下载:
-
蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimera, PROTAC）是近年来最受期待的蛋白降解技术[1]。PROTAC是一种异双功能分子，一端与靶蛋白结合，另一端结合E3连接酶形成靶蛋白-PROTAC-E3三元复合物，E3连接酶诱导靶蛋白泛素化，随后被蛋白酶体识别并降解。PROTAC相较传统药物具有诸多优势，如使难成药靶点实现可成药性、大幅增加可用靶点数量、克服耐药性、提高选择性和活性、降低毒副作用等。但是，PROTAC依赖E3连接酶和蛋白酶体，也存在一些固有缺陷，如主要针对细胞质中可溶性蛋白进行降解，不能降解蛋白聚集物和大的蛋白质，对非蛋白物质的降解无能为力[2]。
自噬-溶酶体途径（ALP）是广泛存在于真核细胞中的蛋白降解系统，它是指在自噬关键蛋白LC3参与下，细胞内膜结构形成自噬小体并将底物包裹，随后转运至溶酶体实现底物降解的过程[3]。该机制涉及的底物范围十分广泛，包括蛋白质聚集体、衰老或受损的细胞器、入侵的病原微生物等。ALP与泛素-蛋白酶体途径互为补充，在细胞中发挥重要的生理功能[4-5]。
2019年，复旦大学鲁伯埙团队基于自噬-溶酶体途径首次提出自噬小体绑定化合物（ATTEC）概念。ATTEC是一种双功能分子，同时结合LC3与靶蛋白，将靶蛋白包裹进自噬小体，并在溶酶体中实现降解。基于这一思想，研究人员将小分子库固定在芯片上，筛选以“分子胶”方式将突变型亨廷顿蛋白（mHTT）和LC3蛋白“黏合”的分子，成功获得4个小分子化合物（10O5、ispinesib、AN1-2, 图1）。这些化合物能有效降解mHTT蛋白，并减弱亨廷顿病相关表型[6]。ATTEC分子通过直接连接自噬蛋白LC3，绕过泛素化过程，是一种利用自噬降解靶标最为直接的策略，对于降解不同类型的靶标具有很大的潜力。但是，ATTEC技术尚处于概念验证阶段，急需拓展靶标应用范围，推动技术的不断成熟。
图 1 ATTEC分子胶化学结构
BRD4是BET溴结构域蛋白家族中最重要的成员之一，在人体中广泛分布，对细胞正常生长及细胞周期的调控具有重要意义，与肿瘤发生密切相关，是肿瘤治疗的热门靶点[7]，基于PROTAC的BRD4降解剂相继报道[8-9]。BRD4已成为靶向蛋白降解研究的经典体系，为了验证ATTEC降解策略的普适性和可行性，我们以BRD4靶点为研究对象，开展BRD4-ATTEC分子设计、合成和蛋白降解活性评价研究。
-
BRD4-ATTEC分子由三部分组成：BRD4抑制剂、连接子Linker和LC3配体。我们选择经典BRD4抑制剂JQ1作为靶蛋白配体，JQ1与BRD4共晶结构如图2A所示。JQ1的酯基部分暴露于溶剂中，适合作为Linker连接位点，不影响BRD4蛋白结合活性[10]；Ispinesib作为LC3配体，由于鲁伯埙团队在进行高通量筛选时，化合物ispinesib的氨基端连接于分子芯片，故选择氨基端作为Linker连接另一位点，不会影响其与LC3蛋白的结合；随后，使用不同长度的烷烃链将两个配体相连设计得到相应目标化合物（图2B、C）。目标化合物通过同时结合BRD4与LC3蛋白，将BRD4靶向至自噬小体中，从而被溶酶体吞噬完成降解。
图 2 BRD4 自噬降解设计
-
化学原料均为市售分析纯；免抗BRD4抗体(Abcam，ab128874)；免抗GAPDH抗体(Abcam，ab181602)；山羊抗免IgG H&L (Alexa Fluor® 680) (Abcam，ab175773)；Bruker AVANCE600（Bruker Company, Germany）核磁共振仪，TMS作为内标，化学位移与偶合常数分别用ppm和Hz表示；Agilent 6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS高分辨质谱（HRMS）仪；上海申光WRR目视熔点仪；Bioteck Synergy2多功能酶标仪；Biorad ChemiDoc成像仪。
-
化合物4的合成路线见图3。
图 3 化合物4合成路线
（S）-5-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）戊酸甲酯（2）的制备：
将JQ1-1（100 mg，0.25 mmol）溶解于二氯甲烷（DCM, 10 ml）中，加入5-氨基戊酸甲酯（1）（39 mg，0.30 mmol）、EDCI（73 mg，0.38 mmol）和HOBT（51 mg，0.38 mmol），室温下反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH = 98∶2），得淡黄色油状液体（2）91 mg，产率71%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.20 (t, J=5.7 Hz, 1 H), 7.48 (d, J=8.8 Hz, 2 H), 7.42 (d, J=8.6 Hz, 2 H), 4.50 (dd, J=8.4, 5.7 Hz, 1 H), 3.57 (s, 3 H), 3.28−3.22 (m, 1 H), 3.19−3.12 (m, 2 H), 3.10−3.03 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (d, J=0.6 Hz, 3 H), 2.33 (t, J=7.4 Hz, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.59−1.53 (m, 2 H), 1.48−1.42 (m, 2 H)。
N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（5-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）戊酰胺基丙基）-4-甲基苯甲酰胺（4）的制备：
