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肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是以肝内细胞外基质（extracellular matrix protein，ECM）过度沉积和纤维瘢痕形成为特征的慢性肝病，在世界范围内具有较高的发病率和病死率，持续发展导致肝硬化、肝癌的发生[1]。肝纤维化发病机制复杂，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病等均可能导致慢性肝炎症，并最终导致肝纤维化[2]。然而，除肝移植外，目前尚无有效治疗肝纤维化的方法，针对肝纤维化早期识别和治疗对于预防相关负面后果至关重要。鉴于肝脏是人体最大的器官和主要代谢枢纽，探讨肝纤维化的代谢特征有望发现新的标志物和治疗靶点。
二氢丹参酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中药丹参中的亲脂性成分，被认为是一种潜在的治疗肝纤维化的药物，其肝脏保护作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物学功能已多次报道[3-5]。在本课题组前期扶正化瘀方抗肝纤维化机制研究中发现DHI是扶正化瘀胶囊的重要药效物质基础，也在细胞活性实验中证明其能显著抑制细胞活性发挥抗肝纤维化作用[6]。然而，DHI对肝纤维化治疗作用的体内药效及机制尚不明确。本研究利用肝脏代谢组学方法研究肝纤维化密切相关的生物标志物，探索肝纤维化相关病理过程，同时采用DHI进行干预，研究其对肝纤维化的治疗作用及作用机制，为肝纤维化早期诊断、有效治疗提供科学依据。
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METTLER AE240 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17台式冷冻离心机 (Thermo Fisher，美国)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒实验仪器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪、Agilent 6538 Q-TOF/MS 质谱仪、Micro17高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美国)。
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DHI（纯度 98%，上海一飞生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，东京化成工业株式会社)；甲醇、乙腈（均为色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，ROE scientific INC，美国）；水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。
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SD大鼠，雄性，质量(200～250 g)，共28只，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养于海军军医大学实验动物中心，遵循动物实验的标准操作规范。饲养条件：温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜交替循环的条件下笼养。
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将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组，每组7只。24 h适应性饲养后，除正常组外，模型组及不同用药剂量干预组每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持续给TAA造模8周；同时，自第5周起，按照给药剂量持续给药4周：正常组、模型组，每日给予生理盐水10 ml/kg；DHI低剂量组，每日给予DHI15 mg/kg；DHI高剂量组，每日给予30 mg/kg。
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最后一次给药24 h后，采用脊椎脱臼法处死大鼠。快速切除肝脏后，用0 ℃生理盐水冲洗并立即放于液氮中快速冷冻，储存于−80 ℃冰箱直至分析。
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将冻存的肝脏组织置于室温自然解冻，取约100 mg肝脏样本于匀浆管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分匀浆至没有纤维颗粒，4 ℃离心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的离心管中，氮气吹干。在上述氮气吹干的样品残渣中加入300 μl含内标甲醇涡旋30 s（内标为L-2-氯苯丙氨酸，浓度为5 μg/ml），每个样品取10μl混匀作为质量控制样品。
