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气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量

潘宇炯 何志高 周昕 章恒周 杨月红 黄景山

周娇, 郑建雨, 王思真, 杨峰. mRNA肿瘤疫苗非病毒递送系统研究进展[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(3): 109-116. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410034
引用本文: 潘宇炯, 何志高, 周昕, 章恒周, 杨月红, 黄景山. 气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(9): 552-556. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110
ZHOU Jiao, ZHENG Jianyu, WANG Sizhen, YANG Feng. Progress on mRNA tumor vaccine with non-viral delivery system[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2025, 43(3): 109-116. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410034
Citation: PAN Yujiong, HE Zhigao, ZHOU Xin, ZHANG Hengzhou, YANG Yuehong, HUANG Jingshan. Determination of camphor residue and borneol content in Qingchang Suppository by GC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(9): 552-556. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110

气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110
基金项目: 上海市进一步加快中医药传承创新发展三年行动 计划(ZY(2021-2023)-0203-01)
详细信息
    作者简介:

    潘宇炯,本科,主管药师,研究方向:医院制剂生产及研究,Email:pyjandyyh@sina.com

    通讯作者: 黄景山,本科,中药师,研究方向:中药制剂,Email:hjsby@163.com
  • 中图分类号: R917,

Determination of camphor residue and borneol content in Qingchang Suppository by GC

  • 摘要:   目的  建立清肠栓中樟脑残留物和冰片含量的气相测定方法。  方法  采用气相色谱法,色谱柱为Agilent毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm),柱温为140 ℃,进样口温度250 ℃,检测器(FID)温度为250 ℃。  结果  樟脑、龙脑和异龙脑在0.0299~1.497µg(r=1.000)、0.0205~1.025µg(r=1.000)、0.0097~0.4830 µg(r=1.000)范围内呈现良好的线性关系。精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2%,平均加样回收率分别为99.7%、101.0%、102.5%。  结论  该方法准确、可靠、简便快速,可用于清肠栓中龙脑含量的测定。
  • 在全球新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)大流行期间,Moderna和BioNTech/辉瑞公司基于脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)载体的mRNA疫苗获得FDA紧急批准[1,2],迅速地延缓了新型冠状病毒的传播。基于脂质纳米颗粒-mRNA的COVID-19疫苗取得的巨大成功,使得mRNA疫苗技术迅速成为研究的热点,并促进了mRNA疫苗在肿瘤等重大疾病治疗中的研发和应用。

    2024年6月,上海交通大学附属瑞金医院沈柏用教授团队披露mRNA肿瘤疫苗研究新进展,在全球范围内首次报道针对KRAS G12V单靶点的mRNA肿瘤疫苗在实体肿瘤中的治疗效果,为传统治疗无法耐受或者耐药的晚期肿瘤患者带来新希望[3]。同时,针对肿瘤抑制性免疫微环境,编码细胞因子的mRNA肿瘤疫苗可以促进效应T细胞的成熟、调控肿瘤微环境,从而提高在实体瘤局部疫苗接种的抗肿瘤疗效。其中,以MEDI1191、mRNA-2416、mRNA-2752、SAR44100等为代表的 mRNA肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。mRNA肿瘤疫苗通过将编码肿瘤抗原的mRNA引入宿主细胞(通常是抗原提呈细胞)的细胞质中表达靶蛋白抗原,然后在抗原提呈细胞表面呈递MHC分子,诱导有效的免疫应答来发挥作用[4,5]。相对于其他类型的治疗性肿瘤疫苗来说,基于mRNA的肿瘤疫苗是一种有前途的策略(图1),其具有如下优势:①与病毒疫苗类似,mRNA肿瘤疫苗能够同时递送多种抗原,引发体液免疫和细胞免疫,增加了肿瘤细胞根除的可能性。②与基于肽的疫苗不同,mRNA肿瘤疫苗不受患者特异性HLA类型的限制。③与基于DNA的肿瘤疫苗相比,mRNA肿瘤疫苗安全且耐受性良好,没有插入宿主基因组的风险[4]。尽管mRNA肿瘤疫苗具有非常广阔的应用前景,但仍然存在以下问题:①mRNA分子在体内非常不稳定,很容易被细胞外的核酸酶降解[6]。②mRNA分子量大且带负电荷,这阻碍了它们通过细胞膜高效递送至靶细胞[7]。因此,推动mRNA药物应用的关键之一是高效的mRNA递送系统的开发。与基于病毒的递送系统相比,非病毒载体在生物安全性和多功能性方面具有重大优势。如基于脂质的纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、肽类纳米颗粒和无机纳米粒子,能有效压缩mRNA,使其免受核酸酶的降解[8]。此外,根据靶向器官的生物结构和递送过程中的屏障,非病毒载体可以有目的地进行结构改造,从而更有效地将mRNA递送到身体的特定部位,以提高治疗效果[8]。因此,基于非病毒载体的递送系统的研究已成为mRNA肿瘤疫苗研究领域的热点课题。

