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显微鉴定是中药鉴定中利用显微技术对中药进行显微分析，以确定其品种和质量的一种常用鉴定方法，显微制片是其主要的观察对象。组织显微鉴定则是中药显微鉴定最常用的方法之一[1-2]。对于一些动物、植物等组织片，徒手切片是其中最实用的方法之一[3]。使用传统的方法需鉴定员具有很强的显微观察能力，更需操作者有扎实的切片功底。传统的中药显微鉴定切片法是把干药材清水泡软，端在手上，用剃刀或刀片，快速地从水平方向由外向内削下薄片[4-6]。这种切片方法的缺点是：药材前处理耗时，处理软硬程度不易掌握；操作时刀口下方没有硬物抵托，药材容易出现“让”（在刀压迫下弯曲）的情况，难以切到薄而完整的切片。由于传统方法切片困难，导致许多实验室不愿做此项目，故而选择用石蜡切片[7]的方式制片观察鉴定，而石蜡制片需要经过蜡封、固化、切片、脱蜡等步骤，耗时较长[8]，相对来说不适合快速、准确检测中药的要求，影响到药典等标准的使用，基于上述原因，制定标准时在方法上多选择比较容易操作的粉末制片，但粉末制片可以提供的比对信息明显少于切片，影响了鉴定的效率和准确性。冰冻切片技术是一种较为新颖的组织制片方法，它将生物组织置于低温下，迅速冻结达到一定硬度后进行切片。相对于常规的石蜡切片，无需经过脱水、透明、浸蜡等步骤,组织不会收缩，易保持原有生物形态, 具有快速、简便、易操作等优点，但新鲜植物细胞因具有液泡，含水量较大使得在进行低温切片时易形成冰晶，造成植物组织的细胞结构受到伤害。又因为细胞壁的存在使得植物组织在冰冻后硬度变大易破碎，致使多数情况下难以切出结构完整的切片, 并且操作时需要快速冷冻设备及相适应的冰冻切片机，因此该技术在植物组织切片上的应用较少[9]。对于基层工作人员来说，如果能够掌握一种更为简单的切片操作方法，便可事半功倍。为此，笔者对传统切片方法进行了多方面的改革，建立了一种新的切片方法，称之为立式快速徒手切片法，本实验随机选择了亳州中药材市场上几种具有代表性的中药材进行切片操作，以对这一方法的可行性、精确性、操作性、实用性等进行验证。
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显微镜（型号：德国徕卡DM2700P）；飞鹰刀片（上海吉列有限公司）；美工刀片（得力集团）老式剃刀（扬州天艺）。
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纯净水（自制）；水合氯醛、甘油（国药集团）。广金钱草、降香、蔓荆子、山羊角、西河柳、地锦草、碱地蒲公英、益母草等（亳州中药材市场）。
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传统显微切片材料的处理沿用了国外研究植物组织学的工作方法。多采用新鲜植物，即“软”的材料。而中药材的显微鉴定，实验材料是干质药材。把干质材料用锯或小刀做出切面，再用细纹钢锉加以处理使之成平整的截面，药材下垫木板（塑料板、钢板、载玻片等硬质平面），刀口蘸水（蘸水可防止切片滑落）。刀片立起快速切下，切出薄片，切片不黏连（图1A）。
图 1 中药徒手切片示意及其横切面显微图
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广金钱草、西河柳、地锦草、碱地蒲公英等脆质的叶类、草质茎类药材，水浸10 s后，纸巾压平，处理至微软，进行切片操作。蔓荆子、降香、人参等质地较硬的果实种子类、木类及粉质角质类药材，先在表面涂抹些许清水，让其向内浸润，数十秒之后，在已处理材料表面的浸润与未浸润之间切或削下薄片。
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草质茎类药材广金钱草茎，切片制作显微组织片（图1B），非腺毛、薄壁细胞、韧皮部等不同的显微鉴定特征清晰可见，符合显微组织切片要求；茎木类药材降香横切面，降香导管、纤维清晰可见，木射线特征明显，易于观察（图1C）；蔓荆子横切面干材料，制作横切面组织片（图1D），外果皮、中果皮细胞清晰可见；角质类药材山羊角横切面（图1E），角质细胞清晰。
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西河柳茎的横切（图2A），可见为叶半包茎，横切面典型特征为下陷的气孔集中在一侧，为叶所在的位置；草酸钙簇晶集中分布于皮层的内侧，在中柱鞘附近形成连续的纤维束鞘，韧皮部较明显，初生木质部中间无髓，这些特征明显的构造镜下清晰可见，较之《中国药典》(2015年版)收载的粉末鉴定图相比，其精确性、准确性均大大提高，且操作简单。地锦草叶横切面(图2B）可见特有的C-4花环式结构。碱地蒲公英叶横切面(图2C）上表皮叶脉处向上凸起；表皮细胞壁向外加厚，侧壁薄，内侧有1~2层纤维束。益母草叶横切（图2D）可以见到小腺毛主要分布于上表皮，而大的腺鳞主要分布在下表皮。