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色谱条件：Agilent 1290 Infinity UHPLC，色谱柱：Waters XSelect HSS T3 column色谱柱，柱温：30 ℃；进样量：3 μl；流动相A：含0.1 %甲酸的水，流动相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脱条件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。质谱条件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，离子源：电喷雾（ESI）离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度：350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；碎裂电压：120 V；毛细管电压：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。
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将采集的质谱数据转换为mzData格式文件，然后通过R软件XCMS程序将质谱数据转化为含有保留时间、质核比、峰强度的数据矩阵。保留频数超过80%的质核比数据，并对所有峰面积以内标峰面积和肝组织质量进行归一化处理。
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将上述获得的二维矩阵列表导入SIMCA 14.1软件中进行多元统计分析，采用正交偏最小二乘判别分析研究各组间差异，并得到变量VIP值。正常组和模型组组间比较采用独立样本t检验，采用VIP>1，且选择差异具有显著性（P<0.05）的变量作为潜在的差异代谢物，然后检索数据库（HMDB、METLIN、KEGG数据库），筛选出潜在的差异代谢物。
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使用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，组间数据采用单因素方差分析（ANOVA），两组样本分析采用独立样本t检验，分析数据差异的统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。
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本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、负两种模式下对肝组织进行代谢组学分析，两种模式下典型的总离子流图见图1。代谢组学数据的稳定性、重现性对研究的可靠性非常重要，为考察实验的系统稳定性，本研究从每个肝组织样品中取10 μl混匀后作为质量控制样品。在样品序列一开始连续进样10针QC样品，并按每7个样品再进样一针，共进样14次。正、负离子模式下，QC样品均显示良好的聚集状况，证明该分析系统稳定可靠。
图 1 肝脏正负离子模式下典型的LC-MS总离子流图
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经过数据处理后，LC-MS数据集在正离子模式下得到368个离子，在负离子模式下得到249个离子。根据OPLS-DA方法对数据进行分析，OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，最大特点是可以去除自变量和分类变量无关的分类变异，根据得分图可以揭示数据离散程度，发现异常值[7]。在得分图上具有相似的代谢物组成的样本，处在比较相似的位置，样本间距越远代表代谢物差异越大，样本间生理状态相差越大。将正常组、模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组的LC-MS数据导入到SIMCA进行分析，其得分如图2A、2B所示，正常组与模型组样本各自聚为一类，并且完全分离，说明肝纤维化大鼠模型的肝组织代谢轮廓发生显著改变，代谢物的种类或水平发生了明显变化。DHI给药组（DHI低剂量组、DHI高剂量组）能够与模型组明显区分，并向正常组靠近，表明DHI给药组可恢复部分代谢物至正常水平。
图 2 基于LC-MS正负离子模式下的OPLS-DA分析得分图
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OPLS-DA可用于寻找导致聚类间显著差异的变量，筛选正常组和肝纤维化大鼠模型组间潜在的差异代谢物。基于OPLS-DA模式下VIP>1筛选两组间的差异代谢物，进行t检验后，筛出模型组和正常组间差异具有显著性的变量（P<0.05）。基于VIP和t检验以及HMDB和KEGG等数据库比对，筛选出38个与TAA诱导肝纤维化大鼠模型相关的较为重要的差异代谢物作为潜在生物标志物（表1）。通过KEGG、HMDB等数据库查询，我们发现这些代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。
表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 -