    图  1  应用于mRNA肿瘤疫苗的非病毒递送系统

    mRNA肿瘤疫苗的研究发端于 20 世纪 70 年代。1976年,Langer等[9]首次使用了聚合物纳米颗粒和微颗粒作为载体来封装核酸。随后2年,又实现将外源性mRNA通过脂质体递送到宿主细胞,进一步拓展了mRNA技术的应用[10]。1990年,Wolff等[11]将含有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶基因的RNA和DNA表达载体分别注射到小鼠体内骨骼肌中,在所有小鼠体内都检测到了相应蛋白质的表达,为mRNA用作治疗药物的研究奠定了基础。mRNA疫苗的概念可以追溯到1993年,Martinon等[12]在用编码流感病毒蛋白的mRNA免疫的小鼠中观察到细胞毒性T淋巴细胞的诱导,揭示了mRNA作为编码抗原的基因在疫苗研究领域的应用潜能。1995年,Conry 等[13]构建了编码荧光素酶和人癌胚抗原(carcinoem bryonic antigen,CEA)的mRNA剪切体,该mRNA剪切体在体外小鼠成纤维细胞中定向表达CEA, mRNA肿瘤疫苗的概念被首次提出。近年来,COVID-19的流行推动了mRNA疫苗的深入研究和技术的发展,并使mRNA肿瘤疫苗再次受到关注。事实上,COVID-19疫苗的快速发展得益于多年来在临床前和临床试验中以mRNA疫苗作为肿瘤治疗策略的相关研究。因此,mRNA疫苗是未来肿瘤治疗有希望的候选疗法之一。

    由于mRNA存在不稳定性、高免疫原性、递送效率低等问题,开发高效的靶向递送系统是mRNA疫苗亟待解决的问题。mRNA疫苗递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。目前,多数的临床基因治疗试验采用病毒载体。然而,病毒载体存在易于刺激免疫原性反应产生和诱导基因插入突变等问题,其临床安全性一直受到质疑。而包括脂质纳米粒、聚合物、肽类、无机材料在内的非病毒载体,具有强大的基因装载能力、高度的安全性和实用性,且其制备较为简单。因此,非病毒载体在进一步的临床开发和应用中显示出巨大的潜力[14]

    脂质纳米颗粒是一种临床批准的用于核酸递送的多功能平台[15]。截至2023年11月,3种基于LNP的药物(1种siRNA,2种mRNA)已获得美国食品药品监督管理局批准,超过50种候选药物正在临床试验中,用于治疗或预防传染病、肿瘤和遗传性疾病[16]

    LNP脂质壳结构由脂质或类脂材料以及辅助成分(包括胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质)组成(图2)。这些成分可促进单分散纳米颗粒的形成、提高纳米颗粒的稳定性、实现有效的核酸封装、增加细胞摄取和促进mRNA的内体逃逸。其中,辅助磷脂可以调节 LNP 双分子层的流动性,促进内体逃逸[17];胆固醇通过填充磷脂间的空隙来调节膜的流动性,促进膜融合。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)化脂质控制LNP的大小和稳定性,介导LNP的间接靶向能力以及保护LNP免受巨噬细胞介导的清除[18,19];LNP 配方中最重要的成分为阳离子脂质或可电离脂质,在早期的研究中主要使用阳离子脂质,如(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵[(2, 3-dioleyl-propyl)-trimethyl ammonium chloride, DOTAP]和1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(1, 2-didecaenooxy-3-methyl ammonium propane, DOTMA)。然而阳离子脂质具有高免疫原性和较强的毒性[20]

    图  2  LNP及其各组成部分示意图

    可电离脂质具有pH敏感性,其在酸性条件下带正电荷,在生理pH条件下接近中性[21,22]。这种特性使它们在体内分布时更少地与血清成分相互作用。当可电离脂质纳米粒进入细胞的酸性内体后,它们可以被质子化,从而帮助mRNA逃逸到细胞质中。常用的可电离脂质有1,2-二甲氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLin-DMA)、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺(DLin-KC2-DMA)和4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)。可电离脂质的结构改变可引起 mRNA递送效率的改变,如Dong等[23]合成了含有不同头部基团的二氨基(DAL)可电离脂质材料,用于包载编码IL-12、IL-27和GM-CSF等细胞因子的mRNA。使用DAL-LNP对携带B16F10黑色素瘤的小鼠进行治疗性疫苗接种,结果显示通过DAL-LNP在瘤内给药IL-12和IL-27 mRNA促进了B16F10黑色素瘤生长的持续抑制,且没有引起明显的毒性。

