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痛风颗粒是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院名老中医夏涵教授的经典经验方，组方精良，仅由茵陈、连钱草和伸筋草三味中药组成，具有清热利湿、通络的功效，临床多用于治疗痛风性关节炎。在前期研究中发现该方对于缓解患者患处的疼痛有显著的效果[1]。疼痛是一种因组织损伤或潜在的组织损伤而产生的痛苦感觉，它既是机体的一种保护性机制，提醒机体避开或处理伤害，也是临床许多疾病的常见症状。本方组成中单味药的研究发现，茵陈[2]、连钱草和伸筋草[3]均有抗炎镇痛的效果。本研究旨在通过痛风颗粒各有效成分及总有效成分对佐剂性关节炎大鼠模型抗炎镇痛作用机制研究，为中药在镇痛方面的研究提供一定的基础和参考依据。
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健康SD大鼠56只，雄性，SPF级，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(苏)2016-0010。
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茵陈、连钱草、伸筋草按1∶1∶1混合，提取总黄酮、总生物碱和总有机酸，所得各部位质量分数均>50%（上海中医药大学中药所）；茵陈（上海上药华宇药业有限公司，批号：2017121503）；连钱草（批号：171201）、伸筋草（批号：180201）均购自上海同济堂药业有限公司；痛风颗粒（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院委托上海宝龙药业有限公司配制，批号：181001）；苯溴马隆（立加利仙，50 mg/片，德国赫曼大药厂，批号：190612）。
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完全弗氏佐剂（CFA，BioFroxx公司，批号：2203ML010）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号：190920）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素10(IL-10）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒（批号：2019101803）购自武汉益承生物科技有限公司。
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IX71光学显微镜(OLYMPUS)；DNM-9602酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；AC8洗板机（芬兰Thermo Lab systems）；TGL-16M离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；GNP-9080隔水式恒温培养箱（苏州江东精密仪器有限公司）；吉尔森P型移液器(Pipetman)。
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模型组及对照组大鼠，采用完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠模型[4-5]。取弗氏佐剂（每支10 ml），在冰浴下与卡介苗混合，配制成含卡介苗10 mg/ml的水包油乳剂，对大鼠右后足趾皮下进针至踝关节，注射弗氏佐剂0.1 ml致炎，诱导关节炎发生；空白组于相同位置注射0.1 ml生理盐水。
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SD大鼠56只，雄性，体重（180±20）g，随机分为空白组、模型组、总黄酮组、总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组、阳性对照组(苯溴马隆)等7组，每组8只，适应性饲养1周，模型组和对照组进行造模，于造模后第15天开始给药，空白组、模型组每日给予蒸馏水1 ml灌胃；痛风颗粒组给予相当于生药6.88 g/kg的痛风颗粒煎剂；总黄酮组给予相当于生药150 mg/kg的总黄酮提取物；总有机酸组给予相当于生药110 mg/kg的总有机酸提取物；总生物碱组给予相当于生药90 mg/kg的总生物碱的提取物；阳性对照组给予5.25 mg/kg苯溴马隆。每天灌胃一次，连续灌胃30 d。
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在各组大鼠右后足踝关节上同一位置划一标记线，分别于造模前及造模后第15、25、35、45 d测量并记录各组大鼠右后足的标记线以下足容积(ml3)，记录结果，计算足趾肿胀率，[足趾肿胀率=（致炎后足趾体积－致炎前足趾体积）/致炎前足趾体积]。
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造模后第44天，禁食禁水12 h，末次给药2 h后将大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血2 ml测定大鼠血常规。
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将“2.3.2”项下大鼠腹主动脉取血5 ml，静置0.5 h后，4 ℃保存，以3000 r/min，离心10 min，取血清保存于−20 ℃条件下备用。采用ELISA试剂盒测定并计算IL-6、IL-10和TNF-α水平。