以肝纤维化相关的差异代谢物的相对含量作为检测指标可以评价DHI对肝纤维化的治疗作用，比较发现33种代谢物的含量发生明显逆转（图3），同时，有14种代谢物的含量回调与DHI的剂量成正相关性，即高剂量组比低剂量组回调更多（图3A、3B）。
图 3 33种潜在标志物在正常组、肝纤维化模型组、DHI给药组中的相对含量变化
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肝纤维化是一种发病机制复杂，可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等严重肝脏疾病的慢性流行肝病，然而目前并没有药物可以治疗肝纤维化，中药及其活性成分由于其多靶点、多通路等特点被认为是肝纤维化治疗的潜在药物。代谢组学可以对生物体内小分子代谢产物进行动态分析，通过分析阐述代谢物与生理病理变化间的联系，对肝纤维化的机制进一步阐述，也能通过肝纤维化相关差异代谢物的含量相对变化分析药物对肝纤维化模型的药效作用。本研究用肝脏代谢组学方法分析了与TAA诱导的肝纤维化模型密切相关的38种代谢物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径，DHI能够通过调节部分代谢通路发挥预防和治疗肝纤维化作用。
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肝纤维化的产生伴随着肝细胞死亡和肝星状细胞(HSCs)的活化，HSCs约占正常人肝脏中非实质细胞的1/3和总驻留细胞的15%，HSCs从静态到激活会使得ECM过剩表达而导致纤维化，而氧化应激在HSCs激活和ECM形成中发挥重要的促进作用[1, 8]。谷胱甘肽（GSH）是人体内含量最丰富的抗氧化剂，也是体内氧化防御体系的主要组成成分之一[9]。GSH可以在谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶以及谷胱甘肽还原酶的作用下与其氧化态相互转换，清除部分有机过氧化物，调节体内的氧化还原稳态，缓解氧化应激对组织造成的损伤[10-11]。有研究表明，在对乙酰氨基酚、四氯化碳、重金属砷等诱导下，大鼠肝组织中GSH含量下降[12]。本研究中，TAA诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织中GSH显著下降，这与谷胱甘肽在其他肝损模型中下调的趋势一致。经过DHI干预后GSH回调，且高剂量DHI比低剂量组回调比例更大，这说明DHI可能调整体内谷胱甘肽代谢通路，通过提高体内谷胱甘肽含量恢复肝组织抗氧化功能，缓解氧化应激对肝脏的进一步损伤，从而起到抗肝纤维化作用。
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肝纤维化过程中，抑制HSC的激活和增殖是预防和治疗肝纤维的重要途径。血小板衍生生长因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信号通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡[13]。已有研究证明，褪黑素通过抑制JAK2/STAT3相关信号通路或抗氧化机制来抑制HSC的激活和增殖从而发挥肝脏保护作用[14-15]。在本研究中，环6-羟基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸盐均为褪黑素代谢产物，在模型组中含量显著增加，说明褪黑素被大量代谢，肝脏保护作用被抑制。经过DHI的干预后两种褪黑素代谢产物均回调，这提示DHI可能通过调整褪黑素代谢，回调褪黑素及其代谢产物的机体内含量发挥抗肝纤维化活性。
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肝脏是机体物质代谢的中枢器官，在氨基酸的新陈代谢和蛋白质的合成与分解中发挥重要作用。天冬氨酸是一种酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳动物中一般被认为是一种营养上非必需的氨基酸。然而，越来越多的文献表明，天冬氨酸在包括肝脏生理学在内的许多生物和生理过程中起着重要作用，如合成精氨酸以维持巨噬细胞应对免疫挑战，同时，也有证据表明天冬氨酸可以减轻肝损伤、增强肝脏功能[16]。本研究发现TAA诱导大鼠肝纤维化后，与正常组比较，模型组中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路被干扰，L-天冬氨酸含量显著变化，经过DHI的干预后回调，这提示DHI可能调整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，改变体内天冬氨酸含量发挥肝保护作用。