    此外,在LNP的表面进行靶向免疫细胞表面受体的功能性修饰,或与佐剂共同给药,可增强免疫刺激。Shi等[24]将 Pam2Cys(一种可通过 Toll 样受体(TLR)2/6 途径发出信号的简单合成代谢脂氨基酸)引入 LNP,实现了与 mRNA 的共同递送。结果显示,使用由此产生的 mRNA-LNP (Pam2Cys)进行免疫,可通过诱导 IL-12 和 IL-17 等细胞因子改善肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes,TDLN)的免疫微环境。

    目前常用于mRNA递送的聚合物材料主要有聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、基于聚酰胺-胺(poly-amindoamine,PAMAM)和聚丙烯亚胺(polypropylenimine,PPI)的树枝状大分子、聚氨基酯(poly β-aminoester,PBAE)、壳聚糖等[25]图3)。与LNP相比,基于聚合物的递送系统具有较高的多分散性、分子量和电荷密度,这导致基于聚合物的递送系统纯度较低、清除率较低且毒性较大。因此,它们在mRNA递送方面的临床应用不如可电离脂质纳米粒广泛。为了提高聚合物材料的转染效率和稳定性,并降低其毒性,人们对其结构进行了改造,包括添加脂质尾部、超支化基团和可生物降解分子[26]

    图  3  几种常见的基于聚合物的非病毒递送系统的化学结构

    PEI含有大量的氨基,在生理pH值下可被质子化带正电荷。而mRNA是一种带负电的分子。因此,PEI通过静电相互作用与mRNA紧密地结合形成纳米复合物[27]。此复合物可以有效地压缩mRNA,并在一定程度上保护mRNA免受外界酶的降解[28]。在体内,PEI充当“质子海绵”促进mRNA释放到细胞质。然而,由于高电荷密度和高分子量,PEI具有较大的全身毒性和低生物降解性。用脂肪链修饰的低分子量PEI已被用于mRNA递送以降低毒性,如Peng等[29]合成了一种氟烷烃接枝的聚乙烯亚胺(F-PEI)。结果显示由F-PEI和编码肿瘤抗原的mRNA自组装形成的疫苗,无额外的佐剂,即可诱导树突状细胞成熟并触发有效的抗原呈递,从而引发抗肿瘤免疫反应。

    树枝状大分子(dendrimers)是一类具有树枝状结构,由低聚物通过支化单元重复、线性连接而成的大分子,其通常由内核、聚合物主链和树枝单元的侧链组成[30,31]。作为一种阳离子聚合物,树枝状大分子的细胞毒性也需要通过表面改性来降低。England等[32]使用赖氨酸作为位点选择性锚,通过酰胺化反应引入了聚磺酰精氨酸和咪唑基团对PAMAM(P)和赖氨酸(L)树枝状大分子进行了化学改性。实验结果显示,与市售的转染剂jetPEI® 相比,改性的PAMAM树枝状大分子显示出更高的mRNA转染效率。

    除了基于聚合物和脂质纳米粒的载体外,还可以使用基于肽类的载体递送mRNA。肽类由可生物降解的氨基酸组成,因此其具有高度的生物相容性。鱼精蛋白和细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是两种基于肽的载体,可用于mRNA递送。鱼精蛋白是一种天然的富含精氨酸的阳离子蛋白,可以把带负电的mRNA分子络合成纳米级别的核酸颗粒[33]。此外,鱼精蛋白-mRNA组成的纳米级颗粒还可以进一步制备成脂质纳米颗粒,这种脂质-鱼精蛋白-mRNA(lipid/protamine/mRNA, LPR)的制剂形式,兼有脂质纳米粒和鱼精蛋白的优势[34,35]。Shen等[36]制备了一种由鱼精蛋白/mRNA核和脂质壳组成的mRNA肿瘤疫苗(MVP)。结果显示,MVP 中的mRNA核和脂质壳可充分刺激树突状细胞中I型干扰素和炎症细胞因子的表达,在小鼠结直肠肿瘤和黑色素瘤模型中引起了有效的抗肿瘤免疫。

