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UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究

陈炳辰 佟达丰 万苗 闫飞虎 姚建忠

汪麟, 方煜, 余文武, 洪泽. 4种黄山菊花品种的抗氧化和抗炎活性研究[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(5): 325-328. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211024
引用本文: 陈炳辰, 佟达丰, 万苗, 闫飞虎, 姚建忠. UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(8): 341-345. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
WANG Lin, FANG Yu, YU Wenwu, HONG Ze. Antioxidant and anti-inflammatory activities of four kinds of Huangshan chrysanthemum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(5): 325-328. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211024
Citation: CHEN Bingchen, TONG Dafeng, WAN Miao, YAN Feihu, YAO Jianzhong. Determination and pharmacokinetics investigation of prodrugs of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(8): 341-345. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082

UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
基金项目: 上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项(20224Y0075);海军军医大学“启航计划”(海医政202128号)
详细信息
    作者简介:

    陈炳辰,硕士,住院医师,研究方向:临床肿瘤治疗,Email:cbc_kjsmmu@163.com

    通讯作者: 闫飞虎,博士,副主任医师,副教授,研究方向:结、直肠癌微创外科治疗和结肠镜诊疗,Email:feihu_1989@163.com姚建忠,教授,博士生导师,研究方向:抗肿瘤和抗真菌药物研究,Email:yaojz6601@sina.com
  • 中图分类号: R917

Determination and pharmacokinetics investigation of prodrugs of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma by UPLC-MS/MS

  • 摘要:   目的  建立小鼠血浆中紫杉醇肉豆蔻酸酯(PTX-MA)、紫杉醇棕榈酸酯(PTX-PA)和紫杉醇硬脂酸酯(PTX-SA)等3种紫杉醇脂肪酸酯的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定方法,并初步考察其脂质体的小鼠体内药代动力学特性。  方法  采用Eclipse Plus C8色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),0.2%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)的不同比例混合液为流动相,梯度洗脱,三重四极杆串联质谱多重反应监检测(MRM),流速:0.3 ml/min,柱温:30℃,进样量:10 μl。  结果  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在5.0~500.0 ng/ml范围内均呈良好的线性关系(r >0.995 0),日内和日间精密度、稳定性、提取回收率和基质效应试验结果的RSD均小于10%;3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的半衰期(t1/2)分别为14.78、44.49和69.32 h,清除率(CL)分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h。  结论  该方法专属性高、灵敏、操作简便、稳定性好,可用于小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯的含量测定。小鼠体内药代动力学研究结果表明,随脂肪酸碳链增加,紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内t1/2呈大幅延长,清除率则显著降低,提示紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可改变其体内药代动力学特性,从而为紫杉醇脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。
  • 菊花为菊科植物菊花的干燥头状花序,是一种常见的药食两用的花卉,具有清热、明目、疏风、解毒之功效[1-2]。根据经典的记载,中国栽培菊花历史已有3000多年。汉朝《神农本草经》记载:“菊花久服能轻身延年”。现代药理学研究表明,菊花具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎以及保肝等作用[3-12],因此,常作为保健饮品服用。安徽黄山是菊花的重要产地,拥有黄山金丝皇菊、黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊等多个品种,其中皇菊的黄酮含量极高,富含多种氨基酸、维生素和微量硒元素,具有重要的药用价值;而道地黄山贡菊更是菊花中的上等品,“白边黄芯绿屁股”,处于四大药菊之首。本研究主要对以上四种菊化品种进行研究,对比其抗氧化及抗炎活性,为菊花抗氧化和抗炎品种的开发提供参考和借鉴。

    4种菊花(黄山金丝皇菊、黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊)来源于黄山市产品质量检验研究院;总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)、总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼试剂盒(DPPH法)购自Solarbio;双报告基因检测试剂盒购自Promega;LPS购自美国Sigma公司;SD大鼠,雄性,体重180~220g,购自上海斯莱克实验动物中心。

