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脓毒症是因感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，其发病率和死亡率很高。根据柳叶刀杂志最新报道，2017年全球记录的脓毒症病例为4890万例，与脓毒症相关的死亡为1100万例，约占全球所有死亡病例的20%[1]。发达国家如美国每年脓毒症病例约为170万例，与脓毒症相关的死亡约27万例[2]。在低收入及中等收入的国家，脓毒症更是重症监护病房(ICU)患者的主要死亡原因，死亡率高达80%[3]。世界卫生组织已经认识到脓毒症对全球健康的重大威胁，并加强了对脓毒症的预防、诊断和治疗[4]。尽管如此，脓毒症的死亡率依然很高，主要原因之一是目前并没有诊断脓毒症的金标准，临床缺乏早期诊断和病情预测的手段。传统的标准微生物培养方法非常耗时，且有相当比例的假阴性结果。降钙素原(PCT)是唯一写进临床指南的脓毒症标志物，可用于指导抗生素的使用，但并不具有独立诊断的能力。C反应蛋白(CRP)作为传统的炎性指标，其诊断特异性较差。为了给临床提供准确及时的诊断及预后标准，脓毒症标志物一直是研究热点。本文对近年来关注度较高的、新的脓毒症候选生物标志物进行了综述，主要包括急性期蛋白、可溶性受体、非编码RNA和其他候选标志物。
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PTX-3作为正五聚蛋白(pentraxins，PTX)长五肽亚家族的一员，由脂多糖(LPS)等微生物成分或炎性细胞因子刺激分泌，可以参与髓系细胞对病原体的识别，通过产生抗微生物微环境发挥抵抗作用[5]。
PTX-3的产生不依赖肝脏，在反映快速炎症过程方面优于传统的生物标志物。多项研究已经证明其较好的诊断价值[6-8]，认为其诊断能力并不弱于PCT和CRP 。
PTX-3还被认为可以作为脓毒症的预后标志物，既是28 d死亡率的独立相关因素[9]，也可以预测脓毒症休克[10]。除此之外，Hu等[11]的研究认为PTX-3(AUC=0.78)在预测28 d死亡率方面优于PCT和乳酸，并提出将PTX-3、PCT和乳酸作为一组标志物能更好的预测死亡率(AUC=0.90，95%CI 0.83～0.94)，这也为多种生物标志物的联合应用指明了方向。
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肾上腺髓质素(ADM)来源于更大的前体肽(Pro-ADM)，MR-proADM是其活性形式。LPS、细胞因子和缺氧刺激导致的感染会促进ADM的合成和分泌。在脓毒症过程中，ADM既可以通过cAMP介导血管扩张作用，也具有稳定内皮屏障和抗菌抗炎的作用。在脓毒症休克时ADM水平可上升20～30倍。脓毒症患者初诊ADM浓度升高与血管活性药物需求增加、器官衰竭恶化和死亡率增加有关。值得注意的是，内源性ADM水平在高血压、缺血、内分泌和代谢紊乱等情况下也会增加。
有研究表明，在贯序器官衰竭评估(SOFA)评分阴性的情况下，MR-proADM同样具有重要的诊断意义，且与器官衰竭和28 d死亡率显著相关[12-13]。值得注意的是，Buendgens等[14]发现了ADM在长达26个月的随访中仍具有死亡率预测价值。
Daga等[15]发现女性脓毒症患者血清ADM水平升高更为明显，且女性患者的死亡率更低，认为主要原因是ADM发挥了作为神经激素的正面保护作用。而后Ajith[16]对此文章发表了评论，虽然肯定了初诊ADM水平对血管活性药物需求、恶化的器官功能障碍和死亡率的预测能力，但ADM与脓毒症的利害关系尚需继续研究。有趣的是Daga等[17]也对此评论做出了回复，进一步解释并坚持其原有看法。
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CD14是单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞表面的LPS受体，Presepsin是机体感染后产生的可溶性CD14亚型。多项研究已经表明Presepsin具有诊断脓毒症的能力[18]，但关于Presepsin对预后的预测能力尚有争议。有研究称Presepsin与免疫功能低下的脓毒症患者的预后相关，而PCT与不良预后无明显相关性，究其原因，可能是生物标志物产生机制的不同，PCT是由LPS和某些细胞因子诱导的，而Presepsin的产生则并不依赖LPS和细胞因子，这也解释了一些研究者发现Presepsin在小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型中升高，而在LPS模型中无明显变化[19]。有趣的是，Kaplan等[20]提出Presepsin与白蛋白的比值具有更好的脓毒症预后的预测能力。在预测脓毒症并发症方面，除了脓毒症休克， Presepsin还可预测脓毒症急性肾损伤、急性呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血[21]。另外，Presepsin是革兰阴性菌细胞壁中LPS的受体之一，全血与细菌共培养结果表明革兰阴性菌诱导的Presepsin水平高于革兰阳性菌，说明Presepsin具有鉴别细菌感染种类的潜能[22]。