图 2 立式快速徒手切片实际效果（中药材横切面显微图）
生长年限较长的人参以传统切片法难以得到完整的切片。用本法易于均匀用力，材料不易弯曲和滑动，可切到完整而厚薄均匀的切片 (图2E)，显微镜下可清楚地观察到其次生维管束有3轮，形成层以外的树脂道环有4轮。由此可从两个方面相互印证，确定此人参药材的种植年限为4年。虽然过去通过多张碎片也能得到同样的结论，但有存在偏差的可能性。在实验报告中提供这样完整的照片作为佐证，其鉴定的效力可以明显增加。
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中药显微鉴定是由西方植物解剖学沿用而来。西方植物组织解剖研究多用新鲜材料，中药学家在使用这一技术时就自然想到先把药材泡软，使其重新恢复到新鲜植物的模样。但这个“恢复”实则很难真正做到，在药检工作实践中难以实现。故在显微鉴定时也多选用其粉末显微特征作为鉴定依据，尽管各种横切面显微特征通常都比单纯的粉末在鉴定上更有价值。
在长期的中药显微检验工作实践中，笔者逐渐摸索出了这种简单、易操作、精确性及准确性较高的显微组织制片方法，相对于传统的徒手悬空切片法，创新的切片法区别在于药材下垫有硬木板或塑料板支撑，也可操作在载玻片上，使刀片立起从上往下切。故我们把这种方法称之为“立式切片法”。由于干质药材在刀下不易变形，切出的部分往往更薄、更完整、更便于操作。我们探索出的这种切片制片方法的特点是：①安全，由指甲顶住刀片，避免伤到手指；②便于用力，拇指或中指下压固定药材，便于手指用力也便于控制切片厚度；③操作时材料下垫有硬板，在切片过程中极大程度地保持切片完整不粘连。④实验过程中省去传统徒手切片法材料预处理流程，可在很短的时间内完成切片透化观察的鉴定工作，提高了显微鉴定工作的效率，且简单易学。植物分泌组织切片过程中极易因处理过度而被破坏，但用立式切片法切不同质地、不同药用部位的干质药材均得到较好的结果，故分泌组织的特征得以显现，如广金钱草在韧皮中的黄色分泌物，在降香导管内红棕色分泌物和蔓荆子外果皮细胞的棕色颗粒状物十分明显（图1B、C、D）；山羊角切片中的曲眉样（图1E）构造特点也很突出，这些都为鉴定药材提供了很好的证据。在实验过程中，针对刀片易损、刀片变钝后影响切片效果这一问题，笔者选用价格低廉的刀片，目前市面上各种美工刀与剃须刀非常锋利、价格低廉，这种刀片刀口脆硬，容易崩损变钝，但往往十分锋利。在材料前处理后，仅用数刀即可完成切片工作，在刀片未钝之前就拿到满意的切片。文中笔者并未对立式快速徒手切片法的具体切片姿势进行细致的描述，因切药是个人惯用姿势的体现，在细微操作方面因人而异，只要经过一段时间的练习，找到适合自己的立式徒手切片法即可。
The fast-bare-handed vertical slicing method for dry Chinese herbal medicine
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摘要:
目的 验证中药材立式快速徒手切片法的可行性及操作难易性，并为不同类型药材徒手切片方法提供参考及思路。 方法 选择不同类具有代表性的药材采用立式快速徒手切片法显微制片，观察其切制效果。 结果 实验表明，大多数药材用此方法在几分钟之内就可获得符合检验/检测要求的显微切片。 结论 立式快速徒手切片法迅速有效，简单实用，可广泛用于中药材显微鉴定的徒手切片，且符合《中国药典》关于显微鉴定的要求。 Abstract:Objective To verify the feasibility and maneuverability of fast bare-handed vertical slicing method for dry Chinese herbal medicine, and to provide reference of this method for different types of medicinal materials. Methods Several representative medicinal herbs were randomly selected in the market to make micro-slices using the top-slicing method to observe its cutting effect. Results Experiments showed that microscopic slices can be obtained for most herbs in a few minutes, which can be used for identification and quality testing. Conclusion This method is fast, effective, simple and practical. It meets the requirements of pharmacopoeia for microscopic identification. This method deserves for promotion. -