    4种不同菊花经粉碎机粉碎并过60目筛,各取100 g,加入1000 ml去离子水浸泡12 h,然后加热回流提取2 h,过滤去除滤渣,滤液用旋转蒸发仪(60 ℃)蒸发去除溶剂,然后经真空干燥彻底去除水分[13]。由于4种菊花水提物得率基本一致(约17%),因此后续用相同质量的水提物表征同等质量的菊花。

    将等体积的ABTS溶液和氧化剂溶液混合配置成ABTS工作母液,室温避光存放24 h。使用前,把ABTS工作液用PBS稀释30~50倍,要求ABTS工作液的吸光度减去相应的PBS空白对照后,A734为0.7±0.05,对应的A405在1.4左右。称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。同时,用蒸馏水将10 mmol/L Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入200 μl ABTS工作液,空白对照孔中加入10 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入10 μl各浓度Trolox标准溶液;样品检测孔中加入10 μl样品溶液,轻轻混匀。室温孵育2~6 min后测定A734。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]

    将TPTZ稀释液与TPTZ溶液充分混匀再加入检测缓冲液,从而配制成FRAP工作液。称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。称取27.8 mg本试剂盒提供的 FeSO4•7H2O,溶解并定容到1 ml,此时浓度即为100 mmol/L。取适量100 mmol/L FeSO4溶液用蒸馏水稀释至0.15、0.3、 0.6、 0.9、 1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入180 μl FRAP工作液,空白对照孔中加入5 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入5 μl各浓度FeSO4标准溶液;样品检测孔中加入5 μl样品溶液,轻轻混匀。室温孵育2~6 min后测定A593。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]

    称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。同时,用蒸馏水将10 mmol/L Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入190 μl DPPH工作液,空白对照孔中加入10 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入10 μl各浓度Trolox标准溶液;样品检测孔中加入10 μl样品溶液,混匀后室温避光静置30 min,测定A515。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]

    Raw264.7细胞以适当密度接种于96孔板,实验分别设置空白组、LPS刺激组和不同药物浓度处理组,每组分别设置3个复孔。细胞过夜贴壁,利用转染试剂共转染报告基因质粒pNF-κB-Luc 和pRL-SV40,转染6 h后换液。转染24 h后加药,药物孵育2 h后加入LPS(终浓度1 μg/ml)刺激6 h,双报告基因法检测NF-κB转录活性。

    取SD大鼠48只,随机分为6组,分别为空白组、模型组、菊花水提物给药组(2 g/ kg,相当于菊花11.76 g/kg)。各组大鼠连续灌胃给药3 d,模型组给予相同体积的生理盐水,第4天于每只大鼠右后足垫皮下注射1.0%角叉菜胶100 μl,致炎后灌胃给予相应药物,分别在致炎前和致炎后1、2、4 h,测量大鼠致炎侧足容积,计算足趾肿胀率和肿胀抑制率[15-16]。按下式计算小鼠足趾肿胀率和抑制率:肿胀率=(致炎后足趾体积-致炎前足趾体积)/致炎前足趾体积×100%, 抑制率= (模型组足趾肿胀率-给药组足趾肿胀率)/模型组足趾肿胀率×100%。

    数据以($\bar x $±s)表示,单因素方差分析(One way ANOVA)比较各组差异,以P<0.05为差异具有统计学意义。

    ABTS、FRAP和DPPH线性方程以及相关系数见表1

    表  1  ABTS、FRAP、DPPH的线性方程及相关系数
    项目方程相关系数
    ABTSY=0.662 4X+0.715 3r=0.999 5
    FRAPY=0.298 5X+0.060 r=0.999 4
    DPPHY=0.459 8X−0.023 8r=0.998 9
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    表1可以看出,ABTS、FRAP以及DPPH测定方法具有很好的线性。