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髓样细胞触发受体-1(TREM-1)表达于髓系细胞表面，在细菌和真菌感染时表达显著增加，具有炎症放大器的作用。sTREM-1作为TREM-1的可溶性形式，可以代表TREM-1的激活情况，被认为是脓毒症的诊断和预测的候选生物标志物。
多项研究认为sTREM-1具有诊断脓毒症的作用，但诊断能力仍有争议[23-24]。荟萃分析显示sTREM-1对脓毒症的诊断能力中等，需要更多的大规模研究来进一步评估sTREM-1的诊断准确性[25]。除此之外，sTREM-1还被发现表达于内皮细胞和血小板，在非感染性炎症中以及心血管手术后甚至非病理状态下也会升高[26]。因此，血浆sTREM-1作为脓毒症诊断标志物仍需继续研究。
sTREM-1作为脓毒症的预后标志物似乎更有希望，Gibot等[27]认为sTREM-1是与预后相关的独立因素。多项研究描述了类似的结果，并且Zhang等[28]认为血清sTREM-1浓度比CRP和PCT更准确地反映脓毒症的严重程度，对脓毒症预后的动态评估更敏感。Charles等[29]的一篇高质量研究也提供了有力证据，认为与PCT和CD64相比，sTREM-1是更为理想的预后标志物。
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尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)是尿激酶型纤溶酶原激活物的膜结合型受体。SuPAR是其可溶性形式，广泛存在于体液中。当身体处于炎症或其他疾病状态时，激活的免疫细胞尤其是中性粒细胞使SuPAR水平显著上调，其浓度与免疫系统活动呈正相关[30]。
在鉴别脓毒症和全身炎症反应综合征(SIRS)方面，SuPAR表现出了比PCT更好的鉴别能力(AUC 0.89 vs 0.82)，但在预测脓毒症患者死亡率方面PCT更具优势[31]。
SuPAR的预后价值研究更为广泛。希腊的脓毒症研究小组在2020年报道，SuPAR<4 ng/ml被认为可以安全出院，SuPAR>6 ng/ml是不良结果的警示信号，SuPAR>12 ng/ml的患者28 d死亡率在17%～50%[32]。一项法国学者[33]的前瞻性、多中心的国际研究表明，SuPAR联合可溶性血管内皮生长因子受体-2(sVEGFR2)对早期病情恶化有较好的预测能力(AUC=0.70)。Pregernig等[34]的一项纳入44项研究的荟萃分析肯定了SuPAR预测死亡率的作用，得出临界值为5.2 ng/ml (95% CI 4.5～6.0，P<0.01)。2020年的一篇综述，系统地回顾分析了SuPAR的脓毒症诊断和预后价值，共纳入30项研究的6906名患者，认为SuPAR具有诊断脓毒症(AUC=0.83)、预测死亡率(AUC=0.78)以及鉴别脓毒症与SIRS的作用(AUC=0.81)。与以往Meta分析确定的PCT有效性相比，SuPAR具有相似的临床指导价值，但SuPAR表现出更高的特异性，有助于弥补PCT的不足[30]。
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miRNA是由20到24个核苷酸组成的非编码RNA，可与靶mRNA结合减少蛋白质表达甚至导致转录沉默。在应激条件下，miRNAs可通过对多个靶标的协同效应来改变细胞反应，精细调节基因表达的模式[35]。近年来陆续有学者发现了miRNAs的脓毒症诊断和预测作用。
在诊断方面，miR-16a作为新生儿败血症的诊断标志物，可抑制IL-6和TNF-α等促炎因子的mRNA表达，并促进IL-10等抗炎因子mRNA表达[36]。miR-328也表现出了较好的诊断潜能(AUC=0.926)，抑制miR-328的表达水平可以改善脓毒症患者的心功能障碍和心脏炎症[37]。Hermann等[38]的研究表明，miR-193a-5p和miR-542-3p可用于鉴别非感染性疾病和感染性疾病(社区获得性肺炎或脓毒症)，miR-1246的表达水平随着疾病严重程度的增加而发生显著变化，从而鉴别健康人群、社区获得性肺炎和脓毒症。
在预测方面，循环miR-10a水平可以区分脓毒症和感染，并预测28 d的死亡率。脓毒症患者miR-223的表达与APACHE II评分(P<0.001，r=0.526)和SOFA评分(P<0.001，r=0.390)呈正相关。脓毒症患者外周血单个核细胞miR-10a水平降低，且与病情严重程度呈负相关[39]。另外，在28 d内死亡的患者中，miR-223的表达高于28 d的幸存者[40]。
此外，miRNAs在预测脓毒症并发急性肾损伤方面具有独特作用。脓毒症患者其血、尿miR-22-3p水平都会降低，可预测急性肾损伤和28 d生存率[41]。血清 miR-21-3p联合实验室指标对脓毒症并发急性肾损伤具有较高的预测价值(AUC=0.962) [42]。
Chen等[43]综述了miR-155与脓毒症的相关性，对比多项研究，肯定了循环miR-155作为诊断标志物和预后标志物的作用，但入院后48 h循环miR-155明显下降，表明miR-155的上调仅存在于脓毒症早期。需要注意的是，Link等[44]提出了不同意见，在对miR-26b-5p、miR-122-5p、miR-143-3p、miR-146a-5p、miR-193-3p、miR-223-3p研究之后，并没有发现独立的miRNAs能够明确区分脓毒症和非脓毒症ICU患者，认为miRNAs的诊断能力并不优于现行评分系统。
