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肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是以肝内细胞外基质(extracellular matrix protein,ECM)过度沉积和纤维瘢痕形成为特征的慢性肝病,在世界范围内具有较高的发病率和病死率,持续发展导致肝硬化、肝癌的发生[1]。肝纤维化发病机制复杂,病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病等均可能导致慢性肝炎症,并最终导致肝纤维化[2]。然而,除肝移植外,目前尚无有效治疗肝纤维化的方法,针对肝纤维化早期识别和治疗对于预防相关负面后果至关重要。鉴于肝脏是人体最大的器官和主要代谢枢纽,探讨肝纤维化的代谢特征有望发现新的标志物和治疗靶点。
二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshinone I,DHI)是中药丹参中的亲脂性成分,被认为是一种潜在的治疗肝纤维化的药物,其肝脏保护作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物学功能已多次报道[3-5]。在本课题组前期扶正化瘀方抗肝纤维化机制研究中发现DHI是扶正化瘀胶囊的重要药效物质基础,也在细胞活性实验中证明其能显著抑制细胞活性发挥抗肝纤维化作用[6]。然而,DHI对肝纤维化治疗作用的体内药效及机制尚不明确。本研究利用肝脏代谢组学方法研究肝纤维化密切相关的生物标志物,探索肝纤维化相关病理过程,同时采用DHI进行干预,研究其对肝纤维化的治疗作用及作用机制,为肝纤维化早期诊断、有效治疗提供科学依据。
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本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、负两种模式下对肝组织进行代谢组学分析,两种模式下典型的总离子流图见图1。代谢组学数据的稳定性、重现性对研究的可靠性非常重要,为考察实验的系统稳定性,本研究从每个肝组织样品中取10 μl混匀后作为质量控制样品。在样品序列一开始连续进样10针QC样品,并按每7个样品再进样一针,共进样14次。正、负离子模式下,QC样品均显示良好的聚集状况,证明该分析系统稳定可靠。
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经过数据处理后,LC-MS数据集在正离子模式下得到368个离子,在负离子模式下得到249个离子。根据OPLS-DA方法对数据进行分析,OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法,最大特点是可以去除自变量和分类变量无关的分类变异,根据得分图可以揭示数据离散程度,发现异常值[7]。在得分图上具有相似的代谢物组成的样本,处在比较相似的位置,样本间距越远代表代谢物差异越大,样本间生理状态相差越大。将正常组、模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组的LC-MS数据导入到SIMCA进行分析,其得分如图2A、2B所示,正常组与模型组样本各自聚为一类,并且完全分离,说明肝纤维化大鼠模型的肝组织代谢轮廓发生显著改变,代谢物的种类或水平发生了明显变化。DHI给药组(DHI低剂量组、DHI高剂量组)能够与模型组明显区分,并向正常组靠近,表明DHI给药组可恢复部分代谢物至正常水平。
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OPLS-DA可用于寻找导致聚类间显著差异的变量,筛选正常组和肝纤维化大鼠模型组间潜在的差异代谢物。基于OPLS-DA模式下VIP>1筛选两组间的差异代谢物,进行t检验后,筛出模型组和正常组间差异具有显著性的变量(P<0.05)。基于VIP和t检验以及HMDB和KEGG等数据库比对,筛选出38个与TAA诱导肝纤维化大鼠模型相关的较为重要的差异代谢物作为潜在生物标志物(表1)。通过KEGG、HMDB等数据库查询,我们发现这些代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。
表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺(18∶0/15∶0) 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,模型组与正常组比较 -
以肝纤维化相关的差异代谢物的相对含量作为检测指标可以评价DHI对肝纤维化的治疗作用,比较发现33种代谢物的含量发生明显逆转(图3),同时,有14种代谢物的含量回调与DHI的剂量成正相关性,即高剂量组比低剂量组回调更多(图3A、3B)。
Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology
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摘要:
目的 利用肝脏代谢组学方法监测肝纤维化相关的代谢变化,评价二氢丹参酮Ⅰ治疗肝纤维化的药效及作用机制。 方法 将28只雄性SD大鼠随机分为4组:正常组、肝纤维化模型组和二氢丹参酮Ⅰ低剂量组、二氢丹参酮Ⅰ高剂量组。采用硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型,给予4周治疗后,取大鼠肝脏进行液相色谱-质谱分析,结合OPLS-DA模式识别方法筛选模型组和正常组之间的差异代谢物,并以此评价二氢丹参酮Ⅰ对肝纤维化的治疗作用。 结果 通过肝脏代谢组学分析鉴定了38种肝纤维化相关的生物标志物,涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路,同时数据显示二氢丹参酮Ⅰ的干预对肝纤维化有改善作用。 结论 二氢丹参酮Ⅰ能够通过调节失衡的谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径而发挥预防和治疗肝纤维化作用。 Abstract:Objective To evaluate therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis based on liver metabolomics method. Methods 28 rats were randomly divided into four groups including control group, hepatic fibrosis model group and dihydrotanshinone Ⅰ low dose group and dihydrotanshinone Ⅰ high dose group. The dihydrotanshinone Ⅰ treated groups received dihydrotanshinone Ⅰ for 28 days. The rat liver samples were collected and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS). The OPLS-DA pattern recognition analysis of metabolomics differences among the groups and therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis were evaluated. Results 38 metabolites were identified through liver metabolomics analysis. The possible mechanism of hepatic fibrosis was mainly involved glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism and TCA cycle. The hepatic fibrosis induced by TAA was reversed by dihydrotanshinone Ⅰ. Conclusion Dihydrotanshinone Ⅰ provided satisfactory therapeutical effects on hepatic fibrosis through partially regulating the perturbed glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, TCA cycle. -
Key words:
- hepatic fibrosis /
- dihydrotanshinone I /
- LC-MS /
- metabolomics
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表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺(18∶0/15∶0) 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,模型组与正常组比较 -
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