    ABTS法检测菊花水提物总抗氧化能力,结果显示,4种菊花的抗氧化能力存在明显差异,其中,黄山金丝皇菊抗氧化能力最强,为(0.481±0.052) mmol/g(总抗氧化能力用TEAC标准溶液表示),其次是黄山皇菊,为(0.402±0.043) mmol/g,然后依次是黄山贡菊(0.369±0.031)mmol/g和黄山黄菊(0.287±0.014)mmol/g。FRAP和DPPH检测以上四种菊花水提物抗氧化能力,结果与ABTS法类似,黄山金丝皇菊抗氧化能力最强,其次依次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。综上,可以得出结论:黄山金丝皇菊水提物抗氧化能力最强,其次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊(表2)。

    表  2  4种菊花抗氧化能力
    名称/抗氧化
    能力
    FRAP(mmol FeSO4/g)ABTS(mmol Trolox/g)DPPH(mmol Trolox/g)
    黄山金丝皇菊0.504±0.0490.481±0.0520.359±0.025
    黄山皇菊 0.421±0.0360.402±0.0430.305±0.033
    黄山贡菊0.347±0.028##0.369±0.0310.277±0.041#
    黄山黄菊0.270±0.017###,**0.287±0.014##0.208±0.019##,*
    *P<0.05,**P<0.01,与黄山皇菊比较;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,与黄山金丝皇菊比较。
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    利用双报告基因的方法检测4种菊花水提物对Raw264.7细胞 NF-κB转录活性的影响,结果显示4种菊花水提物均能够一定程度的抑制LPS诱导的NF-κB的转录活性。相同作用浓度下,黄山皇菊NF-κB抑制活性最强,其次依次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。结果表明黄山皇菊抗炎作用最强,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊(图1)。

    图  1  4种菊花水提物对LPS诱导的NF-κB转录活性的影响
    *P<0.05,**P<0.01,与黄山贡菊相同剂量组比较;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,与LPS单独刺激组比较;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001,与黄山黄菊相同剂量组比较。

    为了进一步确认4种菊花提取物的抗炎活性,我们构建了角叉菜胶致大鼠足肿胀模型。大鼠足趾肿胀率和肿胀抑制率如表3所示,1 h时间点,给予菊花水提物处理的各组大鼠足趾肿胀均低于模型对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 h时间点,黄山皇菊和黄山金丝皇菊对足趾肿胀仍然具有抑制作用,而黄山贡菊和黄山黄菊抑制作用消失; 组间比较,黄山皇菊足趾肿胀抑制作用优于黄山贡菊和黄山黄菊(P<0.05)。4 h时间点,各组对足趾肿胀的抑制作用消失。综上结果表明,黄山皇菊的抗炎活性最好,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊,该结论与NF-κB报告基因结果一致。

    表  3  角叉菜胶致大鼠急性炎症模型结果(x±sn=8)
    组别1 h2 h4 h
    肿胀率(%)抑制率(%)肿胀率(%)抑制率(%)肿胀率(%)抑制率(%)
    模型组41.6±
    4.5
    52.5±
    10.7
    45.1±
    8.2
    黄山金丝皇菊31.5±
    5.9#
    24.342.3±
    7.1#
    19.544.9±
    8.8
    0.5
    黄山皇菊28.9±
    5.9##
    30.638.9±
    7.8#,*,ΔΔ
    26.046.4±
    10.0
    −2.8
    黄山贡菊31.8±
    6.3#
    23.750.0±
    11.7
    4.846.4±
    8.3
    −2.8
    黄山黄菊33.3±
    6.2#
    20.151.0±
    7.3
    2.944.9±
    8.8
    0.6
    *P<0.05,与黄山贡菊比较;#P<0.05,##P<0.01,与模型组比较;ΔΔP<0.01,与黄山黄菊比较。
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    本研究采用ABTS、FRAP和DPPH 这3种方法测定了4种黄山菊花水提物的抗氧化活性,并通过报告基因法和大鼠足肿胀模型评估了其抗炎活性。结果表明,4种菊花表现出不同的抗氧化活性和抗炎活性,其中黄山金丝皇菊的抗氧化能力最强,其次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊;而黄山皇菊的抗炎活性最强,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。菊花中黄酮类化合物具有清除自由基和超氧阴离子的能力,其抗氧化能力与黄酮类化合物含量有关;而菊花中的抗炎成分相对复杂,包含多糖、黄酮类化合物(如木犀草素、槲皮素及黄芩苷等)、有机酸(如绿原酸)和挥发油等,4种不同菊花在抗炎及抗氧化方面的活性差异可能与上述成分的差异有关[2,17-18]。尽管不同菊花品种在抗氧化和抗炎活性方面存在差异,但是均表现出良好的药用及食用价值,人们在日常生活中可以根据使用目的的不同进行选择,如考虑通过饮用菊花茶起到抗氧化目的,可以优先选用金丝皇菊,而如果考虑菊花抗炎作用,则可以考虑黄山皇菊。综之,4种黄山道地菊花提取物均表现出一定的抗氧化活性及抗炎活性,常饮之有保健功效。