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取大鼠踝关节标本置于10%甲醛溶液固定48 h，置于5%稀硝酸溶液，脱钙48 h；在室温下进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后进行HE染色，显微镜下观察大鼠关节组织病理变化。
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采用SPSS 23.0统计软件进行分析，踝关节肿胀实验采用重复测量和多变量过程分析,计量资料比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用最小显著差别（LSD）法，计量资料用平均数±标准差（
$\bar {\rm{x}}$ ±s）表示。 -
由表1所示，与空白组相比，模型组大鼠在造模后第15、25、35、45 天时均有显著性差异(P<0. 01)，提示造模成功。与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒、阳性对照组在第25、35、45 天均具有显著性差异(P<0.01)，提示各治疗组能不同程度减轻弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度。造模后第25天，与痛风颗粒组比较，总生物碱组无显著性差异(P>0. 05)，提示造模后第25天总生物碱组与痛风颗粒全方组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的疗效上相近。造模后第35天，与阳性对照组比较，痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示造模后第35天痛风颗粒组与阳性对照组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的疗效上相近。
表 1 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠踝关节肿胀的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 肿胀率（%） 造模前 造模后15 d 造模后25 d 造模后35 d 造模后45 d 空白组 1.57±0.22 6.43±0.21 8.53±0.47 11.79±0.57 10.93±0.55 模型组 1.47±0.29 74.40±1.33* 77.47±1.59* 72.71±1.23* 61.91±1.53* 总黄酮组 1.53±0.30 75.50±2.04 68.96±1.96#△▲ 61.53±0.97#△▲ 51.91±1.43#△▲ 总有机酸组 1.46±0.28 75.66±2.22 67.56±1.47#△▲ 63.24±1.30#△▲ 49.50±3.43#△▲ 总生物碱组 1.57±0.33 75.76±2.57 57.37±0.93#▲ 52.16±0.67#△▲ 47.93±1.88#△▲ 痛风颗粒组 1.46±0.24 76.01±1.38 57.15±2.59#▲ 48.10±1.23# 43.10±1.10#▲ 阳性对照组 1.49±0.28 74.53±2.77 52.86±1.17# 47.30±0.97# 37.58±1.56# *P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.01，各有效部位群组与痛风颗粒组比较；▲P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 -
由表2所示，痛风颗粒各有效部位群对致炎大鼠血液中白细胞计数（WBC）影响结果提示，总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组及阳性对照组大鼠血液中白细胞计数有下降的趋势，但与模型组比较，无显著性差异(P>0.05)。痛风颗粒各有效部位群对致炎大鼠血液中中性粒细胞百分比（N%）的影响结果提示，总黄酮组、痛风颗粒组和阳性对照组大鼠血液中中性粒细胞百分比含量有下降的趋势，但与模型组比较，无显著性差异(P>0.05)。
表 2 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血液中白细胞计数及中性粒细胞百分比的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 WBC（×109/L） N（%） 空白组 4.45±0.40 28.05±5.30 模型组 5.52±0.75 31.17±4.41 总黄酮组 5.13±1.67 26.80±3.31 总有机酸组 4.70±1.07 29.05±5.95 总生物碱组 4.62±1.51 29.63±7.00 痛风颗粒组 4.52±0.87 26.35±4.82 阳性对照组 4.48±0.92 26.32±2.62 -
由表3所示，与空白组比较，模型组对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的含量有显著性差异，有统计学意义（P<0.01），提示造模成功。与模型组比较，各组均有显著性差异（P<0.05，P<0.01），提示痛风颗粒各有效部位群能显著降低模型大鼠的血清IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平。大鼠血清IL-6、TNF-α水平与阳性对照组比较，总黄酮组、总有机酸组和总生物碱组有显著性差异（P<0.05，P<0.01），痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示痛风颗粒组降低大鼠血清IL-6、TNF-α水平与阳性对照组相似。大鼠血清IL-10水平，与阳性对照组比较，总黄酮组、总有机酸组有显著性差异（P<0.01），总生物碱组和痛风颗粒组无显著性差异(P>0.05)，提示总生物碱组和痛风颗粒组在升高IL-10水平上与阳性对照组疗效相似。
