超高效液相-单重四级杆-飞行时间质谱 /
- 化学成分
Abstract: Objective To analyze chemical constituents of Pueraria lobata by ultrahigh pressure liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOFMS). Methods A ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column was used to separate. The mobile phase consisted of water containing 0.1% methane acid and acetonitrile was used as gradient elute. The flow rate was 0.4 ml/min. TOFMS was applied for qualitative analysis under positive ion mode. Results Under optimized condition, 19 major constituents in Gardenia jasminoides Ellis were identified by quadrupole-time of flight mass spectrometry and structure-relevant fragment ions. Conclusion A simple and reliable method using UHPLC-Q-TOFMS was established to identify the chemical constituents of Pueraria lobata.-
Key words:
- Pueraria lobata /
- UHPLC-Q-TOFMS /
- chemical constituents
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鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌。鲍曼不动杆菌主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。 鲍曼不动杆菌在医院的环境中分布广泛且可长期存活，严重威胁着患者的生命安全，故也将此类感染称做ICU获得性感染[1]。由于种种原因，近年来鲍曼不动杆菌的感染率逐年增加，且其耐药性日益严重，已引起临床医生和微生物学者的广泛关注。目前鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的情势日益严峻，最近又出现“全耐药”的鲍曼不动杆菌，其在中国台湾以及内地均有发现，引起了高度警惕。多粘菌素是一种非核糖体类抗生素，主要通过破坏细胞膜的完整性起到快速杀菌作用，曾被临床广泛应用于抗革兰阴性菌治疗，后因其抗菌谱窄，毒副作用明显而逐渐被替代[2]。但随着全球范围内多重耐药革兰阴性菌感染率不断增高，多粘菌素作为治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线而再次受到重视。《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》[3]、《广泛耐药革兰阴性菌感染的中国专家共识》均推荐以多粘菌素为基础的联合治疗方案作为治疗选择之一。目前临床使用的多粘菌素有两种：多粘菌素B和多黏菌素E[4]。其中多黏菌素E分多黏菌素E甲磺酸钠和硫酸黏菌素。与多黏菌素E甲磺酸钠不同的是，硫酸黏菌素无需体内转化，有较为直接的抗菌活性[5]。但在2019年后才在中国上市，临床资料及临床治疗经验相对缺乏，没有太多的相关研究[3]。因此本研究主要对硫酸黏菌素对鲍曼不动杆菌感染患者的有效性进行考察与探究。
1. 资料与方法
1.1 病例及分组
本试验回顾性共纳入216例泛耐药鲍曼不动杆菌肺炎感染患者，其纳入患者均符合Ab感染相关诊断标准，且均经痰培养病原学证实确诊并接受过有创机械通气治疗。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）经痰培养确定为泛耐药鲍曼不动杆菌感染，并符合《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》的诊断标准；（3）入院接受治疗时间>3天并经接受过有创机械通气治疗。排除以下人群：体重<40 kg或>150 kg；免疫功能低下的患者，如血液肿瘤、实体器官移植或导致显著免疫缺陷的先天性或获得性疾病；囊性纤维化、HIV/AIDS、或已知或疑似活动性结核病。