将化合物2（91 mg，0.18 mmol）溶于THF-MeOH-H2O（3∶2∶1）混合溶剂（6 ml），加入LiOH（17 mg，0.72 mmol），室温反应5 h后蒸干溶剂，使用1 mol/L稀盐酸调pH至6，过滤，收集固体并干燥，得白色固体49 mg（0.10 mmol）；将所得白色固体（49 mg，0.10 mmol）溶于DCM（15 ml），加入EDCI（29 mg，0.15 mmol）、HOBT（20 mg，0.15 mmol）和ispinesib（0.10 mmol，52 mg），室温反应8 h后，加水（300 ml）稀释，用DCM（100 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=63∶37），得白色固体（4）59 mg（0.06 mmol），两步收率33%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.24 (dd, J=8.6, 3.9 Hz, 1 H), 8.17 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.81 (t, J=1.7 Hz, 1 H), 7.69−7.65 (m, 1 H), 7.50−7.47 (m, 2 H), 7.42 (d, J=8.3 Hz, 2 H), 7.40−7.35 (m, 3 H), 7.34−7.30 (m, 1 H), 7.29−7.20 (m, 6 H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1 H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1 H), 5.06 (d, J=16.3 Hz, 1 H), 4.51 (dd, J=8.1, 5.9 Hz, 1 H), 3.30−3.23 (m, 3 H), 3.20−3.15 (m, 1 H), 3.15−3.09 (m, 1 H), 3.05−2.97 (m, 1 H), 2.79−2.71 (m, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58−2.54 (m, 1 H), 2.49 (d, J=7.0 Hz, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.87−1.76 (m, 2 H), 1.64−1.60 (m, 3 H), 1.40−1.31 (m, 5 H), 0.91 (d, J=6.4 Hz, 3 H), 0.82−0.87 (m, 1 H), 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO−d6) δ: 172.44, 171.88, 169.76, 163.43, 161.57, 155.70, 155.59, 150.23, 147.64, 139.97, 139.11, 137.22, 137.16, 135.64, 134.25, 132.72, 131.14, 130.57, 130.27, 130.02, 129.34, 129.11, 128.91, 128.48, 127.88, 127.11, 126.89, 126.33, 119.55, 59.44, 54.35, 45.61, 42.90, 38.74, 38.11, 36.17, 35.36, 30.71, 29.33, 28.81, 23.06, 21.36, 19.95, 18.61, 14.48, 13.13, 11.75；HRMS(ESI) m/z calcd for C54H56Cl2N9O4S (M-H)− 996.3559, found 996.3542；熔程：143.1～146.3 ℃。
化合物5、6合成路线如图4所示。
图 4 化合物5和6合成路线
（S）-6-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）己酸乙酯（4a）的制备：
将JQ1-1（100 mg，0.25 mmol）溶解于DCM（10 ml），加入化合物6-氨基己酸甲酯（3a，44 mg，0.30 mmol）、EDCI（73 mg，0.38 mmol）和HOBT（51 mg，0.38 mmol），室温反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH=98∶2），得淡黄色油状液体（4a）80 mg，产率59%；1H NMR (600 MHz, DMSO - d6) δ∶8.17 (t, J=5.7 Hz, 1 H), 7.48 (d, J=8.8 Hz, 2 H), 7.42 (d, J=8.6 Hz, 2 H), 4.50 (dd, J=8.3, 5.8 Hz, 1 H), 4.04 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.28−3.22 (m, 1 H), 3.20−3.10 (m, 2 H), 3.08−3.02 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (s, 3 H), 2.26 (t, J=7.5 Hz, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.56−1.50 (m, 2 H), 1.47−1.41 (m, 2 H), 1.34−1.27 (m, 2 H), 1.17 (t, J=7.1 Hz, 3 H)。
（S）-7-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）庚酸乙酯（4b）的制备：