表 3 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L） IL-10（ng/L） 空白组 96.46±14.39 57.96±6.68 62.93±2.10 模型组 191.58±9.04** 136.03±9.16** 34.29±2.98** 总黄酮组 141.04±12.45##△△ 98.37±6.46##△△ 37.87±3.43#△△ 总有机酸组 154.11±9.47##△△ 97.59±5.18##△△ 38.07±5.55#△△ 总生物碱组 110.65±7.40##△ 85.33±8.06##△△ 50.62±1.97## 痛风颗粒组 98.84±8.55## 65.14±4.96## 48.15±2.97## 阳性对照组 97.35±13.63## 58.95±8.61## 47.63±1.88## **P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 -
由图1所示，正常组大鼠骨、骨关节、滑膜组织未见明显病理性改变，滑膜组织结构清晰，无炎性细胞浸润。模型组骨关节表面软骨破坏，大量纤维组织增生、滑膜增生，炎细胞浸润。与模型组比较，总黄酮组骨关节表面软骨破坏、纤维组织增生减轻、滑膜水肿；总有机酸组骨关节表面软骨破坏和纤维组织增生减轻；总生物碱组骨关节表面软骨破坏，纤维组织增生减轻；痛风颗粒组骨关节软骨无异常，滑膜细胞增生和周围软组织炎症减轻；阳性对照组骨关节表面软骨破坏和纤维组织增生减轻，滑膜仅有轻度增生。
图 1 各组大鼠关节组织病理形态学(HE×200)
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痛风是一组嘌呤代谢异常的疾病，其临床特征多表现为关节红肿，疼痛难忍，且多反复性发作[6]。在中医学中类似于“痹证”“历节”等病症，多为因内伤气血亏虚，外感风寒湿邪，以致痰瘀流注筋脉，久病入络，痹阻关节所致[7]。痛风颗粒中以茵陈作为君药，有通利关节、清利湿热的功效；臣药连钱草，具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿的功效，取其消石之功，防止痛风性尿路结石的产生；伸筋草有除湿消肿、舒筋活络的功效。三药配伍可以增强清利湿热、通络的作用。
本研究结果显示，痛风颗粒及其各有效部位群能明显抑制佐剂性关节炎大鼠的踝关节肿胀，用药25 d后，总生物碱组对大鼠肿胀率的抑制率与痛风颗粒全组方组接近，研究表明伸筋草中的生物碱类主要有石松碱(lycopodine)型、石松定碱(lycodine)型和法氏石松碱(fawcettimine)型三种[8]，可通过免疫调节机制对佐剂性关节炎发挥治疗作用[9]，这与课题组对伸筋草中生物碱的研究结果相一致[10]。用药第35天，痛风颗粒组与阳性对照组在缓解弗氏佐剂关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的作用上相似，这与痛风颗粒在临床使用的结果相一致[11]。用药45 d后，痛风颗粒及其有效部位群均能不同程度降低弗氏佐剂关节炎大鼠的关节肿胀，关节炎的病理变化表现在滑膜细胞的炎性浸润，各治疗组病理形态学结果提示痛风颗粒组和阳性对照组能减轻滑膜细胞增生，总黄酮组、总有机酸组和总生物碱组能减轻纤维组织增生，这与关节肿胀实验结果相一致，提示痛风颗粒及其有效部位群对弗氏佐剂关节炎大鼠具有抗炎镇痛的作用。
各组关节炎大鼠白细胞计数及中性粒细胞百分比无显著性差异，但经痛风颗粒及其各有效部位群干预后，均有不同程度的下降趋势。这可能是由于WBC和N%的测定在造模后第45天进行，大鼠的炎症反应有所降低，而致该炎性指标不敏感，在今后的实验设计中宜进一步进行分时检测。
当痛风由急性期转变为慢性期时，会出现关节损害[12]。其机制可能与破骨细胞数量增多有关[13]，核转录因子-κB受体（RANK）与核因子κB活化因子配体（RANKL）结合情况对破骨细胞的生成具有密切的联系[14]。促炎细胞因子如IL-6有致痛和痛觉增敏的作用，在痛风时和间质浸润中表达增高，可导致痛风性关节炎的加重；促炎因子TNF-α是关节炎早期的关键调控因子，其水平升高能引起滑膜炎症和关节破坏[15]；抗炎因子IL-10具有抑制促炎细胞因子的产生[16]及下调促炎因子受体表达的作用。因此，降低血清TNF-α、IL-6[17]，升高IL-10含量能减弱对疼痛传入神经系统的刺激，达到抗炎镇痛的作用。本研究采用ELISA法测定血清TNF-α、IL-6和IL-10分泌水平，模型组大鼠的TNF-α、IL-6水平显著升高、IL-10水平显著降低，各治疗组能抑制TNF-α、IL-6的分泌，促进IL-10的生成，从而减少关节的炎症产生和减轻关节组织的破坏。结果表明痛风颗粒及其有效部位群可能通过促炎因子及上调抗炎因子达到保护关节的作用。其中痛风颗粒组和阳性对照组在抑制TNF-α、IL-6分泌的程度相当，表明痛风颗粒全方组的抑制促炎因子作用优于各有效部位群。生物碱组和痛风颗粒组在上调IL-10的作用程度相当，说明生物碱的上调抗炎因子作用与全方组相当。有研究表明，生物碱类成分能够激活NF-κB信号通路，促使其进入调控下游靶基因如IL-10发挥抗炎作用[18]。
综上所述，痛风颗粒及其有效部位群能通过调控IL-6、TNF-α和IL-10水平来降低炎性因子，达到抗炎镇痛，缓解痛风性关节炎的作用。痛风颗粒的调控要优于各有效部位群，其中总生物碱在调控IL-10水平上不劣于痛风颗粒，但其作用机制较为复杂，有待进一步探究。
Study on the anti-inflammatory and analgesic effects of active fractions of Tongfeng granule on arthritis rats