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lncRNA是一类超过200个核苷酸的RNA，通过调控靶基因的表达广泛参与细胞的增殖、分化和凋亡[42]。有结果显示脓毒症患者的血浆中多种lncRNA表达增加至28～70倍，单纯的LPS诱导也有相同的结果[45]。
lncRNA肺腺癌转移相关转录因子1( MALAT1)已被证明通过抑制NF-кB活性来调节LPS刺激的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达[46]。一项对120名脓毒症患者进行的前瞻性队列研究显示，lncRNA MALAT1具有诊断脓毒症的价值(AUC=0.910)，对脓毒症休克和死亡率也有较好的预测能力[47]。 lncRNA锌指蛋白反义链1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)被认为与类风湿性关节炎和急性心肌梗死等炎症性疾病有关，Xu等[48]发现lncRNA ZFAS1对脓毒症也有较好的诊断(AUC=0.814)和预测死亡率(AUC=0.628)的能力。
其余lncRNA 多在预后方面起预测作用。lncRNA富含丰富的转录本1 (nuclear-enriched abundant trans-cript 1，NEAT1)是核体类斑点结构的重要组成部分，调节IL-8等抗病毒基因的表达，在先天免疫反应中发挥重要作用。脓毒症患者中lncRNA NEAT1水平的升高与APACHE II和SOFA评分呈正相关，并与不良预后相关[49-50]。lnc母系表达基因3 (maternally expressed gene 3 ，MEG3)的水平也与炎症反应和器官损伤程度正相关，通过作为多种miRNAs的分子海绵即长效竞争性抑制剂发挥作用，如miR-21。近期一项纳入219名脓毒症患者和219名健康对照者的研究中，对入院后24 h内采集的血浆样本中lnc-MEG3和miR-21含量进行分析，发现lnc-MEG3(AUC=0.887)和lnc-MEG3/miR-21比值(AUC=0.934)对预测脓毒症风险升高有较好的预测价值，而miR-21(AUC=0.801)对脓毒症风险降低有较好的预测价值[51]。与之相反，脓毒症患者lncRNA牛磺酸上调基因1 (taurine up-regulated 1，TUG1)的表达与急性生理与慢性健康评分(APACHE II)和序贯器官衰竭评分(SOFA)呈负相关，28 d死亡组的lncRNA TUG1表达低于28 d存活组[40]。
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钙保护素是一种异源二聚体钙结合蛋白，高表达于髓系细胞的胞浆中。近期的两项研究[52-53]都认为钙保护素对脓毒症有较好的诊断效能。有趣的是，Wirtz等[54]提出初诊钙保护素高水平可能与死亡风险相关，而入院后钙保护素水平的升高则与长期良好结局相关。
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nCD64又称高亲和力Fcγ受体I，在中性粒细胞中静息状态下水平很低，在感染过程中被炎性因子上调。近期一篇纳入133名患者的研究[55]表明，nCD64对诊断新生儿脓毒症的敏感度为94.7%，特异度为93.6%，AUC值为0.925。Hashem等[56]关于诊断作用也得出了类似的结论(AUC=0.922)。我国学者2020年的一项研究[57]同样表明nCD64在诊断和预测死亡率方面均优于PCT。
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肠道是所有人体部位中微生物分布最密集和异质性最强的部位，肠道微生物群被认为是糖尿病、肝硬化、癌症和动脉粥样硬化等疾病发生发展的生物标志物。脓毒症会损害肠道微生物群的完整性，肠道微生物群也会影响脓毒症和器官衰竭的进程。根据El MEHS等[58]的报道，肠道微生物群检测可在发病前1天预测迟发性脓毒症的发生(AUC=0.78)。Agudelo等[59]发现脓毒症患者的肠道微生物群特征为副杆菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属等炎症相关微生物的增加，认为其可以预测脓毒症的发展，尤其是肠球菌种类的丰富度可能是脓毒症潜在的预后生物标志物。遗憾的是，近期的一项纳入150名患者的前瞻性队列研究[60]表明微生物多样性降低与死亡率的增加无关。而且饮食、抗生素和其他治疗手段都会引起肠道微生物群的变化，肠道微生物群作为脓毒症的生物标志物前景并不乐观。
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血管生成素(Angpt)是血管生成生长因子家族中的一员，由血管内皮细胞在炎症等应激条件下分泌。Angpt-1发挥稳定血管内皮和抗炎的正面作用，而Angpt-2对Angpt-1产生竞争性拮抗作用[61]。Angpt-2可能具有预测脓毒症休克的能力(AUC=0.631)[10]。Angpt-2/Angpt-1的比值也具有预测作用，据韩国的一项报道[62]，Angpt-2/1预测28 d死亡率的能力与SOFA评分无显著差异(AUC 0.736 vs 0.745 )。