  • 图  1  空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图

    A.空白血浆;B.内标;C. PTX-MA;D. PTX-PA;E. PTX-SA

    表  1  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数

    对照样品 回归方程 r 线性范围(ng/ml)
    PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00
    PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00
    PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00
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    表  2  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度(n = 5)

    对照样品 理论浓度(ng/ml) 日内精密度 日间精密度
    实测浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%) 实测浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%)
    PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84
    250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14
    375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66
    PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38
    250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32
    375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11
    PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50
    250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05
    375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65
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    表  3  小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应(n = 3)

    对照样品 理论浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%)a 基质效应(%) RSD(%)b
    PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87
    250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73
    375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48
    PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08
    250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89
    375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69
    PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30
    250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25
    375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02
    注:a:回收率的相对标准偏差;b:基质效应的相对标准偏差。
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    表  4  小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数(n = 3)

    关键参数单位PTX-MA-LPTX-PA-LPTX-SA-L
    Cmaxng/L226 436.10±4 932.89289 171.80±5 311.62333 508.00±3 464.10
    AUC0-14 dng·h/L502 384.75±3 464.10776 973.44±5 196.151 668 984.05±6 350.85
    AUC0-∞ng·h/L503 800.86±8 082.90777 835.54±6 429.101 669 696.54±5 773.50
    t1/2h14.78±2.0044.49±3.5169.32±2.15
    VL/kg45.68±1.0062.57±1.5368.58±3.10
    CLL·kg/h29.06±2.5224.94±2.0813.74±2.52
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-04-23
  • 修回日期:  2024-06-18
  • 网络出版日期:  2024-08-22
  • 刊出日期:  2024-08-25

UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
    基金项目:  上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项(20224Y0075);海军军医大学“启航计划”(海医政202128号)
    作者简介:

    陈炳辰,硕士,住院医师,研究方向:临床肿瘤治疗,Email:cbc_kjsmmu@163.com

    通讯作者: 闫飞虎,博士,副主任医师,副教授,研究方向:结、直肠癌微创外科治疗和结肠镜诊疗,Email:feihu_1989@163.com姚建忠,教授,博士生导师,研究方向:抗肿瘤和抗真菌药物研究,Email:yaojz6601@sina.com
  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  建立小鼠血浆中紫杉醇肉豆蔻酸酯(PTX-MA)、紫杉醇棕榈酸酯(PTX-PA)和紫杉醇硬脂酸酯(PTX-SA)等3种紫杉醇脂肪酸酯的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定方法,并初步考察其脂质体的小鼠体内药代动力学特性。  方法  采用Eclipse Plus C8色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),0.2%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)的不同比例混合液为流动相,梯度洗脱,三重四极杆串联质谱多重反应监检测(MRM),流速:0.3 ml/min,柱温:30℃,进样量:10 μl。  结果  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在5.0~500.0 ng/ml范围内均呈良好的线性关系(r >0.995 0),日内和日间精密度、稳定性、提取回收率和基质效应试验结果的RSD均小于10%;3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的半衰期(t1/2)分别为14.78、44.49和69.32 h,清除率(CL)分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h。  结论  该方法专属性高、灵敏、操作简便、稳定性好,可用于小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯的含量测定。小鼠体内药代动力学研究结果表明,随脂肪酸碳链增加,紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内t1/2呈大幅延长,清除率则显著降低,提示紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可改变其体内药代动力学特性,从而为紫杉醇脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。