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摘要:
目的 通过痛风颗粒各有效部位群对完全弗氏佐剂诱导的关节炎大鼠抗炎镇痛作用差异，探讨痛风颗粒及其各有效部位群可能的抗炎镇痛作用机制。 方法 将健康SD大鼠56只，随机分为空白组、模型组、总黄酮组、总有机酸组、总生物碱组、痛风颗粒组和阳性对照组，除空白组外，其余6组均建立关节炎的病理模型。造模成功15 d后，连续灌胃给药30 d。测定关节炎大鼠的踝关节肿胀、白细胞计数、嗜中性粒细胞百分比、血清白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及关节组织病理形态学。 结果 与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组的踝关节肿胀率均显著下降（P<0.01）。痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组能减轻纤维组织增生，与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组的血液中白细胞计数（WBC）和中性粒细胞百分比（N%）无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，痛风颗粒各有效部位群、痛风颗粒及阳性对照组能显著降低模型大鼠的血清IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平（P<0.05，P<0.01）。 结论 该研究明确了痛风颗粒有效部位群的抗炎镇痛作用，为进一步临床用药和制剂开发提供依据。 Abstract:Objective To investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of the active fractions of Tongfeng granules on rats with arthritis induced by complete Freund's adjuvant. Methods 56 SD rats were randomly divided into seven groups, blank group, model group, total flavonoids group, total organic acid group, total alkaloid group, Tongfeng granule group and positive control group. Except for the blank group, the remaining 6 groups established joints pathological model of inflammation. 15 days after the successful modeling, intragastric drug administration was continued for 30 days. The swelling of ankle joint, WBC, N%, IL-6, IL-10, TNF-α and the histopathology of joint were measured. Results Comparing with the model group, each effective fraction group of Tongfeng granules, Gout granules and positive control group decreased the ankle joint swelling rate significantly (P<0.01) and reduced fibrous tissue proliferation. There was no significant difference in WBC and N% of neutrophils. They significantly reduce the level of serum IL-6 and TNF-α, and increase the level of IL-10 (P<0.05, P<0.01). Conclusion This study clarifies the anti-inflammatory and analgesic effects of active fractions of Tongfeng granules and provides a basis for further clinical medication and preparation development. -
Key words:
- gout granule /
- active fractions /
- anti-inflammation /
- analgesia
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紫茶生长于非洲肯尼亚海拔1 500～2 000 m的地区，主要成分为多酚类物质。现代药理研究表明，天然植物中的多酚具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]、抗衰老[4]等功效。课题组前期研究发现，紫茶提取物中多酚的纯度不高，直接影响相关制剂的开发。近年来，大孔吸附树脂的应用越来越广泛，尤其是在天然药物有效成分分离和纯化方面具有显著优势[5-8]。本实验以紫茶为研究对象，探索大孔吸附树脂对紫茶总多酚的纯化工艺，以期制备出纯度较高的紫茶总多酚，为其进一步开发利用提供理论依据。
1. 仪器与试药
UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；AUX220型电子分析天平（精度：0.1 mg，日本岛津）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏金坛市友联仪器研究所）。KQ-500B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
肯尼亚紫茶（批号：20181030，火烈鸟茶叶有限公司）；没食子酸对照品（批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院）；铁氰化钾（温州市化学用料厂）；ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；氯化铁、盐酸、乙醇等试剂（西陇科学股份有限公司），以上试剂均为分析纯，水为纯化水。5种大孔吸附树脂的物理参数详见表1。
表 1 5种型号大孔吸附树脂物理参数型号 外观 极性 粒径（l/nm） 比表面积（m2/g） 平均孔径（l/μm） ADS-17 白色不透明球状颗粒 氢键 0.3～1.25 90～150 25～30 D101 白色半透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 480～520 25～28 D301 浅黄色半透明球状颗粒 中极性 0.3～1.25 550～600 48～58 AB-8 白色不透明球状颗粒 弱极性 0.3～1.25 480～520 130～140 X-5 白色不透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 500～600 290～300 2. 方法与结果
2.1 紫茶总多酚的含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品28.4 mg，置于100 ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀制备成母液。精密吸取1 ml母液置10 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度为28.4 μg/ml的对照品溶液，置于冰箱中2～8 ℃避光保存。
2.1.2 供试品溶液的制备
称取紫茶粉末5.0 g，置于圆底烧瓶中，加入50%乙醇500 ml，加热回流提取30 min，放冷至室温，将药液滤过除去沉淀，滤液用50%乙醇补足减失的重量并稀释至500 ml。精密吸取1 ml稀释液，置于100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
2.1.3 线性关系及方法学考察
分别精密吸取浓度为28.4 μg/ml的没食子酸对照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0和1.2 ml于25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe（CN）6]溶液2.0 ml和0.1 mol/L HCl溶液0.5 ml，用纯化水稀释至刻度，摇匀，于室温下避光放置60 min。以相应试剂为空白，在775 nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，以吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.769 9X+0.027 3（r=0.999 7），表明没食子酸浓度在0.227～1.363 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。方法学考察结果表明，专属性良好，平均回收率为100.28%，RSD为2.09%；精密度和重复性试验的RSD小于3%。显示本方法准确可靠。
2.2 大孔吸附树脂的预处理
取5种不同型号的大孔吸附树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分溶胀，将浸泡后的树脂装柱，用95%乙醇以5 ml/min的体积流量冲洗，直至流出液澄清，之后用2倍体积的4%盐酸溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，再用2倍体积的5%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，最后用95%乙醇浸泡保存，临用时以5 ml/min体积流量的纯化水冲洗至中性。
2.3 静态吸附行为考察
2.3.1 大孔吸附树脂的筛选
取预处理后的ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共5份，置于50 ml具塞磨口锥形瓶中。加入质量浓度为50 μg/ml（以多酚含量计）的紫茶总多酚提取液20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附24 h。吸附结束后，滤过，取续滤液按照“2.1”项下方法测定总多酚的含量，计算各树脂在30 ℃下对紫茶总多酚的吸附量和吸附率。然后，将上述吸附饱和的大孔树脂取出，用纯化水清洗后，分别加入70%乙醇20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡24 h，进行静态解吸，计算其解吸率，结果见表2。计算公式如下：
表 2 不同类型大孔树脂对紫茶总多酚的静态吸附率和解吸率树脂型号 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 解吸量（μg/g） 解吸率（%） ADS-17 554.9 68.98 459.0 82.72 D101 621.6 77.74 341.4 54.93 D301 817.4 100.00 107.4 13.14 AB-8 701.8 82.20 598.2 86.73 X-5 727.8 89.90 600.8 81.13 吸附量=（C0−C1）V1/M