    CPPs是一类由不多于30个氨基酸组成的小分子多肽。CPPs在生理pH值下带正电荷,可以与带负电荷的mRNA形成纳米结构[37]。Men等[38]将肿瘤细胞裂解液引入到DMP纳米颗粒[由DOTAP和(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)(mPEG-PCL)自组装形成]中,并将CPPs修饰在DMP表面,形成CLSV系统。然后将编码IL-22结合蛋白(interleukin-22 binding protein,IL-22BP)的mRNA与CLSV混合形成CLSV/IL-22BP复合物。结果表明,所构建的CLSV达到了激活免疫反应和增强mRNA递送的双重目的,在体外和体内均表现出较强的抑制肿瘤细胞生长的能力。

    无机纳米颗粒是一种多功能纳米平台。虽然INPs的生物相容性不如脂质纳米粒和聚合物,但是INPs可以通过表面功能化修饰,获得具有适当的溶解度和分散性的纳米粒子。并且某些INPs具有磁性和光学性质,可实现对肿瘤的成像和消融[39]。典型的INPs包括金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、氧化铁纳米粒子、量子点等。

    常用的INPs是介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silica, MSN),其具有孔道均匀、高比表面积、大孔容和可生物降解性等优点。Phua等[40]开发了一种介孔二氧化硅纳米颗粒-mRNA (MSN-mRNA)皮下递送系统。结果显示,将编码卵清蛋白和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的裸mRNA和C16@MSNs组成的MSN-mRNA疫苗配方应用于小鼠E.G7-OVA预防性肿瘤模型时,产生了显著的肿瘤抑制作用。其次,INPs还可以与聚合物和脂质纳米粒联合,用于mRNA的递送。Shin等[41]开发了一种基于聚乙烯亚胺修饰的多孔二氧化硅纳米颗粒(PPSN)的递送平台,其携带细胞因子mRNA用于体内局部免疫治疗。结果表明,PPSN在定位mRNA翻译方面明显比美国食品药品监督管理局批准的LNP更有效。该研究显示了PPSN介导的mRNA递送作为肿瘤免疫疗法中基于mRNA治疗的特异性、有效性和安全性平台的潜力。

    基于肿瘤的特点编码特异性抗原,使其顺利地被免疫细胞识别以激活免疫应答,是mRNA肿瘤疫苗的核心作用机制。现阶段主要研究的mRNA肿瘤疫苗编码的抗原主要有肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)、肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)和免疫调节因子3种类型[42]。通过对非病毒载体和对机体免疫系统的研究不断深入,目前已有多项mRNA肿瘤疫苗进入临床试验。中国进入临床试验阶段的mRNA肿瘤疫苗如表1所示。

    表  1  中国进入临床试验阶段的mRNA肿瘤疫苗
    疫苗登记号适应证申办单位研发阶段
    ChiCTR2300071001EGFR 突变阳性的晚期非小细胞肺癌苏州艾博生物科技有限公司探索性研究/预试验
    CTR20232018晚期实体瘤北京立康生命科技有限公司Ⅰ期临床
    CTR20240438新诊断的原发性脑胶质母细胞瘤(WHO 4级)北京启辰生生物科技有限公司Ⅰ期临床
    ChiCTR2300077339晚期胰腺癌中国人民解放军总医院Ⅰ期临床
    ChiCTR2300071740HPV16/18阳性的不可切除的复发性或转移性实体瘤南阳医学高等专科学校第一附属医院Ⅰ期临床
    ChiCTR2200066118晚期黑色素瘤南阳医学高等专科学校第一附属医院Ⅰ期临床
    ChiCTR2200056172晚期实体瘤蚌埠医学院第一附属医院Ⅰ期临床
    ChiCTR2000029301胃癌,食管癌深圳市新合生物医疗科技有限公司Ⅰ期临床
    ChiCTR1900023000晚期恶性实体瘤斯微(上海)生物科技有限公司Ⅰ期临床
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    肿瘤特异性抗原是体细胞中的非同义突变产生非自体蛋白[43],仅在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中不表达,因此支持对患者个体肿瘤抗原产生特异性免疫反应[44]。多个编码TSA的mRNA肿瘤疫苗已完成了Ⅰ/Ⅱ期临床试验[45]。BNT 122是BioNTech 和Genentech公司联合研发的一款编码胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者的20种新抗原的mRNA疫苗,使用LNP进行静脉注射给药。Ⅰ期临床试验结果显示,在手术切除后的PADC患者中,将BNT 122与化疗和免疫检查点疗法联用时,该mRNA疫苗对延缓PDAC患者的复发具有潜力。目前基于BNT122针对黑色素瘤和结直肠癌的治疗处于Ⅱ期临床试验阶段,针对实体瘤的临床试验即将进行Ⅱ期临床试验[46]