English Abstract

汪麟, 方煜, 余文武, 洪泽. 4种黄山菊花品种的抗氧化和抗炎活性研究[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(5): 325-328. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211024
引用本文: 陈炳辰, 佟达丰, 万苗, 闫飞虎, 姚建忠. UPLC-MS/MS法测定小鼠血浆中紫杉醇脂肪酸酯前药及其药代动力学研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(8): 341-345. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
WANG Lin, FANG Yu, YU Wenwu, HONG Ze. Antioxidant and anti-inflammatory activities of four kinds of Huangshan chrysanthemum[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(5): 325-328. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211024
Citation: CHEN Bingchen, TONG Dafeng, WAN Miao, YAN Feihu, YAO Jianzhong. Determination and pharmacokinetics investigation of prodrugs of paclitaxel fatty acid esters in mouse plasma by UPLC-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(8): 341-345. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404082
  • 紫杉醇(PTX)是从裸子植物红豆杉树皮分离得到的天然次生代谢产物,属于微管蛋白抑制剂,在临床上广泛用于卵巢癌、非小细胞肺癌和乳腺癌的治疗[1]。传统的PTX注射液因添加了聚氧乙烯蓖麻油而导致过敏反应,并加重PTX的外周神经毒性,还影响药物分子向组织间扩散,影响抗肿瘤效应,且滴注时间过长[2]。前药设计在提高药物生物利用度,增加药物稳定性,减小毒副作用,延长药物作用时间等方面具有很大的优势[3]。其中,长链饱和脂肪酸如肉豆蔻酸(MA)[4]、棕榈酸(PA)[5]和硬脂酸(SA)[6]等常用于药物成酯前药修饰。例如,治疗类风湿性关节炎的上市药物地塞米松棕榈酸酯注射液,就是通过饱和脂肪酸棕榈酸与地塞米松成酯反应形成地塞米松棕榈酸酯前药,继而制备成纳米前药,极大地增加了制剂的稳定性与成药性[6]

    脂质体作为载体递送脂溶性药物近年来受到广泛关注,这为PTX脂质体制剂的研发提供了重要依据。据此,我们对PTX的C2′羟基进行酯化修饰形成脂溶性较强的PTX肉豆蔻酸酯(PTX-MA)、PTX棕榈酸酯(PTX-PA)和PTX硬脂酸酯(PTX-SA)等前药分子,然后将其分别制备成PTX-MA脂质体(PTX-MA-L)、PTX-PA脂质体(PTX-PA-L)和PTX-SA脂质体(PTX-SA-L),不仅可以解决PTX成药性差的问题,也可以提高载药量、增加药物稳定性、改善药代动力学和药效学[7-10]

    该研究以卡马西平为内标,成功建立了小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定方法,在此基础上比较考察了其脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的药代动力学特性,从而为PTX脂肪酸酯前药的纳米制剂研发提供科学依据。

    • Vanquish™ 超高相液相色谱仪(美国Thermo scientific公司);TSQ Altis™ 三重四级杆质谱仪(美国Thermo scientific公司);台式高速冷冻离心机(上海伟进生物科技有限公司)。