吸附率=（C0−C1）/C0
解吸量= C2 V2/M
解吸率=C2 V2/[（C0−C1）V]
其中，C0、C1为吸附前和吸附后吸附液中多酚的质量浓度，C2为解吸附后多酚的质量浓度，V1和V2分别为吸附液和解吸液体积，M为大孔树脂的质量。
由表2结果可知，大孔树脂D301对紫茶总多酚具有较强的吸附效果，其吸附率达到100%，其余4种树脂的吸附率从高到低依次是X-5、AB-8、D101、ADS-17。由此可见，不同类型的树脂对紫茶总多酚的吸附性能各不相同。这可能是由于树脂的内部结构、分子极性以及多酚的溶解度等对树脂吸附多酚能力的影响。多酚由于分子中酚羟基的存在，其分子极性较低，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。采用50%的乙醇进行解吸，可以看出5种树脂的解吸率差异较大，AB-8树脂的解吸效果最好，解吸率达86.73%，X-5树脂次之。综合紫茶总多酚提取液的静态吸附和解吸试验，AB-8型树脂和X-5型树脂对紫茶总多酚的吸附效果和解吸效果均较好，而AB-8型树脂价格相对低廉，从节省成本的角度考虑，优先采用AB-8型树脂对其进行纯化。
2.3.2 静态吸附和解吸曲线的绘制
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共15份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，加入质量浓度为50 μg/ml的紫茶总多酚提取液20 ml，在25 ℃水浴的条件下振荡吸附12 h，每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的吸附率，绘制静态吸附动力学曲线。然后，采用静态解吸试验的方法处理已吸附结束的树脂，进行静态解吸动力学试验，同样每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的解吸率，绘制静态解吸动力学曲线，结果见图1。
由图1可知，在测定的时间点内，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附量随着时间的延长而逐渐增多，经过2.5 h以后，树脂对紫茶总多酚的吸附量趋于平衡，对应的吸附率为88.27%。在0～5 h内，树脂的解吸率呈上升趋势，并在4 h达到最大值84.86%，在随后的时间里，解吸率随着时间的延长变化不大。
2.3.3 吸附液pH值对吸附率的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂1 g，精密称定，共7份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，分别加入质量浓度为50 μg/ml并用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8的紫茶总多酚提取液，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附2.5 h，测定吸附液中紫茶总多酚的质量浓度，计算吸附率，结果见表3。
表 3 pH值对紫茶总多酚吸附率和解吸率的影响pH值 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 2 702.4 89.79 3 712.4 90.79 4 700.3 87.77 5 706.3 89.07 6 652.5 85.71 7 641.7 83.19 8 558.4 71.54 由表3可知，吸附液pH值对紫茶总多酚的吸附率有较大影响。在pH值为2时，AB-8型大孔吸附树脂对此质量浓度下的紫茶总多酚吸附率达89.79%。因此，确定上样液的pH值为2。
2.4 动态吸附行为考察
2.4.1 泄露曲线的绘制
取预处理后的AB-8型树脂10 g，精密称定，室温下将质量浓度为250.0 μg/ml（调至pH为2）的紫茶总多酚提取液（供试品溶液用水稀释）以1.0 ml/min体积流量湿法加至树脂柱中，分段收集流出液，流出液每20 ml收集1份，测定吸光度，计算对应的总多酚含量，绘制泄露曲线。当流出液中总多酚的质量浓度达到上样液质量浓度的1/10，达到泄露点，认为此时为最佳上柱体积，结果见图2。在第2份流出液时，紫茶总多酚已经开始泄露，在第3份流出液中，总多酚的质量浓度为26.5 μg/ml，达到上样液质量浓度的1/10，因此选择上柱体积为60 ml，即3 BV。
2.4.2 上样液质量浓度的影响
取预处理好的AB-8型树脂10 g，精密称定，装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，共5份，分别加入质量浓度为250、375、500、625、750、1 000 μg/ml的上样液（pH为2）各60 ml（3 BV），以1.0 ml/min的流速上柱，收集流出液，按“2. 1”项下方法测定总多酚含量，计算各质量浓度下的吸附率，确定最佳上样质量浓度。结果显示，各上样质量浓度下的吸附率分别为74.50%、77.56%、69.77%、60.59%、56.73%、43.61%。由此可见，上样液质量浓度对大孔吸附树脂吸附性能有显著影响，在考察范围内吸附率总体呈现出先上升后下降的趋势。当质量浓度小于375 μg/ml时，随着上样液质量浓度增加，动态吸附率呈现上升的趋势；分析原因可能是在此较低的浓度范围内，紫茶多酚有较大的机会与大孔树脂的内表面接触，进而加速扩散至树脂孔道内，形成吸附作用。而当质量浓度大于375 μg/ml时，随着质量浓度继续增加，位于孔道内的紫茶总多酚分子的扩散运动受到抑制，导致树脂对多酚的吸附能力降低。因此，选择上样液质量浓度为375 μg/ml。