中间体4b的合成步骤参照中间体4a合成，得淡黄色油状液体（4b）99 mg，产率76%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.16 (t, J=5.7 Hz, 1 H), 7.48 (d, J=8.8 Hz, 2 H), 7.42 (d, J=8.4 Hz, 2 H), 4.50 (dd, J=8.4, 5.9 Hz, 1 H), 4.04 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.28−3.22 (m, 1 H), 3.20−3.10 (m, 2 H), 3.08−3.02 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (s, 3 H), 2.26 (t, J=7.4 Hz, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.54−1.47 (m, 2 H), 1.46−1.39 (m, 2 H), 1.31−1.26 (m, 4 H), 1.16 (t, J=7.1 Hz, 3 H)。
N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（6-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）己酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（5）的制备：
将化合物4a（80 mg，0.15 mmol）溶于THF-MeOH-H2O（3∶2∶1）混合溶剂（6 ml），加入LiOH（14 mg, 0.6 mmol），室温反应5 h后蒸干溶剂，使用1 mol/L稀盐酸调pH至6，过滤，收集固体并干燥，得白色固体61 mg（0.12 mmol）；将所得白色固体（61 mg，0.12 mmol）溶于 DCM（15 ml）中，加入EDCI（35 mg，0.18 mmol）、HOBT（24 mg，0.18 mmol）和化合物ispinesib（0.12 mmol，62 mg），室温下反应8 h后，加水（300 ml）稀释，并用DCM（100 ml × 3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=63∶37），得白色固体（5）（64 mg，0.06 mmol），两步收率42%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.23 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 8.17 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.79 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 7.68−7.65 (m, 1 H), 7.49−7.45 (m, 2 H), 7.42 (d, J=7.9 Hz, 2 H), 7.39−7.34 (m, 3 H), 7.33−7.28 (m, 1 H), 7.28−7.19 (m, 6 H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1 H), 5.54 (d, J=10.3 Hz, 1 H), 5.05 (d, J=16.5 Hz, 1 H), 4.51 (dd, J=8.2, 6.1 Hz, 1 H), 3.29−3.21 (m, 3 H), 3.21−3.15 (m, 1 H), 3.14−3.07 (m, 1 H), 3.07−3.00 (m, 1 H), 2.77−2.69 (m, 1 H), 2.60 (d, J=1.3 Hz, 3 H), 2.55−2.52 (m, 1 H), 2.50−2.47 (m, 1 H), 2.41 (s, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 1.83−1.71 (m, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.43−1.37 (m, 2 H), 1.36−1.27 (m, 3 H), 1.22−1.15 (m, 2 H), 0.90 (d, J=6.6 Hz, 3 H), 0.87−0.80 (m, 1 H), 0.48 (d, J=5.9 Hz, 3 H)； 13C NMR (151 MHz, DMSO−d6) δ: 172.45, 171.96, 169.74, 163.43, 161.57, 155.70, 155.60, 150.24, 147.64, 139.96, 139.11, 137.22, 137.16, 135.67, 134.25, 132.71, 131.16, 130.55, 130.27, 130.03, 129.34, 129.11, 128.90, 128.48, 127.88, 127.13, 126.88, 126.33, 119.55, 59.44, 54.36, 45.62, 42.90, 38.89, 38.08, 36.18, 35.70, 30.69, 29.48, 28.81, 26.61, 25.35, 21.36, 19.95, 18.61, 14.49, 13.13, 11.74；HRMS(ESI) m/z calcd for C55H59Cl3N9O4S (M+Cl)− 1046.3482, found 1046.3443；熔程：143.0～145.2 ℃。
N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（7-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）庚酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（6）的制备：