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脂质不仅是细胞膜的组成成分，而且参与信号转导。磷脂酰胆碱、鞘脂、溶血性磷脂酰胆碱是血清脂蛋白和细胞膜的重要组成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A1水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的产物，作为一种溶血卵磷脂，在肝脏中与卵磷脂一起在线粒体间进行转移[17]。有研究证明，PE通过N-甲基转移酶生成PC的通路约占PC产生量的30%，磷脂酰胆碱为肝脏重要营养来源，可以拮抗肝脏受病毒、药物、酒精及其他有毒物质的侵害，防止肝纤维化[9]。肝脏是脂质生成和脂肪酸氧化等脂类代谢的主要场所，肝纤维化时可以引起脂质合成、转运及分解代谢的普遍紊乱，而脂质代谢异常又会加重肝损害，引起肝脏的脂毒性[18]。在本研究中，4种LysoPE在模型组中均发生下降，另外一些磷脂代谢相关物质，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂质代谢相关物质如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、牛磺酸熊去氧胆酸等在正常组与模型组大鼠中也存在显著差异，说明TAA诱导的大鼠肝纤维化模型脂质代谢的紊乱。经过DHI干预治疗后，代谢物水平不同程度得到回调，表明DHI可通过干预多个脂质代谢通路发挥其抗肝纤维化活性。
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三羧酸循环是糖、脂肪、氨基酸三大营养素的最终代谢通路，在能量代谢、提供生物合成的前体中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循环的的重要中间产物，也是一种重要的细胞外信号分子，在信号传递、炎症反应、肝纤维化的发生发展中发挥着重要作用[19]。在本研究中，肝纤维化模型组大鼠琥珀酸的代谢变化趋势均与正常大鼠相反，而给予DHI后趋近正常，说明DHI能够改善肝纤维化大鼠的能量代谢。
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本研究建立了LC-MS代谢组学分析的方法，通过OPLS-DA筛选出与肝纤维化密切相关的38种差异代谢产物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。基于38种差异代谢物在正常组、模型组及DHI给药组之间相对含量的差异，对DHI预防治疗大鼠肝纤维化模型的药效进行了评价，结果表明DHI能够回调34种潜在差异代谢物的相对含量，调节部分失衡代谢通路，发挥抗肝纤维化作用。本研究为肝纤维化的新标志物和治疗靶点的发现以及DHI作为抗肝纤维化潜在药物的进一步开发应用提供实验依据。
Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology
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摘要:
目的 利用肝脏代谢组学方法监测肝纤维化相关的代谢变化，评价二氢丹参酮Ⅰ治疗肝纤维化的药效及作用机制。 方法 将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组和二氢丹参酮Ⅰ低剂量组、二氢丹参酮Ⅰ高剂量组。采用硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型，给予4周治疗后，取大鼠肝脏进行液相色谱-质谱分析，结合OPLS-DA模式识别方法筛选模型组和正常组之间的差异代谢物，并以此评价二氢丹参酮Ⅰ对肝纤维化的治疗作用。 结果 通过肝脏代谢组学分析鉴定了38种肝纤维化相关的生物标志物，涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路，同时数据显示二氢丹参酮Ⅰ的干预对肝纤维化有改善作用。 结论 二氢丹参酮Ⅰ能够通过调节失衡的谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径而发挥预防和治疗肝纤维化作用。 Abstract:Objective To evaluate therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis based on liver metabolomics method. Methods 28 rats were randomly divided into four groups including control group, hepatic fibrosis model group and dihydrotanshinone Ⅰ low dose group and dihydrotanshinone Ⅰ high dose group. The dihydrotanshinone Ⅰ treated groups received dihydrotanshinone Ⅰ for 28 days. The rat liver samples were collected and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS). The OPLS-DA pattern recognition analysis of metabolomics differences among the groups and therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis were evaluated. Results 38 metabolites were identified through liver metabolomics analysis. The possible mechanism of hepatic fibrosis was mainly