    • 紫杉醇(纯度≥98%)购自江苏红豆杉生物医药科技股份有限公司;紫杉醇肉豆蔻酸酯(PTX-MA,纯度≥98%)及其脂质体(PTX-MA-L)、紫杉醇棕榈酸酯(PTX-PA,纯度≥98%)及其脂质体(PTX-PA-L)、紫杉醇硬脂酸酯(PTX-SA,纯度≥98%)及其脂质体(PTX-SA-L)均为海军军医大学药学系药剂学教研室自制;甲酸、超纯水、甲醇和乙腈购自赛默飞世尔(中国)有限公司,均为色谱纯;卡马西平购自上海源叶生物科技有限公司。

    • ICR小鼠[雌性,(18±2) g,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(浙)2020-0002]。

    • 色谱柱:Eclipse Plus C8色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);流动相:0.2%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脱;梯度洗脱程序:20% B~ 60% B(0~0.3 min),60% B~ 98% B(0.3~ 3.9 min),98% B~ 60% B(3.9~ 4.8 min),60% B~ 20% B(4.8~ 5.2 min),20% B(5.2~ 7.0 min);流速:0.3 ml/min;进样量:10 µl;柱温:30 ℃。

    • 电喷雾离子源(ESI)采用正离子采集模式。离子源参数:电喷雾电压:3.5 kV(+);离子传输管温度:325 ℃;雾化温度:275 ℃;鞘气压力:35 Arb;辅气压力:5 Arb;毛细管压力:1.5 mTorr。定量分析离子分别为:m/z 1086.7→518.3(PTX-MA),m/z1114.5→546.3(PTX-PA),m/z 1142.7→574.4(PTX-SA),m/z 237.1→194.0(卡马西平,内标)。

    • 分别精密称取10.00 mg 3种对照品(PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA)置于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成1.00 mg/ml的对照品储备液。吸取一定量的对照品储备液,用甲醇稀释成一系列浓度的工作溶液,置于4 ℃冰箱保存备用。

    • 精密称取10.00 mg卡马西平,用乙腈溶解并定容,配制成1.00 mg/ml的内标储备液。吸取一定量的内标储备液,用乙腈稀释成30.00 ng/ml工作溶液,置于4℃冰箱保存备用。

    • 精密量取100 μl小鼠血浆样品液于1.5 ml离心管中,加入300 µl内标溶液,涡旋混合1 min后,13 000 r/min离心10 min,吸取上清液,置于新的EP管中,于40 ℃下真空离心挥干溶剂。精密量取200 µl乙腈复溶样品,过0.22 μm尼龙滤膜,即制得小鼠血浆样品溶液。

    • 精密量取100 µl空白血浆,用300 µl乙腈代替300 µl内标液,按“2.3”项下方法处理后,再按“2.1”项下方法测定,记录空白血浆色谱图;精密量取100 µl空白血浆,按“2.3”项下操作处理后,再按“2.1”项下方法测定,记录含内标的血浆样品色谱图;精密量取含适量PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA的空白血浆样品各100 µl,用300 µl乙腈代替300 µl内标液,按“2.3”项下方法处理后,再按“2.1”项下方法测定,记录含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品色谱图。结果见图1,内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的色谱峰附近无明显内源性杂质峰干扰,其保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min,表明血浆中内源性物质不干扰PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的测定。

      图  1  空白血浆及内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的血浆样品液的UPLC-MS/MS色谱图

    • 精密量取95 µl小鼠空白血浆,加入5 µl紫杉醇脂肪酸酯对照样品(PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA)工作溶液配制成5.00、25.00、50.00、100.00、300.00和500.00 ng/ml的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA系列浓度对照样品小鼠血浆液,按“2.3”项下操作处理后,再按“2.1”项下进样测定。以PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA对照样品浓度为横坐标(X),样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)进行线性回归分析,求得各自回归方程,结果见表1