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本文综述的急性期蛋白、可溶性受体、非编码RNA和其他的标志物的作用及效能如表1所示。早期诊断和正确治疗是降低脓毒症病死率的关键。但由于脓毒症病理生理机制复杂，个体差异较大，体征和症状无特异性，早期诊断极为困难。目前被研究的诊断标志物主要参与先天免疫反应的初始发病机制，预后标志物通常与脓毒症引起的器官功能障碍有关。这些候选标志物在脓毒症发病机制中的作用以及最佳联合使用策略，都需要进一步的研究，以供将来的临床使用。
表 1 脓毒症生物标志物作用及效能比较
分类 标志物 作用 效能 参考文献 AUC 临界值 敏感性(%) 特异性(%) 急性期蛋白 PTX-3 诊断新生儿脓毒症 0.875 ? 100 94.3 [6] 诊断新生儿脓毒症 0.995 5.6 μg/L 98.3 96.7 [7] 预测28天死亡率 0.69 ? ? ? [9] 预测脓毒症休克 0.798 15877 pg/ml 50 100 [10] 预测28天死亡率 0.78 49.9 ng/ml 83.3 64.2 [11] ADM 诊断脓毒症 0.85 1.5 pg/ml 83 76.47 [12] 预测器官衰竭 0.69 75 pg/ml ? ? [13] 诊断脓毒症 0.731 ? ? ? [14] 预测总死亡率 0.655 1.4 nmol/L 81.1 39.8 可溶性受体 Presepsin 诊断脓毒症 0.792 380 pg/ml 83.5 62.2 [18] 预测30天死亡率 0.683 556 pg/ml 73.1 59.6 诊断免疫功能低下患者的脓毒症 0.87 1248 pg/ml 66 100 [19] sTREM-1 诊断脓毒症 0.97 60 ng/ml 96 89 [25] 诊断脓毒症 0.868 108.9 pg/ml 83 81 [26] 预测脓毒症死亡率 0.74 180 pg/ml 86 70 [29] 预测脓毒症休克 0.823 222.5 pg/ml 59.5 93.3 [30] 预测脓毒症死亡率 0.64 954.4 pg/ml 54.5 78 [31] SuPAR 诊断脓毒症 0.89 5.58 pg/ml 96 72.2 [33] 预测脓毒症病情恶化 0.66 ? 90 20 [35] 预测脓毒症死亡率 ? 5.2 ng/ml ? ? [36] 诊断脓毒症 0.83 7.5 pg/ml 76 78 [32] 预测死亡率 0.78 9.6 pg/ml 74 70 鉴别脓毒症与CIRS 0.81 7.5 pg/ml 67 82 MicroRNA miRNA-16a 诊断新生儿脓毒症 0.968 3.164 88 98 [36] miR-328 诊断脓毒症 0.926 0.305 87.6 86.36 [37] miR-10a 诊断脓毒症 0.804 0.18 65 85.7 [39] 预测28天死亡率 0.699 ? ? ? miR-223 诊断脓毒症 0.924 ? ? ? [40] 预测28天死亡率 0.711 ? ? ? miR-21-3p 预测脓毒症并发急性肾损伤 0.962 ? 97 91.4 [42] lncRNA lncRNA MALAT1 诊断脓毒症 0.91 1.895 83.33 85 [47] 预测脓毒症休克 0.836 3.665 70.37 92.42 预测脓毒症死亡率 0.886 3.62 81.82 89.47 lncRNA ZFAS1 诊断脓毒症 0.814 ? 92.1 63.5 [48] 预测脓毒症死亡率 0.628 ? 92.1 35.5 lncRNA NEAT1 诊断脓毒症 0.785 ? ? ? [49] 预测28天死亡率 0.726 ? ? ? lnc-MEG3 诊断脓毒症 0.887 ? ? ? [51] 预测28天死亡率 0.704 ? ? ? lncRNA TUG1 诊断脓毒症 0.846 ? ? ? [40] 预测28天死亡率 0.705 ? ? ? 其他 Calprotectin 诊断脓毒症 0.79 1.3 ng/l 81 56 [52] 诊断脓毒症 0.91 ? ? ? [53] nCD64 诊断新生儿脓毒症 0.925 41.60% 94.7 93.6 [55] 诊断脓毒症 0.879 8 MFI 75 89.4 [56] 预测28天死亡率 0.85 5.45 MFI 93.3 65.3 诊断脓毒症 0.922 43% 85.6 93 [57] 肠道微生物群 诊断迟发性脓毒症 0.78 ? ? ? [58] Angiopoietin 2 预测脓毒症休克 0.631 9047 pg/ml 42.31 88.24 [61] Angiopoietin 2/1 预测28天死亡率 0.736 3.2 69.8 70.6 [62]
Recent advances in biomarkers of sepsis