involved glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism and TCA cycle. The hepatic fibrosis induced by TAA was reversed by dihydrotanshinone Ⅰ. Conclusion Dihydrotanshinone Ⅰ provided satisfactory therapeutical effects on hepatic fibrosis through partially regulating the perturbed glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, TCA cycle. -
Key words:
- hepatic fibrosis /
- dihydrotanshinone I /
- LC-MS /
- metabolomics
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在当代社会，医院青年药师在工作和生活中存在不同程度的冲突，不规律的工作安排和沉重的工作也带来不小压力[1]，而过度的心理压力将对药师的成长带来不利影响，影响药师工作质量[2]。当前国家力推医保支付模式的转变和疾病诊断相关分组（DRG）控费，大多数青年药师面临转型期的工作模式的重大改变，他们将不再简单地从事药品调剂，而是从窗口走出药房，走进病房，走近患者。然而，青年药师对自我的专业知识储备和专业技能能否适应角色转型，心存疑虑，职业压力空前增加。本课题组之前的调查研究发现[3]，随着药学本科教育的逐渐普及，本科及以上学历的药学毕业生在医院药师队伍中所占比例显著提高，但与之相伴的是青年药师职业满意度不高。这可能与周而复始的药品调剂工作所带来的职业倦怠和社会认同较低等因素有关。而新情况新形势下社会对执业需求的提高，势必给青年药师形成更大压力，使其感到前所未有的职业挑战，导致职业倦怠显现，创新能力和自我成就感弱化[4]。青年药师从业时间不长，作为这一职业人群的新生代，若长时间处于压力中，会对其职业发展产生不利影响。本研究聚焦于青年药师，通过问卷调查青年药师在医改新形势下的职业压力现状，对导致青年药师职业压力的因素进行统计分析，探讨相应干预对策，以帮助其缓解职业压力，旨在提升其身心健康水平和工作绩效。
1. 资料与方法
1.1 调查对象
本次调查的目标人群为不同等级医疗机构从业的35岁以下青年药师。纳入标准：①各级医疗机构在岗药师；②年龄小于35岁；③自愿参与问卷调查。
1.2 调查方法
参考课题组之前的工作[3]和相关文献[4-6]，设计问卷并通过问卷星APP制作，在各级医疗机构药剂科微信群发布。问卷通过Cronbach信度分析，信度系数值为0.80（>0.7)，表明研究数据信度质量良好。问卷采用不记名方式，不采集可识别的信息，问卷经过网络发放。为避免重复提交问卷，每个微信账号只允许提交一次。调查时间为2020年7月至9月。
1.3 调查内容
问卷分为4个部分，第一部分为填写者的基本信息。第二部分以五级Likert量表提出12个与职业相关压力问题，对其工作的各个要素（工作量、工作时间、薪资、工作与家庭关系、与同事及领导关系、自身身体状况等）进行评分，分别计1～5分，对每个项目的得分数相加获得压力总分。压力得分从最低12分到最高60分不等。总分越高，表示青年药师职业压力越大。第三部分涉及自身职业发展及对今后工作的未来期望。第四部分为填写者对职业压力处理方式的选择，除了预设选项，还留有一道开放式问题，填写者可自由陈述其对减缓职业压力的看法。
1.4 统计分析
数据分析采用SPSS 25.0软件进行。使用方差分析来检验组间的显著性差异(P<0.01)。
2. 结果
2.1 基本信息
共回收289份有效调查问卷。人口统计学信息（表1）包含了受访者的人口统计信息和执业信息。
表 1 人口统计学信息项目 频数（%） 性别 男 70（24.22） 女 219（75.78） 年龄 小于25 32（11.07） 26～30 104（35.99） 31～35 153（52.94） 受教育程度 专科以下 1（0.35） 大学专科 39（13.49） 大学本科 196（67.82） 硕士及以上 53（18.34） 医院级别 一级 42（14.53） 二级 44（15.22） 三级 203（70.24） 职称 药士 40（13.84） 药师 173（59.86） 主管药师 71（24.57） 副主任药师 5（1.73） 主任药师 0（0） 工作岗位 调剂 190（65.74） 临床药学 55（19.03） 静脉药物配置中心 28（9.69） 其他 16（5.54） 2.2 职业压力产生原因分析
调查显示：有许多与工作相关的压力因素导致青年药师，尤其是三级医院青年药师的满意度降低。心理压力和职业倦怠问题是影响青年药师工作积极性、服务质量和医患关系的重要因素[5]。通过对量表赋值统计，以24分及以下认为无过多职业压力，24～36分认为有一定职业压力，36分以上认为有较高职业压力，其中认为无过多职业压力者18人（6.23%），认为有一定职业压力者93人（32.18%），认为有较高职业压力者178人（61.59%）。有超过半数的青年药师认为有较高的职业压力（图1）。
通过方差分析，可得知性别、受教育程度、医院级别、工作岗位对于青年药师职业压力程度无显著性差异。