化合物6的合成步骤参照化合物5合成，得白色固体（6）（71 mg，0.07 mmol），两步收率36%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.23 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 8.17 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.79 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 7.66 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H), 7.50−7.46 (m, 2 H), 7.44−7.40 (m, 2 H), 7.40−7.34 (m, 3 H), 7.33−7.28 (m, 1 H), 7.27−7.19 (m, 6 H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1 H), 5.54 (d, J=10.5 Hz, 1 H), 5.05 (d, J=16.3 Hz, 1 H), 4.51 (dd, J=8.3, 6.1 Hz, 1 H), 3.29−3.21 (m, 3 H), 3.21−3.17 (m, 1 H), 3.16−3.09 (m, 1 H), 3.08−3.01 (m, 1 H), 2.77−2.69 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.57−2.53 (m, 1 H), 2.50−2.46 (m, 1 H), 2.41 (s, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 1.84−1.70 (m, 2 H), 1.61 (s, 3 H), 1.44−1.38 (m, 2 H), 1.36−1.28 (m, 3 H), 1.27−1.25 (m, 1 H), 1.23−1.21 (m, 1 H), 1.19−1.12 (m, 2 H), 0.89 (d, J=6.6 Hz, 3 H), 0.87−0.81 (m, 1 H), 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO−d6) δ: 172.45, 172.00, 169.74, 163.44, 161.56, 155.70, 155.60, 150.24, 147.64, 139.95, 139.09, 137.21, 137.16, 135.69, 134.25, 132.71, 131.15, 130.54, 130.26, 130.04, 129.33, 129.11, 128.90, 128.47, 127.88, 127.12, 126.87, 126.32, 119.55, 59.44, 54.37, 45.62, 42.90, 38.90, 38.11, 36.16, 35.67, 30.71, 29.61, 28.89, 28.81, 26.61, 25.53, 21.36, 19.95, 18.60, 14.48, 13.13, 11.74；HRMS(ESI) m/z calcd for C56H61Cl2N9O4SNa (M+Na)+ 1048.3836, found 1048.3892；熔程：142.0～144.7 ℃。
化合物7、8合成路线如图5所示。
图 5 化合物7、8合成路线
（R）-（9-（（3-（N-（1-（3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基）-2-甲基丙基）-4-甲基苯甲酰胺基）丙基）氨基）-9-氧代壬基）氨基甲酸叔丁酯（6a）的制备：
将ispinesib（100 mg，0.2 mmol）溶解于DCM（10 ml）中，加入化合物9-（（叔丁氧基羰基）氨基）壬酸（5a）（66 mg，0.24 mmol），EDCI（58 mg，0.30 mmol）和HOBT（41 mg，0.30 mmol），室温下反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH=98∶2），得淡黄色油状液体（6a）93 mg，产率60%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.22 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 7.77 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 7.65 (dd, J=8.5, 2.1 Hz, 1 H), 7.38−7.31 (m, 3 H), 7.31−7.27 (m, 1 H), 7.26−7.19 (m, 6 H), 6.74 (t, J=5.5 Hz, 1 H), 5.88 (d, J=16.1 Hz, 1 H), 5.53 (d, J=10.5 Hz, 1 H), 5.05 (d, J=16.3 Hz, 1 H), 3.26−3.20 (m, 2 H), 2.87 (q, J=6.7 Hz, 2 H), 2.76−2.68 (m, 1 H), 2.55−2.51 (m, 1 H), 2.49−2.45 (m, 1 H), 2.33 (s, 3 H), 1.81−1.69 (m, 2 H), 1.36 (s, 9 H), 1.33−1.27 (m, 4 H), 1.23−1.15 (m, 7 H), 1.14−1.08 (m, 2 H), 0.89 (d, J=6.8 Hz, 3 H), 0.86−0.80 (m, 1 H), 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3 H)。
（R）-（10-（（3-（N-（1-（3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基）-2-甲基丙基）-4-甲基苯甲酰胺基）丙基）氨基）-9-氧代壬基）氨基甲酸叔丁酯（6b）的制备：