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摘要: 脓毒症可以导致危及生命的器官功能障碍，是危重患者死亡的主要原因之一。脓毒症的早期诊断与正确治疗是降低病死率的关键，但目前尚无诊断的金标准。理想的脓毒症生物标志物应该具有早期诊断和预测不良预后的能力，且具有较好的敏感性和特异性。脓毒症的候选生物标志物众多，本文重点综述了急性期蛋白、可溶性受体、非编码RNA和其他近期关注度较高的候选标志物的最新进展。Abstract: Sepsis can cause life-threatening organ dysfunction and is one of the leading causes of death in critically ill patients. Early diagnosis and correct treatment of sepsis are the key to reducing the fatality, however, there is no golden standard for diagnosis at present. The ideal sepsis biomarker can be used for early diagnosis and predicting poor prognosis with good sensitivity and specificity. There are many candidate biomarkers for sepsis. This article reviews the latest developments on acute phase proteins, soluble receptors, non-coding RNAs and other candidate biomarkers of sepsis that attracted more recent attention.
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心力衰竭，简称心衰，是由于心脏器质性或功能性异常导致的心室充盈或射血能力受损所引起的复杂临床综合征[1]。随着人口老龄化程度不断加深以及许多患者从急性心脏疾病中存活，慢性心衰的患者数呈现增长态势，尽管过去30年其生存率有了显著提高，但5年病死率仍约为50%[2, 3]。慢性心衰因其高发病率和高病死率，长期以来一直是社会的主要医疗负担[4]。慢性心衰主要表现为射血分数降低的心衰，其药物治疗主要包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂组成的四联疗法[5]。患者尤其是长期用药者，由于低血压、电解质紊乱等不良反应的影响，通常用药依从性欠佳。
传统中药在治疗心衰方面有着悠久的历史和独特的理论[6]，具有多靶点且成本较低等优势，如黄芪[7]。黄芪注射液是临床上治疗心衰的常用中药注射剂之一，疗效肯定[8]。大量研究已经证实了黄芪治疗心衰的有效性和安全性[9, 10]。黄芪甲苷是黄芪治疗心衰的主要活性成分[11]。但是，由于黄芪甲苷水溶性差，生物利用度极低，限制了黄芪甲苷药物制剂在临床上的转化[12, 13]。因此，黄芪甲苷可作为先导化合物，进行结构优化，既保持其原有的活性，又能增强其水溶性，以便增加生物利用度，充分发挥黄芪甲苷治疗心衰的作用。本研究主要从合成的系列水溶性黄芪甲苷衍生物中，筛选具有抗心衰效用的化合物，并初步探讨其对心肌重塑和心肌纤维化的改善作用，以期为临床提供抗心衰的候选新药。
1. 材料
1.1 动物
雄性C57BL/6小鼠150只，7~8周龄，体重为18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：20170012004976。动物实验严格遵守动物护理伦理指南进行操作，已通过海军军医大学动物实验伦理委员会批准。饲养环境为无特定病原体（SPF）环境，温度为（25±2 ）℃，每日光照12 h，昼夜循环，自由摄取标准饲料和饮用水。
1.2 试剂与材料
水溶性黄芪甲苷结构改造衍生物包括HHQ、HHQ12CS和HHQ18TC，HHQ进一步结构改造得到HHQ16和HHQ19，均由上海医药工业研究院孙青䶮教授提供。卡托普利、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异氟烷均购自国药集团。内源性过氧化物酶封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、苏木素染色液购自碧云天公司。Masson复合染色试剂盒购自博谷德生物工程公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自日本Takara公司。Target Retrieval Solution购自丹麦Dako公司。COL1、COL3抗体、TGF-β1抗体购自英国Abcam公司。αSMA抗体购自中国博奥森生物技术公司。
1.3 仪器
呼吸机（意大利UgoBasile公司）；麻醉剂（中国惠德万邦公司）；二维及M型超声（意大利EsaoteMyLab公司）；诊断仪及探头（意大利One/Touch公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；病理切片机（中国辅光精密仪器公司）；包埋机（中国BIOBASE博科公司）；组织摊片机（中国湖北孝感安立信公司）；高通量组织研磨仪（中国上海必横生物公司）；PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Stepone Plus实时荧光定量PCR仪（美国AB applied biosystems公司）。