年龄段对于青年药师职业压力程度呈现出显著性差异（表2）。青年药师的年龄段对于其职业压力程度呈现出极显著性差异(P<0.01)，在31～35岁这一年龄段的职业压力高于其他年龄段，且职业压力程度得分随着年龄段的增长而变高。
表 2 不同年龄段的青年药师压力评分结果($\bar x \pm s$ )组别 评分（分） <25岁(n=32) 28.28±10.71 26~30岁(n=104) 34.56±9.23 31~35岁(n=153) 36.34±10.86* *P<0.01，与<25岁组比较。 职称对于青年药师职业压力程度呈现出显著性差异（表3）。青年药师的职称对于其职业压力程度呈现出极显著性差异(P<0.01)，职称越高，青年药师职业压力程度得分越高。中高级职称的晋升是青年药师的一大压力来源，对在繁忙的工作之余，须撰写论文、做课题，以期得到职称的晋升，这对于许多青年药师来说是非常困难的。
表 3 不同职称的青年药师压力评分结果($\bar x \pm s$ )组别 评分（分） 药士(n=40) 29.88±10.72 药师(n=173) 35.07±10.74 主管药师(n=71) 36.59±9.27 副主任药师(n=5) 39.80±8.35* *P<0.01，与药士组比较。 2.3 对职业规划、职业前途和重新择业可能的看法
通过3个问题调查分析青年药师对所从事职业的看法（表4）。在289名回答者中，只有65.05%的青年药师对自身工作有长期职业规划。
表 4 青年药师对药师职业相关问题的看法提问 选项 频数（%） 您目前是否有对药师工作的长期职业规划？ 是 188（65.05） 否 101（34.95） 您是如何看待自己的前途的？ 一片光明，信心十足 62（21.45） 感到困扰或担心 177（61.25） 没考虑过 50（17.3） 如果有重新选择的机会，您还会选择药师作为职业吗？ 会 126（43.6） 不会 163（56.4） 以年龄段看，在25～30岁这一年龄段，有70.19%的青年药师对前途感到困扰或担心。以职称看，高级职称药师更多对前途感到困扰或担心。
如果能重新选择职业，在31～35岁的年龄段中，52.29%的青年药师不会再选择药师职业。对于药师、主管药师、副主任药师，同样超过半数（分别为60.12%、56.34%、60%）的青年药师不会再选择药师职业。超过一半的青年药师不愿意重新选择，提示药师这一职业对于青年来说并不是一项令人满意的工作。
3. 对策与讨论
本研究问卷调查表明，在医院工作的青年药师有超过半数感到职业压力过大。青年调剂药师面对调剂工作的巨大工作量可能无法做到以最好的态度面对每一个患者，而患者可能对药师服务期望过高，很容易发生冲突，加上青年药师对人际关系压力的心理承受力弱，处理医患矛盾的经验不足，对被投诉后受到批评、处罚，往往感到压力过大。即使是青年临床药师，他们自感与医生相比社会地位较低，职业期望无法得到满足；长期的疲劳和压力会影响临床药学工作质量和患者用药安全[6]。如何帮助青年药师改善心理情绪，调节职业压力，以能够促使他们用积极健康的心态投入到药学服务工作中去，成为当前医院药剂科管理者应当积极重视的问题。基于本文的调查，我们提出以下几方面的干预对策。
3.1 提高薪资待遇
在我们的调查中，有近9成青年药师希望提高薪资待遇。近年来，药事服务费、临床药学服务收费等一直是业界呼吁的热点议题，迄今尚未解决。随着临床药学工作的深入开展，药师在控制医疗费用方面正在起着积极的作用，临床药师的工作难度大，但薪酬水平有时不如传统调剂药学岗位，这一现状亟待改变。国家和医院有关部门应在绩效方面，对药师工作给予肯定，合理体现多劳多得、优劳多得[7]，更好地激励青年药师参与药学服务工作。
3.2 参加各种体育活动
在我们的调查中半数青年药师愿意希望通过参加各种体育活动，释放自身压力。体育锻炼是常见的减压方式之一，调查表明[8]，一定程度的体育锻炼可以有效降低工作压力，每周参加1～2次的运动可以促进心理健康，减缓压力程度。青年药师平时工作处于高压力、高疲劳状态，只有选择结合自身职业特点，科学的体育活动，才能达到强健身心，释放压力的作用。
3.3 组织团建
有4成多青年药师希望科室经常组织团建活动，与同事们一同参加户外活动或比赛，除了能增强员工之间的感情和沟通外，也能释放工作压力，使其保持良好的心情与乐观的态度。青年药师们更希望活动形式新颖、多样，切合当代青年药师的实际情况。
3.4 学习培训
有近5成的青年药师希望能增加外出学习培训机会。青年人志向远大、容易接受新事物。他们进入职业环境时间不长，需要榜样的引领和激励，树立良好的职业规范和正确的价值观念，激发工作学习的积极性和主动性。学习和培训，可让他们感受到关注和重视，坚定职业发展的信心。
本次调查显示，在289位青年药师中，有超过半数在医院工作时感到职业压力过大。职业压力是在所难免的，通过多方面不同对策的干预，帮助青年药师提高压力调节能力，如此，青年药师的压力能够得到缓解。本文未收集青年药师的薪酬待遇和个人生活空间数据，这些也是影响青年药师职业压力感受的重要因素之一。此外，由于本次调查采用的是自愿方式，一些不愿表露态度的药师不参与，可能会带来一定的偏倚。拟在今后的研究中深入予以探讨，以获得更加准确的结果。
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表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 
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