Key words:
- microscopic identification /
- bare-handed section /
- Chinese herbal medicine
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畲药地稔（地菍）是野牡丹科植物地稔（Melastoma dodecandrum Lour.）的新鲜或干燥全草，临床常用于带状疱疹、盆腔炎、风湿骨痛等病症的治疗，是宫炎平片和紫地宁血散等中成药的重要组成[1]。现代药理学研究[2-3]表明，地稔提取液具有清除氧自由基、抑制人红细胞膜脂质过氧化、提高小鼠血清超氧化物歧化酶活性等作用，有较强的抗氧化活性。常见的抗氧化活性测定方法有1,1-二苯基-2-苦腈基自由基（DPPH）法、2,2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐法、铁离子自由基法等，操作烦琐、费时[4]。近年来，基于DPPH的在线色谱分析法[5]大大提高了抗氧化活性的分析效率，但完成测定仍普遍需要30 min以上的时间。光谱技术具有快速、简便等优势。目前，已有研究将食品的光谱学特征与抗氧化活性直接关联，建立了茶叶、冬枣等抗氧化活性的快速预测方法[6-9]，但采用紫外光谱技术快速预测地稔的抗氧化活性尚未见文献报道。课题组前期已建立了基于近红外光谱的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法[10]。在前期基础上，本研究进一步建立了基于紫外光谱和偏最小二乘（partial least squares, PLS）回归算法的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法，并开发了应用软件。采集待测地稔水提液的紫外光谱后，通过软件中的预测功能可在2 s内得到抗氧化活性的快速预测结果。本研究可为进一步完善地稔抗氧化活性的快速预测方法提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试剂和仪器
DPPH（Sigma-Aldrich公司）。无水乙醇（分析纯，浙江省无锡市展望化工试剂有限公司）。去离子水由Smart2pure超纯水系统制备（Thermo，美国）。共收集10批地稔药材，经浙江省中医药研究院俞忠明副主任中药师鉴定为地稔（Melastoma dodecandrum Lour.），阴干密封保存。紫外光谱采集采用2450系列紫外-可见分光光度仪（岛津，日本）。DPPH自由基清除活性吸光度测定采用SpectraMax 190酶标仪（Molecular Devices，美国）。
1.2 数据采集
称取地稔药材各约5.0 g，分别加入料液比为1∶25～1∶45的去离子水，浸泡30 min，加热回流提取1.5～3.5 h，抽滤后的提取液水浴浓缩后转移至50 ml量瓶，用去离子水定容，共得到34批地稔水提液，采用DPPH法测定其抗氧化活性。地稔水提液的制备条件和抗氧化活性测定方法见文献[10]。
移取地稔水提液40 μl，加入去离子水3960 μl，10000 r/min离心后取上清液，制得样品溶液。用1 cm光程的石英比色皿采集紫外光谱。光谱扫描波长范围为190～600 nm，波长间隔为1 nm，扫描速度为快速。每次分析前用去离子水校正仪器基线。
1.3 数据分析
以抗氧化活性为Y，以紫外光谱矩阵为X，通过留一法交叉验证确定最优主成分数，建立X对Y的PLS回归模型。采用校正集相关系数（Rcal）、拟合均方根误差（RMSEE）、交叉验证均方根误差（RMSEcv）、验证集相关系数（Rval）和预测均方根误差（RMSEP）对模型的准确性和预测能力进行评价[11]。首先，比较不同起始波长和终止波长的建模结果，优化光谱波长范围。继而比较原始光谱和光谱经中心化、标准化、Savitsky-Golay（SG）平滑结合一阶导数、SG平滑结合二阶导数、多源散射校正、标准正则变换等预处理后的建模结果，优化光谱预处理方法。最后，基于最优PLS回归模型开发应用软件。数据处理采用SIMCA-P+软件（版本12.0，Umetrics AB，瑞典）。应用软件开发采用Visual Basic软件（版本6.0，Microsoft，美国）。