2. 方法
2.1 左冠状动脉前降支（LAD）结扎心衰模型的建立
通过2.5%异氟烷麻醉小鼠，气管插管接入呼吸机保持麻醉状态。开胸暴露心脏，在左心耳下缘约1 mm处用线缝扎冠状动脉，缝合后，待小鼠恢复自主呼吸，饲养3~4周，通过心超检测慢性心衰模型，从中筛选慢性心衰造模成功的小鼠（EF<50%）。
2.2 分组及给药
首先对黄芪甲苷衍生物进行药效筛选。将LAD结扎造模成功后的小鼠随机分为模型组、卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物（HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC）组、假手术组，共6组。造模后4周使用0.5%CMC-Na溶液配制黄芪甲苷衍生物，并按照小鼠每10 g体重0.1 ml进行灌胃给药，黄芪甲苷衍生物组分别给予10 mg/kg的HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5%CMC-Na溶液，卡托普利组给予8.6 mg/kg卡托普利混悬液，每日给药1次，连续28 d。HHQ衍生物药效筛选分组同上，即造模成功的小鼠随机分为模型组、HHQ组、HHQ16组和HHQ19组、假手术组，一共5组。假手术组和模型组处理同上，HHQ衍生物组分别用10 mg/kg的HHQ、HHQ16、HHQ19灌胃，每日给药1次，连续28 d。
2.3 心脏超声检测心功能
通过吸入2.5%异氟烷气体麻醉小鼠，在检测过程中提供1.0%~1.5%浓度的异氟烷以维持麻醉状态。通过二维及M型超声诊断仪检测小鼠的心功能，筛选造模后的成功模型（EF<50%）以及评价给药后小鼠的心功能。主要检测指标有左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等参数。分别于给药18、28 d对各组小鼠进行心脏超声检测。
2.4 心脏形态学分析
对小鼠进行心脏超声检测之后称重，然后取心脏称重。计算心脏重量和体重的比值，即心体比（mg/g）。心脏标本用10%福尔马林固定24 h后，将心脏取出，排列整齐，拍照，观察心脏的大小和形态。取小鼠心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理。用HE染色和Masson染色观察心脏大体形态及胶原形成。
2.5 实时荧光定量PCR
提取心肌组织总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR体系包括：SYBR 10 μl，引物（上游引物和下游引物）1 μl，cDNA 3 μl，以及DEPC水7 μl，引物合成序列见表1。
表 1 引物合成序列名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 2.6 免疫组织化学染色
心脏组织于4%多聚甲醛组织固定液中固定。梯度乙醇脱水后将组织浸入热石蜡中，将浸好的石蜡放入包埋机中包埋。将组织进行横切后去石蜡，使用Target Retrieval Solution进行抗原修复操作。用内源性过氧化物酶封闭液消除内源性过氧化物酶的干扰。用1%牛血清白蛋白封闭，使用相应的特异性抗体进行染色，根据种属关系选择对应二抗染色。为了可视化染色，使用DAB显色，并用苏木素进行复染。
2.7 统计方法
实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。实验结果均采用均数±标准误（mean ± SEM）的方式呈现。两组样本之间的比较采用两独立样本t检验（t-test）；两组以上两两之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素重复方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
LVEF和LVFS是评价心衰的重要指标，心衰时LVEF和LVFS下降。如图1所示，阳性对照药卡托普利给药后增加18 d和28 d的LVEF和LVFS，以18 d最为显著，LVEF增长百分比为56%；黄芪甲苷衍生物HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC均增加LVEF和LVFS，且呈时间依赖性，增强效果在3种药物之间无显著差异。以HHQ为例，LVEF增长百分比在18 d为61%，28 d为71%，优于同期的卡托普利。结合3种药物的合成难易性、稳定性、水溶性和药动学参数（数据在此不展示），HHQ可以作为进一步优化的候选化合物。
图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, 与0 d比较。3.2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