    肿瘤相关抗原是是一种在正常组织中表达但在肿瘤组织中过表达的抗原。具有肿瘤特异性弱、中枢免疫耐受性强、免疫原性弱的特点[47]。目前,利用多种TAA组合开发mRNA疫苗已成为一种趋势。BI 1361849是Ludwig癌症研究所研发的一款编码NY-ESO-1、MAGE-C2、MAGE-C1、survivin、5T4和MUC1这6种TAA的mRNA疫苗,其使用鱼精蛋白作为载体。Ⅰb期临床研究评估了BI-1361849联合局部放疗对Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)患者的有效性和安全性,结果显示,BI-1361849具有良好的耐受性和免疫原性。2017年12月,在美国启动了BI-1361849与 抗程序性死亡配体1 durvalumab和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抗体tremelimumab联用治疗NSCLC的Ⅰ/Ⅱ期临床试验。

    免疫调节因子是一类能够刺激或抑制特定免疫细胞功能的分子,包括细胞因子、共刺激因子等[48]。靶向肿瘤微环境实现肿瘤免疫治疗是目前抗肿瘤技术研究的热点。免疫调节因子可以重新激活免疫系统的抗肿瘤免疫反应并重塑积极的免疫微环境[49]。此外,编码免疫调节因子的mRNA疫苗还可作为编码TAA的mRNA疫苗的佐剂。mRNA-2752是Moderna公司研发的一款编码人 OX40L、IL-23 和 IL-36γ 的mRNA疫苗,其使用LNP作为载药系统,通过瘤内注射给药。在Ⅰ期的一项剂量递增研究(NCT03739931)中,mRNA-2752与免疫检查点阻断治疗剂durvalumab共同给药显示出抗肿瘤作用。目前mRNA-2752针对于三阴性乳腺癌、泌尿上皮癌、淋巴瘤和免疫检查点难治性黑色素瘤和非小细胞肺癌的Ⅰ期临床人体耐受性试验正在进行中。

    随着分子生物学的发展,mRNA疫苗给肿瘤免疫治疗带来了前所未有的希望。通过对mRNA化学修饰的改进以及开发更高效的非病毒载体递送系统可以提高mRNA肿瘤疫苗的安全性、稳定性和递送效率。基于基因治疗的良好前景,未来mRNA肿瘤疫苗的非病毒递送系统的主要发展方向可能包含以下几个方面:①将不同类型的非病毒载体联用共同递送mRNA疫苗,以结合不同类型载体的优点,实现提高纳米粒子稳定性、生物相容性和降低毒性等目的。②对非病毒载体进行功能化修饰以实现mRNA肿瘤疫苗的靶向性、光响应性、荧光可视性、pH响应性释放等功能。③阐明非病毒载体结构与其功能的关系,以及进入人体后与肿瘤微环境的相互作用机制。目前,正在开展许多基于脂质纳米颗粒、脂质-鱼精蛋白、阳离子脂质复合物和脂质多聚复合物等非病毒递送系统的mRNA肿瘤疫苗的临床试验。相信伴随多组学技术的发展和跨学科的融合,未来肿瘤特异性抗原的筛选将变得越来越精确。随着对非病毒递送系统研究的不断深入,mRNA肿瘤疫苗将在未来的肿瘤治疗中发挥巨大的作用。

  • 图  1  樟脑对照品(A)、龙脑和异龙脑对照品(B)、阴性对照(C)和供试品溶液(D)

    1.樟脑;2龙脑;3异龙脑

    表  1  龙脑回收率试验(n=6)

    成分 原有量(mg) 加入量
    (mg)
    测得量
    (mg)
    回收率
    (%)
    平均回收率
    (%)
    RSD
    (%)
    龙脑 0.47 0.50 0.97 100.8 101.0 0.51
    0.48 0.50 0.98 101.6
    0.47 0.50 0.97 101.2
    0.47 0.50 0.97 100.8
    0.47 0.50 0.97 100.2
    0.47 0.50 0.97 101.4
    异龙脑 0.28 0.29 0.58 102.8 102.5 1.66
    0.28 0.29 0.59 104.5
    0.28 0.29 0.58 104.2
    0.28 0.29 0.57 100.4
    0.28 0.29 0.58 102.1
    0.28 0.29 0.57 100.8
    樟脑 0.00 0.13 0.12 97.06 99.69 3.77
    0.00 0.13 0.12 93.91
    0.00 0.13 0.13 102.6
    0.00 0.13 0.13 99.43
    0.00 0.13 0.13 104.2
    0.00 0.13 0.13 101.0
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    表  2  清肠栓样品含量实验