      表 1  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的标准曲线参数

      对照样品 回归方程 r 线性范围(ng/ml)
      PTX-MA Y=0.186 2 X−1.984 0.995 8 5.00~500.00
      PTX-PA Y=0.668 5 X−12.977 0.998 4 5.00~500.00
      PTX-SA Y=0.402 1 X−7.171 0.998 8 5.00~500.00
    • 取空白小鼠血浆,分别配制含PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA浓度为10.00、250.00和375.00 ng/ml的低、中、高3个浓度的小鼠血浆样品溶液,置于−80 ℃低温冰箱保存。按“2.3”项下方法处理后,再按“2.1”项下方法进样分析测定。每个浓度5份,每天连续进样3次,连续3 d。根据测得PTX-MA、PTX-PA、PTX-SA和内标的峰面积,计算PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的实测浓度,考察PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA低、中、高浓度在小鼠血浆中的日内及日间的准确度和精密度。如表2结果显示,PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA在低、中、高3个浓度的日内和日间的精密度RSD均<8.4%,准确度均>95%,表明仪器精密度良好。

      表 2  PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA样本的精密度(n = 5)

      对照样品 理论浓度(ng/ml) 日内精密度 日间精密度
      实测浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%) 实测浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%)
      PTX-MA 10.00 9.93±0.83 99.36±8.32 8.38 10.37±0.61 103.67±6.06 5.84
      250.00 242.29±10.93 96.84±4.51 4.51 247.42±5.30 98.97±2.12 2.14
      375.00 371.31±6.30 99.02±1.68 1.70 373.37±6.20 99.57±1.65 1.66
      PTX-PA 10.00 9.83±0.50 98.28±5.00 5.09 10.25±0.55 102.53±5.52 5.38
      250.00 248.42±6.81 99.37±2.72 2.74 246.93±5.74 98.77±2.29 2.32
      375.00 373.79±8.70 99.68±2.32 2.33 371.59±4.12 99.09±1.10 1.11
      PTX-SA 10.00 9.59±0.51 95.90±5.08 5.30 10.33±0.67 103.27±6.72 6.50
      250.00 248.81±7.89 99.53±3.16 3.17 245.92±5.04 98.37±2.01 2.05
      375.00 374.36±8.81 99.83±2.35 2.35 371.26±2.43 99.00±0.65 0.65
    • 取空白小鼠血浆,分别配制低、中、高3个浓度(10.00、250.00和375.00 ng/ml)的血浆样品(PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA)液各3份,分别于室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d后复融或−20 ℃反复冻融3次,按“2.3”项下方法处理样本,再按“2.1”项下方法进样分析测定。结果显示,在上述考察条件下,PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的低、中、高3个实测浓度的RSD均<10%,表明PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的小鼠血浆样品在室温放置12 h、−20 ℃冻存5 d及−20 ℃反复冻融3次条件下稳定性良好。

    • 取空白小鼠血浆,分别配制低、中、高3个浓度(10.00、250.00和375.00 ng/ml)的血浆样品(PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA)液各3份,按“2.3”项下方法处理样本,再按“2.1”项下方法进样分析测定,计算所得浓度为A。另取空白血浆,按“2.3”项下方法处理样本后,再加入PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA工作液形成终浓度分别为10.00、250.00和375.00 ng/ml的3种不同浓度的标准溶液,按“2.1”项下方法进样分析测定,计算所得浓度为B。用甲醇配制含内标(30 ng/ml)的低、中、高3个浓度(10.00、250.00 和375.00 ng/ml)的PTX-MA或PTX-PA或PTX-SA的样品溶液,按“2.1”项下方法进样分析测定,计算所得浓度为C。提取回收率为(A/B)×100%,基质效应为(B/C)×100%。结果见表3,PTX-MA、PTX-PA或PTX-SA的平均提取回收率和基质效应的RSD均<10%,符合测定要求。

      表 3  小鼠血浆中PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA的提取回收率和基质效应(n = 3)