中间体6b的合成步骤参照中间体6a合成，得淡黄色油状液体（6b）82 mg，产率52%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.22 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.78 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 7.65 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H), 7.38−7.28 (m, 4 H), 7.26−7.18 (m, 6 H), 6.75 (t, J=5.5 Hz, 1 H), 5.87 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 5.53 (d, J=10.5 Hz, 1 H), 5.04 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 3.25−3.19 (m, 2 H), 2.87 (q, J=6.4 Hz, 2 H), 2.75−2.68 (m, 1 H), 2.54−2.51 (m, 1 H), 2.49−2.46 (m, 1 H), 2.33 (s, 3 H), 1.81−1.68 (m, 2 H), 1.36 (s, 9 H), 1.34−1.09 (m, 15 H), 0.89 (d, J=6.8 Hz, 3 H), 0.86−0.80 (m, 1 H), 0.47 (d, J=6.2 Hz, 3 H)。
N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（9-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）壬酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（7）的制备：
将化合物6a（93 mg，0.12 mmol）溶于DCM（3 ml）中，加入CF3COOH（1 ml），室温反应4 h后蒸干溶剂，得无色油状液体73 mg（0.11 mmol）；将所得无色油状液体（73 mg，0.11 mmol）溶于DCM（15 ml）中，加入EDCI（31 mg，0.16 mmol）、HOBT（22 mg，0.16 mmol）和化合物JQ1-1（0.11 mmol，44 mg），室温下反应8 h，加水（300 ml）稀释，并用DCM（100 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=68∶32），得白色固体（7）（53 mg，0.05 mmol），两步收率46%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6) δ: 8.24 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 8.19 (t, J=5.5 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 7.67 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H), 7.50−7.47 (m, 2 H), 7.46−7.42 (m, 2 H), 7.40−7.34 (m, 3 H), 7.34−7.29 (m, 1 H), 7.29−7.21 (m, 6 H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1 H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1 H), 5.06 (d, J=16.3 Hz, 1 H), 4.52 (dd, J=8.3, 6.1 Hz, 1 H), 3.30−3.22 (m, 3 H), 3.22−3.17 (m, 1 H), 3.16−3.05 (m, 2 H), 2.77−2.70 (m, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58−2.53 (m, 1 H), 2.51−2.47 (m, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.84−1.71 (m, 2 H), 1.63 (s, 3 H), 1.48−1.41 (m, 2 H), 1.35−1.25 (m, 7 H), 1.23−1.17 (m, 2 H), 1.17−1.11 (m, 2 H), 0.91 (d, J=6.8 Hz, 3 H), 0.88−0.82 (m, 1 H), 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO−d6) δ: 172.45, 172.02, 169.76, 163.41, 161.56, 155.70, 155.59, 150.23, 147.64, 139.94, 139.10, 137.20, 137.15, 135.68, 134.25, 132.71, 131.16, 130.56, 130.25, 130.03, 129.33, 129.11, 128.87, 128.46, 127.87, 127.12, 126.87, 126.33, 119.55, 59.44, 54.38, 45.63, 42.91, 38.91, 38.13, 36.17, 35.73, 30.69, 29.71, 29.23, 29.14, 28.81, 26.85, 25.57, 21.36, 19.96, 18.61, 14.48, 13.12, 11.74；HRMS(ESI) m/z calcd for C58H66Cl2N9O4S (M+H)+ 1054.433, found 1054.4367；熔程：134.7～139.1 ℃。