    样品序号龙脑(mg/g)异龙脑(mg/g)冰片(mg/g)
    114.238.50922.74
    214.198.56422.76
    314.388.66523.05
    414.268.56922.83
    514.288.51122.79
    614.218.57122.78
    714.248.44622.68
    814.418.63223.04
    914.138.32922.46
    1013.898.40122.29
    1118.7611.3530.11
    1218.6011.2029.80
    1318.9311.3930.32
    1419.0311.3730.40
    1518.6511.2629.91
    1618.8211.3830.19
    1718.8911.3530.24
    1818.7411.2830.02
    1918.9411.3530.29
    2018.8811.3930.27
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-08-31
  • 修回日期:  2023-03-15
  • 网络出版日期:  2023-09-25
  • 刊出日期:  2023-09-25

气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110
    基金项目:  上海市进一步加快中医药传承创新发展三年行动 计划(ZY(2021-2023)-0203-01)
    作者简介:

    潘宇炯,本科,主管药师,研究方向:医院制剂生产及研究,Email:pyjandyyh@sina.com

    通讯作者: 黄景山,本科,中药师,研究方向:中药制剂,Email:hjsby@163.com
  • 中图分类号: R917,

摘要:   目的  建立清肠栓中樟脑残留物和冰片含量的气相测定方法。  方法  采用气相色谱法,色谱柱为Agilent毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm),柱温为140 ℃,进样口温度250 ℃,检测器(FID)温度为250 ℃。  结果  樟脑、龙脑和异龙脑在0.0299~1.497µg(r=1.000)、0.0205~1.025µg(r=1.000)、0.0097~0.4830 µg(r=1.000)范围内呈现良好的线性关系。精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2%,平均加样回收率分别为99.7%、101.0%、102.5%。  结论  该方法准确、可靠、简便快速,可用于清肠栓中龙脑含量的测定。

English Abstract

周娇, 郑建雨, 王思真, 杨峰. mRNA肿瘤疫苗非病毒递送系统研究进展[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(3): 109-116. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410034
引用本文: 潘宇炯, 何志高, 周昕, 章恒周, 杨月红, 黄景山. 气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(9): 552-556. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110
ZHOU Jiao, ZHENG Jianyu, WANG Sizhen, YANG Feng. Progress on mRNA tumor vaccine with non-viral delivery system[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2025, 43(3): 109-116. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410034
Citation: PAN Yujiong, HE Zhigao, ZHOU Xin, ZHANG Hengzhou, YANG Yuehong, HUANG Jingshan. Determination of camphor residue and borneol content in Qingchang Suppository by GC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(9): 552-556. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208110
  • 清肠栓是由上海市名中医马贵同教授创制的医院制剂。该方基于溃疡性结肠炎“湿热瘀互结肠道”的关键病机,以清热化湿、活血止血立法,在锡类散、青黛散治疗黏膜溃疡的基础上优化筛选而来[1-2]。主要由三七和青黛全粉入药,五倍子和马齿苋经提取后浸膏粉入药,再加入冰片、羊毛脂,以半合成脂肪酸酯为基质制备而成的中药栓剂。

    冰片为一种传统中药,清香宣散,具有开窍醒神,清热败毒的功效。现代药理学研究表明,冰片具有镇静安神、醒脑、促透、抗菌、抗炎等作用[3]。冰片常被用于肛肠外科,可避免药物的首过效应,提高药物有效性。冰片能开放并透过血脑屏障,有助于其他药物通过血脑屏障,促进疗效[4]

    冰片具有挥发性,龙脑常被作为其主要的质量控制指标,含量测定方法主要包括气相色谱法、衍生化高效液相色谱法、薄层色谱法等[5]。2020年版《中国药典》中,采用气相色谱法测定,冰片含龙脑成分不得少于55.0%,樟脑不得超过0.50%[6]。 目前,已有文献对清肠栓中三七皂苷、人参皂苷、没食子酸、靛蓝和靛玉红进行含量测定[7-8],故本实验采用气相色谱法对清肠栓中冰片含量进行测定,并计算龙脑、异龙脑的相对含量,为进一步提高清肠栓的质量控制提供有效依据。