1.2 治疗方法
试验组给予硫酸黏菌素（锋卫灵），50IU+100ml 0.9%NS ivgtt q8h；对照组给予替加环素（海正利星），起始负荷剂量首剂加倍：100mg+100ml 0.9%NS ivgtt；维持剂量，50mg+100ml 0.9%NS ivgtt q12h；两组均同时联用头孢哌酮舒巴坦（舒普深），3g+100ml 0.9%NS ivgtt q8h。
1.3 疗效评价标准
通过观察以下指标如临床症状（意识水平、通气频率、收缩压、体温、脉搏、咳嗽、咳痰量、咳痰性状、通气障碍、发绀、胸水）、实验室检查（动脉血氧分压、尿素氮、c-反应蛋白、降钙素原、白细胞数）、影像学（胸部X线或CT）和微生物检查，我们分别在给药第4天（早期评估）、出院（治疗结束）时对患者进行了评估，主要观察结局指标：患者出院（治疗结束）时的临床疗效、28天死亡率；次要结局指标：给药第四天（早期评估）临床疗效、细菌清除率（治疗结束时）。
疗效评价标准参照《新型抗菌药物治疗呼吸道感染临床评价方法（第二版）》[6]。将疗效评价分为“有效”和“无效”。①有效：必须符合肺炎症状消失/好转（发热以及其他1项以上的症状得到改善），其次符合胸部影像或者炎症的症状消失/改善（与开始用药前相比，CRP/PCT和胸部CT鉴定不恶化，临床症状及体温的情况有改善）。②无效:药物后临床诊断病症、体征无明显好转/或变化，或其炎症指标、胸部影像无明显改善。
1.4 统计学处理
使用SPSS 22.0对数据进行分类。计量资以x±s表示,采用统计中的t检验；计数资料用数量和百分数来表示，采用χ2检验；有序分类采用秩和检验。P<0.05表示结果差异的统计学意义。
2. 结果
2.1 基线特征
倾向性匹配将216例患者分为试验组、对照组，两组患者在性别、年龄、合并疾病均无统计学差异（P>0.05）,具有可比性，具体见表1。
表 1 试验组和对照组的基线特征项目 试验组（n=71, %） 对照组（n=145, %） P 男性/女性（n） 37/34 95/50 0.058 年龄（岁） 71.48±18.86 72.54±14.78 0.677 查尔森合并症指数 低危 7（9.8） 14（9.7） 0.962 中危 31（43.7） 73（50.3） 0.356 高危 33（46.5） 58（40.0） 0.365 注：查尔森合并症指数0分为低危、1-2分为中危、>2分为高危。 2.2 临床有效率比较
2.2.1 主要结局指标
治疗结束时试验组的临床有效率为74.6%，高于对照组的61.4%，但两组的临床有效率的结果无统计学意义（P>0.05）。次要结局指标：早期评估时临床试验组临床有效率为77.5%，高于对照组的55.9%，两组的临床有效率有统计学意义（P<0.05），具体见表2。
表 2 试验组和对照组临床有效率比较时间 分组 有效（n, %） 无效（n, %） P 早期评估（给药第4天） 试验组（n=71） 55（77.5） 16（22.5） 0.002 对照组（n=145） 81（55.9） 64（44.1） 治疗结束 试验组（n=71） 53（74.6） 18（25.4） 0.054 对照组（n=145） 89（61.4） 56（38.6） 2.2.2 亚组分析
在早期评估中低危组亚组中，试验组临床有效率为78.6%，高于对照组的56%；高危组亚组中，试验组临床有效率为76.7%，高于对照组的55.8%。两组在临床有效率的结果有统计学意义（P<0.05），具体见表3。
表 3 试验组和对照组根据肺炎严重指数评分PSI分组临床有效率比较时间 肺炎严重指数
评分（PSI）分组分组 有效
（n, %）无效
（n, %）P 早期评估
（给药第4天）中低危组 试验组（n=28） 22（78,6） 6（21.4） 0.046 对照组（n=50） 28（56） 22（34） 高危组 试验组（n=43） 33（76.7） 10（23.3） 0.019 对照组（n=95） 53（55.8） 42（44.2） 2.3 细菌学清除率比较
试验组细菌清除率[81.7%（58/71）]高于对照组[62.1%（90/145）]，差异有统计学意义（P<0.05）。
试验组和对照组的细菌给清除率（81.7%比62.1%），试验组高于对照组，两组比较结果有统计学意义（P<0.05），具体见表4。
表 4 试验组和对照组细菌清除率比较治疗例数 清除（n, %） 未清除（n, %） P 试验组n=71 58（81.7） 13（18.3） 0.004 对照组n=145 90（62.1） 55（37.9） 2.4 28天死亡率
实验组 28 d 死亡率[16.9%（12/71）]高于对照组 的28 d 死亡率[15.9%（23/145）]，差异无统计学意义（P>0.05）。