对上述筛选出来的HHQ药物进一步衍生化，使其具有更好的合成路线、稳定性、水溶性和药动学参数（数据不展示）。进一步以HHQ为对照，对其衍生物HHQ16和HHQ19进行药效评估。如图2所示，给药28 d，HHQ衍生物均能使得心衰小鼠的LVEF%和LVFS%升高，其中，HHQ16升高LVEF%的百分比为104%，HHQ19升高LVEF%的百分比为171%（图2A、图2B）；而HHQ升高LVEF%的百分比为99%。但HHQ19显著增加心率（HR）（图2C），而HR增加会导致心肌耗氧量增加，增加死亡率[14]。因此，3种HHQ衍生物均能提升心衰小鼠的心功能，综合上述因素，选择HHQ16为最优候选化合物。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）；C.心率（HR）**P<0.01，***P<0.001，与0 d比较。3.3 HHQ16改善心衰小鼠心脏大小、形态和结构
进一步观察候选化合物HHQ16对心肌重塑的影响，初步探索其作用机制。如图3所示，与假手术组比较，模型组心脏显著变大，形态不规则，心体比显著升高（图3B）；HHQ16给药28 d后，心脏显著变小，心体比显著下降（图3A、图3B）。HE染色（图3C）表明，假手术组小鼠心肌细胞结构正常，模型组可见部分心肌细胞呈现区域性不规则，心肌细胞变大。HHQ16给药28 d后，形态变规则，心肌细胞肥大显著改善。
3.4 HHQ16抑制心衰小鼠心肌组织纤维化
进一步观察HHQ16对心肌纤维化的影响。首先通过Masson染色，观察胶原沉积。如图4所示，假手术组的心肌组织无胶原沉积。模型组的心肌组织胶原沉积增多；而HHQ16组给药28 d，心肌胶原沉积显著减少。COL1、COL3、αSMA和TGF-β1是评估心肌纤维化的重要指标[15]。免疫组织化学染色结果显示（图5），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA蛋白表达水平显著升高，经HHQ治疗后，这些蛋白表达水平显著降低。基因水平也展示了相似的改变（图6），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA表达水平显著升高，而HHQ16能显著降低这些纤维化指标的mRNA表达水平。以上结果表明，HHQ16可以改善心衰造成的心肌纤维化。
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响A.COL1；B.COL3；C.αSMA；D.TGF-β1*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。4. 讨论
心衰已经成为严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。越来越多的研究表明，由于“多靶点效应”，中药治疗心衰具有独特的优势，中药活性成分为新药开发提供了有价值的候选化合物。黄芪甲苷是治疗慢性心衰的中成药黄芪注射液的主要有效成分。然而，黄芪甲苷结构复杂，水溶性差，生物利用度低，化学合成困难，限制了该药物的临床转化。本研究涉及的水溶性黄芪甲苷衍生物均可显著改善心功能，最终根据化合物合成难易、药物稳定性、水溶性以及初步药动学比较，确定HHHQ16为最优候选药物。HHQ16具有抗心衰作用，对左冠状动脉前降支结扎模型诱导的慢性心衰小鼠有明确的治疗效果。
心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心肌细胞肥大及心肌纤维化（心肌基质重构）等改变，以及在此基础上形成的心脏扩大、心脏质量增加。目前的研究认为，心肌重塑是心衰发生、发展的分子细胞学基础，是心衰恶化的主要机制之一。相关研究表明黄芪甲苷具有抗氧化、增强免疫力、增强心肌收缩力、减轻心肌纤维化和心肌重塑等作用[16-20]。通过对心衰小鼠表型观察，发现经过LAD手术后，模型组的心脏显著变大，心肌细胞变大，结构不规则，通过HHQ16治疗28 d后，心脏显著变小，心肌细胞接近正常，形态变规则。表明HHQ16能够改善心衰小鼠心肌重塑。
心肌纤维化被认为是心衰的基本病理变化，也是心肌重塑的分子基础[21]。心肌纤维化是当心肌因缺血、炎性反应、衰老等原因受损时，局部的心肌细胞凋亡，心肌成纤维细胞增殖，胶原纤维为主的细胞外基质增多，从而产生的一种病理变化。其主要特征是胶原蛋白合成和降解之间的平衡紊乱，导致心脏的深层结构和功能异常，造成收缩和舒张功能的严重损害，最终体现为心衰[22, 23]。心肌纤维化与心衰患者的疾病严重程度密切相关，但纤维化过程尚未成为心衰的直接治疗靶标。实验和临床证据均表明，心肌纤维化的改变可能是可逆的[22]，开发预防和逆转心肌纤维化的药物对于减轻心肌重塑和延缓心衰的发展至关重要。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组分，其中COL1约占心脏胶原总量的85％，参与组成具有抗张强度的粗纤维，COL3约占11％，可组装成细纤维，以保持基质网的弹性[24]。在以心肌纤维化为特征的心脏疾病中，不管其病因如何，TGF-β1通常是导致纤维化的最后的、共同的中介物之一。TGF-β1是最重要的促纤维化生长因子之一，通过调节前胶原蛋白基因的表达，促进合成细胞外基质，促使心肌纤维化[25]。在肌成纤维细胞中，αSMA被组装成应力纤维，进一步导致细胞外基质蛋白过度沉积，减弱组织顺应性并加速心衰，肌成纤维细胞的分化是心肌纤维化反应的标志，其中，α-SMA的表达是此种分化的重要特征[26]。在本研究中，用Masson染色检测了小鼠的胶原，LAD手术可使小鼠胶原明显增多，而HHQ16给药治疗后能有效减少胶原沉积。通过免疫组化染色和qPCR检测了小鼠心肌纤维化相关指标，发现HHQ16可下调COL1、COL3以及αSMA蛋白水平的表达，并且下调COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平的表达，从而改善LAD手术引起的心肌纤维化，改善心衰程度。