    • 7820A型气相色谱仪、氢火焰离子化检测(FID)(美Agilent 公司);225D-1CN型电子分析天平、BSA124S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司,精度:十万分之一);S450H型超声波清洗器(德国Elma)。

    • 清肠栓为院内制剂室提供(批号:210420-210425、211018、211020、211022、211025、190107、190114、190121、190304、190311、190318、190408、190415、190422、190506、190513和200302);樟脑对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:2814,纯度:95.0%);龙脑对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110881-201709,纯度:99.6%);异龙脑对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111512-201904,纯度:98.4%);水为超纯水(实验室自制);乙酸乙酯(上海凌峰化学试剂有限公司,分析纯)。

    • 采用Agilent7890A型气相色谱仪FID检测器;DIKMA DM-Wax聚乙二醇20000(PEG-20M)毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm);进样口温度为250 ℃;检测器(FID)温度为250 ℃;柱温140 ℃;空气流速为450 ml/min,氢气燃气流速为50 ml/min;尾吹气为25 ml/min;分流比为20:1,进样量为1 µl。理论板数按龙脑峰计算应不低于2 000。

    • 称取樟脑对照品适量,精密称定,加乙酸乙酯溶解,制成每1 ml含樟脑0.1 mg的对照品溶液。另取龙脑、异龙脑对照品适量,精密称定,加乙酸乙酯溶解,制成每1 ml含龙脑0.3 mg、异龙脑0.2 mg的混合对照品溶液。

    • 取清肠栓(批号:200302)样品10粒,研细,取约60 mg,精密称定,置10 ml量瓶中,加乙酸乙酯8 ml,超声(频率37 kHz,功率800 w)处理30 min,放冷,加乙酸乙酯至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

    • 按清肠栓制剂处方比例,配制缺冰片的阴性样品,再按供试品溶液制备方法制备,即得。

    • 精密吸取樟脑对照品溶液、龙脑和异龙脑对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1 µl,按“2.1”项色谱条件下方法分别进样测定,结果樟脑、异龙脑和龙脑对照品的理论板数分别为88 684、107 331、108 387,远大于规定的2 000。供试品溶液色谱图中,未检出与樟脑对照品溶液保留时间相同的色谱峰,阴性对照溶液色谱图中在与龙脑、异龙脑相同保留时间处无干扰峰,表明该方法专属性良好。色谱图见图1

      图  1  樟脑对照品(A)、龙脑和异龙脑对照品(B)、阴性对照(C)和供试品溶液(D)

    • 分别精密称取龙脑对照品14.92 mg、异龙脑对照品10.25 mg、樟脑对照品4.83 mg,置同一10 ml量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 ml含龙脑1.492 mg、异龙脑1.025 mg、樟脑0.483 mg的混合对照品溶液,作为贮备液。

      精密吸取5份贮备液各1 ml,加乙酸乙酯分别稀释50倍、20倍、5倍、2倍、1倍;分别精密吸取5个不同浓度的龙脑、异龙脑、樟脑混合对照品溶液,分别进样1 µl,按按“2.1 色谱条件”项下的方法测定,以进样浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程分别为:Y1=283.4X1+1.320(r=1.000,n=5);Y2=283.5X2+0.8597(r=1.000,n=5);Y3=276.9X3+0.5444(r=1.000,n=5)。线性范围分别为 0.0299~1.497µg、 0.0205~1.025µg、 0.0097~0.4830µg。

    • 精密吸取“2.2”项下对照品溶液,按“2.1 ”项的方法测定,重复进样6次,测定峰面积。结果龙脑、异龙脑、樟脑峰面积RSD分别为0.3%、0.4%、0.6%(n=6),表明仪器精密度良好。

    • 精密吸取同一供试品溶液(批号:200302),室温下分别放置0、4、8、12、16、20、24 h,按“2.1 色谱条件”项下的方法测定,记录峰面积。结果樟脑未检出,龙脑与异龙脑峰面积的RSD分别为1.6%和1.5%,表明供试品溶液在室温下放置24h稳定。

    • 精密称取清肠栓样品粉末60 mg(批号:200302),精密称定,平行称取6份,按“2.3供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液,按“2.1”项方法测定,结果均未检出樟脑,龙脑和异龙脑平均含量的RSD分别为0.8%和1.1%(n=6),表明该方法的重复性良好。

    • 称取清肠栓样品粉末30 mg(批号:200302),精密称定,平行称取6份,分别精密加入龙脑、异龙脑、樟脑对照品溶液,按“2.3” 项方法制备供试品溶液,按“2.1”项方法测定,记录峰面积,并计算加样回收率。结果见表1