2. 结果
2.1 光谱波长范围优化
地稔水提液的抗氧化活性范围为83.4%～98.9%。样品溶液的紫外光谱见图1。随机选择24个样品作为校正集，剩下10个样品作为验证集。采用校正集样品，以抗氧化活性为Y，以190 nm为起始波长，分别以250、280、290、300、400、600 nm为终止波长，将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型，优化终止波长，见图2A。结果表明，以290 nm为终止波长所建模型的RMSEcv最小。以抗氧化活性为Y，分别以190、200、210、220 nm为起始波长，以290 nm为终止波长，将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型，优化起始波长，见图2B。结果表明，当起始波长为200 nm时所建模型的RMSEcv最小。综上所述，本研究选择200～290 nm为最优波长范围。
2.2 光谱预处理方法优化
以抗氧化活性为Y，采用200～290 nm的紫外光谱，比较原始光谱和光谱经不同预处理后的建模结果，优化光谱预处理方法，结果见表1。综合考虑Rcal、RMSEE、RMSEcv等，本研究选择标准化为最优光谱预处理方法。
表 1 基于不同预处理方法的PLS回归结果预处理方法 主成分数 校正集 验证集 校正集相关系数 拟合均方根误差 交叉验证均方根误差 验证集相关系数 预测均方根误差 原始光谱 3 0.716 40.9 40.7 0.567 47.2 中心化 3 0.883 2.23 2.21 0.901 1.83 标准化* 3 0.887 2.20 2.17 0.868 2.08 SG平滑结合一阶导数 3 0.734 40.5 39.0 0.647 44.3 SG平滑结合二阶导数 1 0.756 4.05 4.27 0.786 3.68 多元散射校正 1 0.110 4.50 4.72 0.302 3.77 标准正则变换 1 0.141 4.49 4.66 0.325 3.73 SG平滑结合一阶导数+中心化 3 0.898 2.09 2.13 0.722 3.33 SG平滑结合二阶导数+中心化 3 0.879 2.26 2.47 0.655 3.75 多元散射校正+中心化 1 0.110 4.50 4.41 0.302 3.77 标准正则变换+中心化 1 0.141 4.49 4.34 0.325 3.73 SG平滑结合一阶导数+标准化 1 0.840 95.0 95.4 0.757 91.1 SG平滑结合二阶导数+标准化 4 0.911 2.01 2.18 0.721 3.55 多元散射校正+标准化 1 0.520 3.87 4.03 0.582 3.28 标准正则变换+标准化 1 0.535 3.88 4.02 0.582 3.28 注：*最优PLS回归模型。 2.3 模型应用
采用200～290 nm的紫外光谱，经标准化预处理后建立最优PLS回归模型，校正集预测值与真实值之间的相关图（图3），Rcal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%。基于最优PLS回归模型开发应用软件，将所建预测模型嵌套入软件。软件双击即可打开，操作界面见图4。采用该应用软件，通过2个步骤即可实现待测地稔水提液抗氧化活性的快速预测。步骤1：将待测地稔水提液稀释后，采集紫外光谱，检测波长为200～290 nm。步骤2：通过软件中的预测功能将紫外光谱数据自动代入模型，在2 s内实现地稔水提液抗氧化活性的快速预测。
2.4 方法验证
采用所开发的软件预测验证集样品的抗氧化活性。对比验证集抗氧化活性的预测值和真实值，验证本方法的准确性。验证集预测值与真实值之间的相关图见图3，预测回收率见表2。结果显示，验证集抗氧化活性的预测值和真实值差异较小，Rval、RMSEP分别为0.868、2.08%，平均预测回收率为（100.1±2.3）%，表明该方法的预测准确度较高。
表 2 验证集抗氧化活性的预测回收率（%）编号 预测值 真实值 预测回收率 平均预测回收率 1 91.6 93.1 98.4 100.1±2.3 2 95.2 97.8 97.3 3 94.4 92.9 101.6 4 96.2 92.0 104.6 5 96.5 93.8 102.9 6 83.5 83.4 100.1 7 90.0 89.6 100.4 8 92.1 94.3 97.6 9 85.9 86.6 99.2 10 89.2 90.1 98.9 3. 讨论