综上所述，本研究从黄芪甲苷衍生物对心衰小鼠的保护作用入手，筛选出改造后黄芪甲苷衍生物最优的候选化合物HHQ16，通过对心肌重塑和心肌纤维化相关指标的检测，初步研究了其在心衰治疗中的作用机制，为HHQ16治疗心衰的药物研发提供科学依据。
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表 1 脓毒症生物标志物作用及效能比较
分类 标志物 作用 效能 参考文献 AUC 临界值 敏感性(%) 特异性(%) 急性期蛋白 PTX-3 诊断新生儿脓毒症 0.875 ? 100 94.3 [6] 诊断新生儿脓毒症 0.995 5.6 μg/L 98.3 96.7 [7] 预测28天死亡率 0.69 ? ? ? [9] 预测脓毒症休克 0.798 15877 pg/ml 50 100 [10] 预测28天死亡率 0.78 49.9 ng/ml 83.3 64.2 [11] ADM 诊断脓毒症 0.85 1.5 pg/ml 83 76.47 [12] 预测器官衰竭 0.69 75 pg/ml ? ? [13] 诊断脓毒症 0.731 ? ? ? [14] 预测总死亡率 0.655 1.4 nmol/L 81.1 39.8 可溶性受体 Presepsin 诊断脓毒症 0.792 380 pg/ml 83.5 62.2 [18] 预测30天死亡率 0.683 556 pg/ml 73.1 59.6 诊断免疫功能低下患者的脓毒症 0.87 1248 pg/ml 66 100 [19] sTREM-1 诊断脓毒症 0.97 60 ng/ml 96 89 [25] 诊断脓毒症 0.868 108.9 pg/ml 83 81 [26] 预测脓毒症死亡率 0.74 180 pg/ml 86 70 [29] 预测脓毒症休克 0.823 222.5 pg/ml 59.5 93.3 [30] 预测脓毒症死亡率 0.64 954.4 pg/ml 54.5 78 [31] SuPAR 诊断脓毒症 0.89 5.58 pg/ml 96 72.2 [33] 预测脓毒症病情恶化 0.66 ? 90 20 [35] 预测脓毒症死亡率 ? 5.2 ng/ml ? ? [36] 诊断脓毒症 0.83 7.5 pg/ml 76 78 [32] 预测死亡率 0.78 9.6 pg/ml 74 70 鉴别脓毒症与CIRS 0.81 7.5 pg/ml 67 82 MicroRNA miRNA-16a 诊断新生儿脓毒症 0.968 3.164 88 98 [36] miR-328 诊断脓毒症 0.926 0.305 87.6 86.36 [37] miR-10a 诊断脓毒症 0.804 0.18 65 85.7 [39] 预测28天死亡率 0.699 ? ? ? miR-223 诊断脓毒症 0.924 ? ? ? [40] 预测28天死亡率 0.711 ? ? ? miR-21-3p 预测脓毒症并发急性肾损伤 0.962 ? 97 91.4 [42] lncRNA lncRNA MALAT1 诊断脓毒症 0.91 1.895 83.33 85 [47] 预测脓毒症休克 0.836 3.665 70.37 92.42 预测脓毒症死亡率 0.886 3.62 81.82 89.47 lncRNA ZFAS1 诊断脓毒症 0.814 ? 92.1 63.5 [48] 预测脓毒症死亡率 0.628 ? 92.1 35.5 lncRNA NEAT1 诊断脓毒症 0.785 ? ? ? [49] 预测28天死亡率 0.726 ? ? ? lnc-MEG3 诊断脓毒症 0.887 ? ? ? [51] 预测28天死亡率 0.704 ? ? ? lncRNA TUG1 诊断脓毒症 0.846 ? ? ? [40] 预测28天死亡率 0.705 ? ? ? 其他 Calprotectin 诊断脓毒症 0.79 1.3 ng/l 81 56 [52] 诊断脓毒症 0.91 ? ? ? [53] nCD64 诊断新生儿脓毒症 0.925 41.60% 94.7 93.6 [55] 诊断脓毒症 0.879 8 MFI 75 89.4 [56] 预测28天死亡率 0.85 5.45 MFI 93.3 65.3 诊断脓毒症 0.922 43% 85.6 93 [57] 肠道微生物群 诊断迟发性脓毒症 0.78 ? ? ? [58] Angiopoietin 2 预测脓毒症休克 0.631 9047 pg/ml 42.31 88.24 [61] Angiopoietin 2/1 预测28天死亡率 0.736 3.2 69.8 70.6 [62] 
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