      表 1  龙脑回收率试验(n=6)

      成分 原有量(mg) 加入量
      (mg)
      测得量
      (mg)
      回收率
      (%)
      平均回收率
      (%)
      RSD
      (%)
      龙脑 0.47 0.50 0.97 100.8 101.0 0.51
      0.48 0.50 0.98 101.6
      0.47 0.50 0.97 101.2
      0.47 0.50 0.97 100.8
      0.47 0.50 0.97 100.2
      0.47 0.50 0.97 101.4
      异龙脑 0.28 0.29 0.58 102.8 102.5 1.66
      0.28 0.29 0.59 104.5
      0.28 0.29 0.58 104.2
      0.28 0.29 0.57 100.4
      0.28 0.29 0.58 102.1
      0.28 0.29 0.57 100.8
      樟脑 0.00 0.13 0.12 97.06 99.69 3.77
      0.00 0.13 0.12 93.91
      0.00 0.13 0.13 102.6
      0.00 0.13 0.13 99.43
      0.00 0.13 0.13 104.2
      0.00 0.13 0.13 101.0
    • 取清肠栓制剂2019、2021年共20个批次的样品,按“2.3”项方法制备供试品溶液,再按“2.1”项方法测定,20个批次均未检出樟脑。样品中龙脑和异龙脑含量见表2(表中1~10为2019年样品,11~20为2021年样品)。

      表 2  清肠栓样品含量实验

      样品序号龙脑(mg/g)异龙脑(mg/g)冰片(mg/g)
      114.238.50922.74
      214.198.56422.76
      314.388.66523.05
      414.268.56922.83
      514.288.51122.79
      614.218.57122.78
      714.248.44622.68
      814.418.63223.04
      914.138.32922.46
      1013.898.40122.29
      1118.7611.3530.11
      1218.6011.2029.80
      1318.9311.3930.32
      1419.0311.3730.40
      1518.6511.2629.91
      1618.8211.3830.19
      1718.8911.3530.24
      1818.7411.2830.02
      1918.9411.3530.29
      2018.8811.3930.27
    • 乙酸乙酯对冰片具有较好的溶解性,并且样品中其他干扰成分的溶出较少,故选择其作为提取溶剂。本实验考察了不同提取时间(15 min、30 min、45 min)对样品提取效果的影响,观察比较不同条件处理后供试品溶液色谱情况,根据含量结果选择提取时间为30 min。最终以乙酸乙酯为提取溶剂,超声处理30 min作为供试品制备时的提取方式。

    • 柱温的选择:由于2020年版《中国药典》中冰片含量测定选择的注温为140 ℃,而查阅文献,部分实验者选择的柱温为160 ℃[9],因此,我们分别选择140 ℃和160 ℃进行试验,根据出峰时间及峰形比较,最终选择140 ℃作为实验条件。色谱柱的选择:实验研究使用的两种色谱柱分别为DIKMA DM-Wax(PEG-20M)毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 µm);Agilent HP-INNOWAX(PEG-20M)毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 µm),比较两种色谱柱的塔板数,实验显示色谱峰分离度良好,说明色谱柱对样品的测定结果影响较小,此方法具有普遍性,故最终选择本实验室常用的DIKMA DM-Wax色谱柱。樟脑检出限和定量限确定:检测限及定量限采用信噪比法确认,当信噪比(S/N)为3∶1时,樟脑检出限为1.4 μg/g;当信噪比(S/N)为10∶1时,其定量限为4.6 μg/g。

    • 2020年版《中国药典》中,冰片的描述为冰片(合成龙脑),其中对樟脑的检测要求为不得超过0.50%。本次实验,通过查阅文献,参考其它含冰片制剂中对樟脑残留的检测方法[10],对清肠栓样品进行樟脑含量测定,发现成品栓剂中均未检测到樟脑,证明我院制剂室所用冰片符合药典的相关规定。

      2020年版《中国药典》是以龙脑作为冰片的含量测定指标,但通过查阅文献可知,近年对冰片的含量测定中,多以龙脑与异龙脑总量来计算冰片的含量,[11-14]。考虑到本次实验是完善清肠栓的内控标准,提高制剂的稳定性,故本实验以龙脑和异龙脑的总量来计算冰片的含量。

      综上所述,本方法为冰片中龙脑、异龙脑的含量测定和樟脑限度检查制定提供参考,操作简单、重复性良好、结果准确,可用于清肠栓中冰片的质量控制。

参考文献 (14)

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