2.4.3 上样液体积流量的影响
取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×20 cm的层析柱中，共4份，轻敲柱壁，使柱内树脂平衡，打开下端阀门，控制体积流量使柱内纯化水流出，在液面距树脂1 cm时，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2，上样量为3 BV）分别以1.0、2.0、3.0、4.0 ml/min的体积流量上柱，同时收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳上样体积流量。结果显示，吸附率分别为79.37%、79.78%、72.73%、64.73%，当上样体积流量为2.0 ml/min时，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附率最大，故选择上样体积流量为2.0 ml/min。
2.4.4 径高比对动态吸附性能的影响
取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×40 cm的层析柱中，分别设置径高比（柱直径与树脂填充高度比值）为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2）分别以2.0 ml/min的体积流量上柱，对应的药液上样量分别为3、4.5、6、9 BV，收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳径高比。结果显示，吸附率分别为79.81%、78.37%、76.73%、68.54%。径高比1∶6和1∶9对吸附率影响不大。此后，在考察范围内，随着径高比值的降低，吸附率也呈现下降的趋势，可能是由于树脂层过高导致上样液穿透能力差所致。
2.4.5 洗脱剂体积分数的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，共5份，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱（径高比为1∶6，下同），将质量浓度为375 μg/ml上样液（调节pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，分别用纯化水及25%、50%、75%、90%乙醇溶液各3 BV以1.0 ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定其吸光度，计算解吸率，确定最佳洗脱剂体积分数。结果：解吸率分别为17.52%、62.96%、91.04%、81.41%、84.67%，由此可见，50%乙醇对紫茶总多酚的解吸作用最强，故选择洗脱剂的体积分数为50%。
2.4.6 洗脱剂用量的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml的上样液（pH为2）3 BV以2 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇以1.0 ml/min的流速进行洗脱，洗脱溶剂用量分别为1、2、3、4、5 BV，收集洗脱液，测定其吸光度，计算洗脱率，确定最佳洗脱剂用量。结果：解吸率分别为54.68%、83.37%、90.29%、91.48%、91.45%，表明当50%乙醇用量在1～3 BV时，随着用量的增加，对紫茶总多酚的解吸率呈上升的趋势，随后继续增加洗脱剂的用量，解吸率不再增加，表明此时树脂上吸附的总多酚已被充分洗脱，没有必要再增加洗脱剂的用量，故确定洗脱剂的用量为4 BV。
2.4.7 洗脱剂体积流量对洗脱效果的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml上样液（pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇溶液4 BV分别以1.0、2.0、4.0、6.0 ml/min的体积流量进行洗脱，计算解吸率，确定最佳体积流量。结果：对应的解吸率分别为92.47%、93.76%、91.97%、85.18%，表明紫茶总多酚的洗脱率随着洗脱体积流量的加大先升高后减小，故选择最佳洗脱体积流量为2 ml/min。
2.5 最佳工艺的验证
称取4份预处理后的大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm层析柱中（径高比为1∶6），将紫茶提取物预先用石油醚（60～90 ℃）除去脂溶性色素，参考“2.1.2”项下方法加水稀释以制备浓度为375 μg/ml（pH为2）的紫茶总多酚溶液3 BV（总多酚质量为22.5 mg，质量分数40.2%，干膏56.0 mg），并以2 ml/min体积流量上样，待吸附饱和后，先用3 BV水去除杂质，然后用50%乙醇溶液4 BV以2 ml/min的体积流量洗脱，分别收集洗脱液，按照紫茶总多酚定量测定方法，计算总多酚洗脱量及洗脱率，再将洗脱液水浴蒸干，低温烘至恒重，计算干膏的量；精密称取干膏适量，测定总多酚的含量。结果见表4。
表 4 纯化工艺验证结果编号 加入量
（m/mg）纯化前 洗脱量
（m/mg）洗脱率
（%）纯化后 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 平均质量分数（%） RSD（%） 1 22.5 56.0 40.2 20.8 92.4 29.4 70.7 69.8 1.27 2 21.0 93.3 30.6 68.6 3 20.9 92.8 30.0 69.7 4 20.6 91.6 29.4 70.1 由纯化工艺验证结果可见，经过4次验证试验，50%乙醇洗脱条件下总多酚的平均洗脱率为92.5%，紫茶总多酚干膏量由56.0 mg减少至平均29.9 mg，质量分数从40.2%升至平均69.8%，表明建立的纯化工艺对紫茶总多酚有较好的分离、纯化效果。