地稔是我国的民间常用药，在畲族等少数民族民众中广泛应用，具有较好的临床价值，但仍缺少有效的质量控制方法。现代药理学研究表明，地稔提取液有较强的抗氧化活性，但不同采收时间、不同部位地稔的质量有较大的差异[12-13]。因此，建立地稔抗氧化活性的快速预测方法对其质量控制具有重要意义。
目前，将光谱技术应用于食品、中药等抗氧化活性的快速预测已有较多文献报道[6-9, 14]，但多以近红外光谱为主。紫外光谱是一种基于分子中价电子能级跃迁的电子光谱技术，具有快速、简便、绿色、灵敏度高等优势。目前，紫外光谱技术已广泛应用于中药活性成分的快速预测[15-17]，但在中药抗氧化活性的快速预测方面仍罕见文献报道。课题组前期研究表明，地稔水提液紫外光谱的吸光度与其活性成分没食子酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量具有相关性[11]。另有研究表明，地稔水提液的抗氧化活性与多种活性成分的含量呈浓度依赖性[18]。基于上述结果，推测地稔水提液紫外光谱的吸光度可能与其抗氧化活性具有相关性。鉴于此，本研究通过探索地稔水提液紫外光谱与抗氧化活性的相关性，建立了基于紫外光谱的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法。为了增加模型在不同紫外光谱仪间的适用性，本方法可选择性采用无水乙醇200 nm的吸光度进行校正[11]。采用本方法，抗氧化活性预测值与真实值的Rcal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%，Rval、RMSEP分别为0.868、2.08%，平均预测回收率为（100.1±2.3）%，可为地稔水提液抗氧化活性的快速预测提供依据。
本方法简单、绿色，无需掌握复杂的回归参数和手动计算方法，也不需要耗费有机试剂，只需将待测地稔水提液用去离子水稀释后，采集并存储200～290 nm的紫外光谱，通过所开发的应用软件即可快速得到抗氧化活性的预测结果。本方法分析时间较短（每采集一张紫外光谱的时间小于1 min，软件预测时间小于2 s），而采用常规方法或在线色谱法测定DPPH自由基清除率至少需30 min。本研究可为进一步完善地稔的质量控制方法提供依据。
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[1] 夏四喜, 陈兰君. 显微制片技术在碧桃干鉴定中的应用[J]. 湖北中医杂志, 2011, 33(6):71-72. doi: 10.3969/j.issn.1000-0704.2011.06.053 [2] 陈兰君, 刘俊钢, 张志勇. 显微制片技术在甜茶鉴定中的应用[J]. 湖北中医杂志, 2010, 32(7):72-73. doi: 10.3969/j.issn.1000-0704.2010.07.047 [3] 安丽敏, 安丽华. 中药显微鉴定常用制片方法概述[J]. 哈尔滨医药, 2016, 36(1):78-79. [4] 李正理. 植物制片学[M]. 北京: 科学出版社, 1973. [5] 楼之岑, 李胜华. 中草药性状和显微鉴定法 馆藏[M]. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1997. [6] 康廷国. 中药鉴定学[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2013: 43. [7] 赵中振, 陈虎彪. 中药显微鉴定图典[M]. 福州: 福建科技出版社, 2016: 14. [8] 关正君, 霍艳林. 常见生物显微制片方法的比较研究[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(11):2395-2396. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2006.11.009 [9] 李建霞, 张出兰, 夏晓飞, 等. 植物冰冻切片条件的优化及其与石蜡切片在组织化学应用中的比较[J]. 植物学报, 2013, 48(6):643-650. 期刊类型引用(2)
1. 余秋雨，严冬，刘宇，王守现，高琪. 适用于食用菌担子结构观察的冷冻切片技术. 中国食用菌. 2022(05): 48-52+59 . 
百度学术2. 洪稳稳，周良云，谢若男，刘守金，周建理. 鸭跖草的显微鉴别研究. 安徽中医药大学学报. 2021(02): 82-84 . 百度学术其他类型引用(1)
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