      对照样品 理论浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%)a 基质效应(%) RSD(%)b
      PTX-MA 10.00 79.82±6.60 8.28 95.36±6.55 6.87
      250.00 88.35±2.84 3.22 96.28±3.59 3.73
      375.00 92.08±2.46 2.67 98.86±1.46 1.48
      PTX-PA 10.00 73.34±7.24 9.88 94.28±1.96 2.08
      250.00 83.58±2.24 2.68 98.46±1.86 1.89
      375.00 89.47±1.51 1.68 98.88±0.68 0.69
      PTX-SA 10.00 61.90±4.11 6.63 95.90±5.08 5.30
      250.00 77.26±2.88 3.73 98.78±2.22 2.25
      375.00 84.43±1.21 1.44 99.08±1.01 1.02
      注:a:回收率的相对标准偏差;b:基质效应的相对标准偏差。
    • 雌性ICR小鼠90只,于实验前12 h禁食不禁水, 标记称重后分为PTX-MA-L、PTX-PA-L、PTX-SA-L 3组。以紫杉醇等摩尔剂量15.00 mg/kg小鼠尾静脉给药,分别于给药后2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、3 d、14 d,小鼠眼眶静脉丛取血0.3 ml(每个时间点各取3只小鼠),置于装有肝素钠的离心管中,以10 000 r/min离心3 min后,上清液置于−80 ℃冰箱保存待测。上述血浆样品液按“2.3”项下方法处理后按“2.1”项下方法进样测定。所得数据用DSA2.0软件进行处理,以三房室模型计算得到药代动力学参数,结果见表4

      表 4  小鼠尾静脉注射3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体药代动力学参数(n = 3)

      关键参数单位PTX-MA-LPTX-PA-LPTX-SA-L
      Cmaxng/L226 436.10±4 932.89289 171.80±5 311.62333 508.00±3 464.10
      AUC0-14 dng·h/L502 384.75±3 464.10776 973.44±5 196.151 668 984.05±6 350.85
      AUC0-∞ng·h/L503 800.86±8 082.90777 835.54±6 429.101 669 696.54±5 773.50
      t1/2h14.78±2.0044.49±3.5169.32±2.15
      VL/kg45.68±1.0062.57±1.5368.58±3.10
      CLL·kg/h29.06±2.5224.94±2.0813.74±2.52
    • 该研究以卡马西平为内标,建立了小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量的UPLC-MS/MS测定方法。其中,内标、PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA色谱峰保留时间分别为2.41、4.37、4.84和5.28 min,均达到基线分离。相比前期研究中血浆PTX-MA、PTX-PA和PTX-SA含量的传统HPLC测定方法存在分离度差、灵敏度低的缺陷而无法满足检测要求,该方法具有选择性更好、分离范围更广、分离能力更强、灵敏度及重现性更高等优点,并成功应用于3种紫杉醇脂肪酸酯前药脂质体(PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L)的小鼠体内药代动力学参数的测定。

      该研究采用乙腈直接沉淀血浆蛋白的方式,短时间内可检测小鼠血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯,体现了方法的便捷性和可控性。另外,通过优化流动相组成以及比例,使得内源性杂质与药物样品具有较好的分离效果。特别是在流动相中加入甲酸,不仅可以改善峰形,也可促进样品离子化,提高质子化检测能力,从而提高该方法的检测灵敏度。

      总之,该研究建立的UPLC-MS/MS测定方法专属性强、操作简便、灵敏度和精密度高、重现性和稳定性好, 可用于定量测定小鼠体内血浆中3种紫杉醇脂肪酸酯前药含量。小鼠体内药代动力学研究结果显示, 3种紫杉醇脂肪酸酯脂质体PTX-MA-L、PTX-PA-L和PTX-SA-L在小鼠体内的t1/2分别为14.78、44.49和69.32 h,清除率(CL)分别为29.06、24.94和13.74 L·kg/h,提示随着脂肪酸碳链长度的增加,紫杉醇脂肪酸酯在小鼠体内的t1/2大幅延长、CL则显著降低,表明紫杉醇经不同链长饱和脂肪酸酯化修饰可明显改变其体内药动学特性,其中,紫杉醇棕榈酸酯脂质体(PTX-PA)具有适宜的药动学参数,值得下一步深入开发研究。

参考文献 (10)

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