3. 讨论
大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，目前已广泛应用于中药的活性成分如黄酮、皂苷、生物碱及多酚等成分的分离与纯化。其中，目前采用大孔树脂对多酚类成分进行纯化的有天麻总多酚[9]、白簕叶总多酚[10]、过岗龙总多酚[11]、茶梗中茶多酚[12]等，这都提示了大孔树脂精制多酚类有效成分的可行性。影响大孔树脂的分离纯化有多方面的因素，在选择合适的大孔树脂时，应综合考虑各种影响因素，如树脂的极性、比表面积以及上样液的质量浓度、洗脱液浓度等，以获得最佳的分离效果。在利用大孔树脂纯化时，应尽量滤去上样液中的沉淀，这样既能提高总多酚的纯化率，也能提高树脂的使用寿命。本研究中的样品采用50%乙醇提取后用纯化水进行稀释，当样品溶于水中时，由于多酚类物质能被大孔树脂吸附，而色素及多糖等物质不能吸附而被洗脱掉。而在改为乙醇洗脱时，树脂的吸附效果减弱，被吸附的多酚能被乙醇洗脱。
本研究通过对5种不同型号的大孔吸附树脂的吸附和解吸进行考察，确定了AB-8型大孔吸附树脂纯化紫茶总多酚的最佳工艺条件，为该产品的进一步开发奠定了基础。
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表 1 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠踝关节肿胀的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 肿胀率（%） 造模前 造模后15 d 造模后25 d 造模后35 d 造模后45 d 空白组 1.57±0.22 6.43±0.21 8.53±0.47 11.79±0.57 10.93±0.55 模型组 1.47±0.29 74.40±1.33* 77.47±1.59* 72.71±1.23* 61.91±1.53* 总黄酮组 1.53±0.30 75.50±2.04 68.96±1.96#△▲ 61.53±0.97#△▲ 51.91±1.43#△▲ 总有机酸组 1.46±0.28 75.66±2.22 67.56±1.47#△▲ 63.24±1.30#△▲ 49.50±3.43#△▲ 总生物碱组 1.57±0.33 75.76±2.57 57.37±0.93#▲ 52.16±0.67#△▲ 47.93±1.88#△▲ 痛风颗粒组 1.46±0.24 76.01±1.38 57.15±2.59#▲ 48.10±1.23# 43.10±1.10#▲ 阳性对照组 1.49±0.28 74.53±2.77 52.86±1.17# 47.30±0.97# 37.58±1.56# *P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.01，各有效部位群组与痛风颗粒组比较；▲P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。 
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表 2 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血液中白细胞计数及中性粒细胞百分比的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 WBC（×109/L） N（%） 空白组 4.45±0.40 28.05±5.30 模型组 5.52±0.75 31.17±4.41 总黄酮组 5.13±1.67 26.80±3.31 总有机酸组 4.70±1.07 29.05±5.95 总生物碱组 4.62±1.51 29.63±7.00 痛风颗粒组 4.52±0.87 26.35±4.82 阳性对照组 4.48±0.92 26.32±2.62
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表 3 痛风颗粒及其各有效部位群对弗氏佐剂致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的影响(n=8，
$ {\rm{\bar x}} \pm {\rm{s}}$ )组别 IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L） IL-10（ng/L） 空白组 96.46±14.39 57.96±6.68 62.93±2.10 模型组 191.58±9.04** 136.03±9.16** 34.29±2.98** 总黄酮组 141.04±12.45##△△ 98.37±6.46##△△ 37.87±3.43#△△ 总有机酸组 154.11±9.47##△△ 97.59±5.18##△△ 38.07±5.55#△△ 总生物碱组 110.65±7.40##△ 85.33±8.06##△△ 50.62±1.97## 痛风颗粒组 98.84±8.55## 65.14±4.96## 48.15±2.97## 阳性对照组 97.35±13.63## 58.95±8.61## 47.63±1.88## **P<0.01，模型组与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，各治疗组与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，痛风颗粒及各有效部位群组与阳性对照组比较。
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