N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（10-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）癸酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（8）的制备：
化合物8的合成步骤参照化合物7合成，得白色固体47 mg，两步收率49%；1H NMR (600 MHz, DMSO−d6)δ: 8.24 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 8.18 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 7.67 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1 H), 7.50−7.47 (m, 2 H), 7.46−7.42 (m, 2 H), 7.40−7.34 (m, 3 H), 7.34−7.30 (m, 1 H), 7.29−7.21 (m, 6 H), 5.89 (d, J=16.0 Hz, 1 H), 5.55 (d, J=10.6 Hz, 1 H), 5.06 (d, J=16.5 Hz, 1 H), 4.52 (dd, J=8.3, 5.9 Hz, 1 H), 3.30−3.22 (m, 3 H), 3.21−3.16 (m, 1 H), 3.16−3.11 (m, 1 H), 3.11−3.04 (m, 1 H), 2.77−2.70 (m, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58−2.53 (m, 1 H), 2.51−2.47 (m, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.83−1.71 (m, 2 H), 1.63 (s, 3 H), 1.48−1.41 (m, 2 H), 1.35−1.25 (m, 8 H), 1.22−1.19 (m, 3 H), 1.16−1.09 (m, 2 H), 0.91 (d, J=6.8 Hz, 3 H), 0.89−0.82 (m, 1 H), 0.49 (d, J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO−d6) δ: 172.45, 172.02, 169.76, 163.40, 161.56, 155.71, 155.60, 150.23, 147.64, 139.93, 139.10, 137.19, 137.15, 135.69, 134.26, 132.72, 131.16, 130.56, 130.25, 130.04, 129.33, 129.11, 128.87, 128.45, 127.87, 127.12, 126.87, 126.34, 119.55, 59.45, 54.39, 45.63, 42.91, 38.93, 38.15, 36.17, 35.74, 30.69, 29.73, 29.40, 29.27, 29.22, 29.15, 28.81, 26.87, 25.57, 21.36, 19.95, 18.62, 14.48, 13.12, 11.74；HRMS(ESI) m/z calcd for C59H68Cl2N9O4S (M+H)+ 1068.4487, found 1068.4488；熔程：132.9～138.5 ℃。
-
将细胞以4×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h；根据实验需要，选取相应浓度的PAGE凝胶快速制备试剂盒，取40 μg总蛋白及5 μl蛋白marker上样，恒压120 V电泳90 min；然后恒流300 mA 转膜180 min转至PVDF膜上；转膜结束后，根据marker剪下目的条带，配制无蛋白快速封闭液（5×）封闭30 min；用TBST清洗残留封闭液，用5% BSA稀释相应一抗，4 ℃摇床孵育过夜；用TBST 洗膜3次，每次10min；使用荧光兔二抗，室温孵育1 h; 用TBST 洗膜3次，每次5 min；最后在Biorad ChemiDoc成像仪下拍照。
-
蛋白印迹法结果表明，Linker长度与化合物降解活性密切相关，Linker长度为4个碳原子长度时（化合物4），BRD4降解活性最强。化合物4在HCT116、MDA-MB-231、Hela和A549四种肿瘤细胞中均表现出下调BRD4蛋白水平的活性，而其他化合物在10 μmol/L与1 μmol/L浓度下对胞内BRD4蛋白水平均无明显影响（图6）。
图 6 目标化合物降解BRD4蛋白
-
基于ATTEC策略，我们设计并成功合成5个BRD4-ATTEC分子，所有目标化合物均经过了核磁和质谱结构确证，纯度均高于95%。在蛋白降解活性测试中，我们发现化合物4在10 μmol/L浓度下对4种肿瘤细胞均显示出诱导BRD4蛋白降解活性，表现出广谱有效的特征，为后续BRD4自噬降解的设计和结构优化提供了有效的先导化合物。本研究验证了ATTEC策略能有效诱导BRD4蛋白降解，并获得BRD4自噬降解剂先导化合物，拓展了靶向自噬降解的适用范围，后续的结构优化研究尚在进展之中。
Design, synthesis and degradation activity of BRD4-targeting ATTECs
-
摘要:
目的 基于自噬小体绑定化合物（ATTEC）策略，设计并合成靶向BRD4的自噬降解剂，验证其降解活性。 方法 以化合物伊斯平斯(ispinesib)为LC3配体，通过不同长度的linker与化合物JQ1相连，产物结构经1H NMR、13C NMR与 ESI-MS确证，并使用蛋白印迹法(Western Blot)技术测试其在不同细胞系中诱导BRD4的降解活性。 结果 获得5个首次报道的BRD4-ATTEC分子，化合物 4 在不同细胞系中显示出一定的BRD4降解活性。 结论 本研究发现了新型BRD4自噬降解剂，拓展了靶向自噬降解的适用范围。 Abstract:Objective To design and synthesize autophagic degraders targeting BRD4 based on autophagosome tethering compound (ATTEC) strategy and test their BRD4 degradation activity. Methods BRD4-targeting ATTECs were constructed by conjugating ispinesib that used as a LC3 ligand and JQ1 through a variety of alkane linkers. The final compounds were confirmed by 1H NMR, 13C NMR and ESI-MS, and their degradation activity in different cell lines were tested by Western Blot. Results Five BRD4-ATTEC molecules were successfully synthesized for the first time. Compound 4 showed moderate BRD4 degradation activity in different cell lines. Conclusion The novel BRD4 autophagic degraders were discovered, which expanded the applicability of targeted autophagic degradation via ATTEC. -
Key words:
- autophagosome-tethering compounds /
- BRD4 /
- LC3 /
- Ispinesib
-
图 2 BRD4 自噬降解设计
A. BRD4蛋白与JQ1共晶结构（PDB: 3MXF）; B. BRD4-ATTEC自噬降解剂原理; C. BRD4-ATTEC化合物设计
-
[1] SAKAMOTO K M, KIM K B, KUMAGAI A, et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(15):8554-8559. doi: 10.1073/pnas.141230798 [2] LU K F, DEN BRAVE F, JENTSCH S. Pathway choice between proteasomal and autophagic degradation[J]. Autophagy,2017,13(10):1799-1800. doi: 10.1080/15548627.2017.1358851 [3] MIZUSHIMA N, LEVINE B, CUERVO A M, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature,2008,451(7182):1069-1075. doi: 10.1038/nature06639 [4] TAKAHASHI D, MORIYAMA J, NAKAMURA T, et al. AUTACs: cargo-specific degraders using selective autophagy[J]. Mol Cell,2019,76(5):797-810.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.009 [5] NAKAGAWA I, AMANO A, MIZUSHIMA N, et al. Autophagy defends cells against invading group A Streptococcus[J]. Science,2004,306(5698):1037-1040. doi: 10.1126/science.1103966 [6] LI Z Y, WANG C, WANG Z Y, et al. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds[J]. Nature,2019,575(7781):203-209. doi: 10.1038/s41586-019-1722-1 [7] GHOSHAL A, YUGANDHAR D, SRIVASTAVA A K. BET inhibitors in cancer therapeutics: a patent review[J]. Expert Opin Ther Pat,2016,26(4):505-522. doi: 10.1517/13543776.2016.1159299 [8] LU J, QIAN Y M, ALTIERI M, et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4[J]. Chem Biol,2015,22(6):755-763. doi: 10.1016/j.chembiol.2015.05.009 [9] ZENGERLE M, CHAN K H, CIULLI A. Selective small molecule induced degradation of the BET bromodomain protein BRD4[J]. ACS Chem Biol,2015,10(8):1770-1777. doi: 10.1021/acschembio.5b00216 [10] FILIPPAKOPOULOS P, QI J, PICAUD S, et al. Selective inhibition of BET bromodomains[J]. Nature,2010,468(7327):1067-1073. doi: 10.1038/nature09504 -
点击查看大图
图(6)
计量
- 文章访问数: 2685
- HTML全文浏览量: 1008
- PDF下载量: 29
- 被引次数: 0