试验组和对照组的28天死亡率（16.9%比15.9%），试验组高于对照组，两组比较结果无统计学意义（P>0.05），具体见表5。
表 5 试验组和对照组28天死亡率的比较治疗例数 死亡（n, %） 未死亡（n, %） P 试验组（n=71） 12（16.9） 59（83.1） 0.846 对照组（n=145） 23（15.9） 122（84.1） 3. 讨论
多重耐药菌感染已成为严重威胁公共卫生健康的问题，院内感染患者的多重耐药菌分离率呈现逐年上升趋势。临床上多重耐药菌感染多发生于基础疾病多、合并肝肾功能损害、处于ICU 特殊病理生理状态下的重症患者，因可供选择的抗生素种类少，故合理选择对多重耐药菌有效的抗生素至关重要[7]。多个体外研究和动物模型证明，多黏菌素类联合碳青霉烯类、糖肽类、四环素类、利福平等抗菌药物对于耐药鲍曼不动杆菌具有协同杀菌作用。大多数鲍曼不动杆菌对多黏菌素敏感，对于多黏菌素耐药菌株，在多黏菌素基础上联合应用其他类别的抗菌药物同样具有协同作用[8-9]。
一些回顾性研究表明[10]，黏菌素类或联合舒巴坦的临床治疗效果无显著差异，也有一些研究认为黏菌素单药治疗鲍曼不动杆菌肺炎感染临床疗效要更好，目前仍存在争议。而替加环素与头孢哌酮舒巴坦目前做为临床最常用的联合方案也显示出了较好的临床治疗效果[11-12]，但随其频繁的抗菌药物暴露，部分也开始出现药敏提示中介或者耐药的情况出现，临床急需有更多的治疗选择。以往研究资料都是基于多黏菌素B或者多黏菌素E甲磺酸钠，而目前很少有关于研究硫酸黏菌素联合用药与替加环素联合用药相比较临床疗效的研究。在此次研究中发现，硫酸黏菌素联合头孢哌酮舒巴坦得到了较好的临床疗效，与替加环素联合头孢哌酮舒巴坦组相比疗效相当，尤其在早期评估的疗效更为显著，总体的细菌清除率更高。硫酸黏菌素对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌具有强大的抗菌活性，可快速的降低患者的细菌载量，因此早期评估的疗效更为显著、总体细菌清除率高跟其有一定的相关性。但其产生的毒素或者裂解产物对人体造成的影响需要对症综合治疗，且多重耐药菌难以清除，重症监护室患者基础疾病较多，感染病情可能反复，因此在最终的临床效果上硫酸黏菌素联合头孢哌酮舒巴坦与替加环素联合组疗效相当。目前的多数治疗方案仍以联合为主，也要警惕多黏菌素的异质性耐药现象，可能对观察性药物的治疗效用可能产生影响，还需更多的高质量研究。由于回顾性数据的缘由，本研究并未重点考虑安全性相关的研究，在收集过程中并未发现严重的不良反应，如严重的急性肾损伤，肝功能异常等。
综上，本研究提示与替加环素联合头孢哌酮舒巴坦治疗相比，硫酸黏菌素联合头孢哌酮舒巴坦治疗泛耐药的鲍曼不动杆菌引起的肺炎疗效相当，并且在早期评估及细菌清除率上效果更为显著，是较好的一种临床治疗方案，为临床提供用药参考。
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[1] 柳 航, 李占林, 郭 婕, 等.葛根的化学成分[J].沈阳药科大学学报,2009, 26:882. [2] Du G, Zhao HY, Zhang QW, et al, A rapid method for simultaneous determination of 14 phenolic compounds in Radix Puerariae using microwave-assisted extraction and ultra high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and time-of-flight mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2010, 1217:705. [3] 石立秋.葛根的化学成分及药理活性[J].中华临床医学研究杂志, 2003,70:11678. [4] 董 英, 徐 斌, 林 琳, 等. 葛根的化学成分研究[J]. 食品与机械, 2005,21(6):85. [5] 杨东晖, 陈 浪, 曾 志, 等.葛根化学成分的研究[J]. 华南师范大学学报, 2002,94:94. [6] 田宏哲, 王 华, 关亚风.液质联用分析葛根提取物及中药片剂中异黄酮类化合物[J]. 色谱, 2005, 23(5):477. [7] Lin CC, Wu CI, Shen SJ, Determination of 12 pueraria components by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Sep Sci, 2005, 28:1785. -
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