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我国的绿茶资源十分丰富，茶多酚系指绿茶中富含的多种酚类化合物，在绿茶中含量约为15%~30%[1]，具有降低血压、调血脂、抗菌消炎、治疗放射损伤、预防骨质疏松、减肥、抗癌、抗氧衰老等广泛的药理作用[2-7]。
随着大众对天然健康产品需求日益增长，茶多酚市场展现出强劲的发展动力，茶多酚的提取工艺仍是影响茶多酚制品深加工和跨界开发利用的重要环节[8]。溶剂萃取法、超声提取法、微波提取法、生物酶提取法和超临界萃取法(SFE)等是业内常用的茶多酚提取方式[9]。传统有机溶剂萃取操作简便但存在提取得率及纯度低、溶剂残留、耗时长等缺点；超临界萃取法效率高但设备投资高因而推广性不强；酶辅助提取条件温和、环境友好，但成本较高，酶制剂易残留；超声提取法具有高效、快速的优点，常与溶剂萃取法结合，以提高茶多酚得率并提升企业经济效益，但提取时间过长会影响提取效果[9-12]；微波提取法以穿透力强、可供选择溶剂较多且用量少、产物活性优良等为优势，适用于耐热成分的提取[13-16]。常见的提取工艺优化方法有均匀试验、正交试验(OED)、响应面优化(RSM)等[17]，均匀试验适用于多因素、多水平情况但追求最大化均匀性、忽略部分正交性导致了结果的不稳定性[18-20]，正交试验具有试验量少的优点但最佳参数仅局限于已设水平的组合[21]，在更加广泛的范围内考察各因素间的交互作用并希望得到高精确度的回归方程则多采用响应面优化法[22]。
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高级绿茶，实验前置于50 ℃烘箱干燥，研磨至细粉；茶多酚标准品(含量≥98%，乐美天医药科技有限公司)。
试剂: 无水乙醇、KH2PO4、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O (分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；没食子酸(纯度≥ 98%)、四水合酒石酸钠钾（分析纯，德国Ehrenstorfer公司）。
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仪器: IS09001电子分析天平(德国Sartorius公司)；G70D20CN1P-D2(S0)微波炉(广东格兰仕有限公司)；ANPEL 2300TH超声波清洗器(上海安谱有限公司)；UV2310 紫外-可见分光光度计[天美(中国)科学仪器有限公司]；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
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⑴精密称取0.252 5 g FeSO4·7H2O、1.251 3 g 四水合酒石酸钠钾，置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水充分溶解后稀释定容，摇匀即得酒石酸亚铁溶液。
⑵精密称取2.268 2 g KH2PO4置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L Na2HPO4水溶液；精密称取23.876 0 g Na2HPO4·12H2O置于1000 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L KH2PO4水溶液。将上述磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钠水溶液以3∶17的配比混合，搅匀，即得pH=7.5的磷酸盐缓冲液[16]。
⑶精密称取没食子酸0.050 0 g于50 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.0 mg/ml的没食子酸标准溶液。
⑷精密称取茶多酚标准品0.015 0 g于10 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.5 mg/ml茶多酚标准品母液。
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没食子酸标准曲线绘制: 取25 ml棕色容量瓶，分别加入0.00、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25ml的没食子酸标准溶液，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/ml没食子酸系列标准溶液。以0.00 μg/ml没食子酸溶液作为参比溶液，测定波长为540 nm对应的吸光度，绘制没食子酸标准曲线并计算线性回归方程[23, 24]。
茶多酚标准品校正因子f测定: 精密量取茶多酚标准品母液0.50 ml于25 ml容量瓶，照上述没食子酸标准曲线绘制中的溶液配制方法，即得30.00 μg/ml茶多酚标准品溶液。测定540 nm波长对应吸光度，将此数据代入没食子酸标准曲线回归方程求算ρ没食子酸，按下列公式即可求得f。
$${f}\text=\frac{{\rho}_{\text{茶多酚标准品}}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}}\text=\frac{\text{30.00}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}} $$ -
准确称取1.0 g高级绿茶粉末于250 ml锥形瓶，以不同提取条件微波辅助提取，提取液减压抽滤并弃去茶饼，准确量取澄清提取液的体积后保存适量提取液，精密量取0.30 ml于25 ml棕色容量瓶，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得提取液样品溶液。在波长540 nm处测定吸光度，茶多酚提取得率按下列公式计算:
$$\text{茶多酚提取得率}=\frac{{nf\rho V}}{{m}{×}{\text{10}}^{{-6}}}\times {100\%} $$ 式中：n为稀释倍数；f为校正因子；ρ为没食子酸质量浓度( μg/ml)；m为茶叶质量(g)；V为提取液体积( ml) [24]。
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以提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数、料液比为4项考察因素，设计相应的5个适宜水平进行茶多酚提取(见表1)，按“1.3.3”项下方法进行吸光度测定，计算茶多酚提取得率。
表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 -
依据单因素实验数据，选定各单因素的适宜水平，使用Design Expert 12.0.3.0统计软件下Box-Behnken方法[25]，把茶多酚提取得率作为响应值，设计四个因素三种水平优化提取工艺进行响应面实验，得到各因素与响应值的二次多项回归方程及方差分析模型，预测最佳提取工艺并进行验证。
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如图1，在没食子酸0.00 ~50.00 μg/ml浓度范围内，没食子酸标准曲线方程: A=0.015 9ρ+0.003 7(r=0.999 7)，吸光度A和没食子酸浓度ρ线性关系良好。
图 1 没食子酸标准曲线
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如图2所示，固定微波输出功率、料液比、乙醇体积分数，提取时间在10~90 s范围内，随着提取时间延长，茶多酚提取得率先增大后减小，提取时间为50 s时，茶多酚提取得率最大值为24.93%。原因推测由于时间过长，茶叶中除了茶多酚的其他易溶于乙醇的成分被提取出来，导致茶多酚的醇提液饱和[26]。因此最佳提取时间为50 s。
图 2 提取时间对茶多酚提取得率的影响
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如图3所示，固定提取时间、料液比、乙醇体积分数，微波输出功率在70~630 w范围内，茶多酚提取得率随微波功率的增加先上升后小幅降低，在提取时间为350 w时，茶多酚提取得率达到24.27%，为70~630 w范围内的最大值。原因推测为微波输出功率过低无法有效破碎细胞使其释放茶多酚，过高导致茶多酚被氧化破坏[27]。因此最佳微波输出功率为350 w。同时，当微波输出功率为210 w和490 w时，茶多酚提取得率相对于其他功率下较高，提示我们考察微波输出功率影响时，其范围可适当拓宽。
图 3 微波输出功率对茶多酚提取得率的影响
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如图4所示，固定提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数的条件下，料液比在1∶20 (g/ml) ~1∶100 (g/ml)范围内，茶多酚提取得率随料液比增加先增加，后逐渐稳定，在料液比为 1∶40 (g/ml)和1∶60 (g/ml)时，茶多酚提取得率分别达到24.95%和24.96%（最大值）。原因推测为料液比过低时溶剂量不足，导致提取不完全，由于料液比过高，茶多酚已经达到了较大溶出度、其他杂质溶出部分竞争茶多酚溶出空间[28]。因此最佳料液比为1∶60 (g/ml)。
图 4 料液比对茶多酚提取得率的影响
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如图5所示，固定提取时间、微波输出功率、料液比，乙醇体积分数在0%~80%范围内，随着乙醇体积分数增加，茶多酚提取得率先增大后减小，乙醇体积分数为60%时，茶多酚提取得率最大值24.59%。因此，最佳乙醇体积分数为60%。同时，把乙醇体积分数为0%与其他水平时对应的提取得率做对比，我们可以发现乙醇提取茶多酚效率远高于纯水提取。
图 5 乙醇体积分数对茶多酚提取得率的影响
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根据单因素实验中各因素水平对茶多酚提取得率的影响结果，按照表2的响应面设计方案并进行实验，结果如表3所示。
表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80 表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49 -
把提取时间(A)、微波输出功率(B)、料液比(C)、乙醇体积分数(D)作为自变量，茶多酚提取得率(%)Y作为因变量，进行回归方程拟合和方差分析，得回归方程如下：
Y=+25.58−1.36A−0.896 2B+2.52C−1.09D−1.97AB+0.604 3AC+0.929 6AD+1.28BC+1.33BD+0.868 1CD−1.23A2−2.70B2−3.96C2−2.99D2
回归模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，r=0.967 0，结果表明优化条件下茶多酚提取得率的实际值与二次回归方程的预测值吻合良好（表4），说明该数学模型适用于高级绿茶中茶多酚提取工艺的预测。其中，A、C、D、AB、B2、C2、D2对响应值茶多酚提取得率的影响极显著(P<0.01)，B、A2对响应值茶多酚提取得率的影响显著(P<0.05)。
表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28 -
将提取时间A、微波输出功率B、料液比C、乙醇体积分数D中任意两个因素作为X1、X2，将茶多酚提取得率设为响应值Z，创建两个因素相互作用的响应平面图。3D曲线单因素方向坡度越陡即斜率越大，反映出该单因素对茶多酚提取得率的影响越具显著性； 3D曲线越陡、等高线轮廓呈椭圆形，反映两个因素交互作用对茶多酚的提取得率有更显著的影响[29-32]。结合方差分析表，各因素对茶多酚提取得率的影响如下: 料液比(C)>提取时间(A)>乙醇体积分数(D)>微波输出功率(B)。同时，图6直观显示提取时间A和微波输出功率B交互作用对茶多酚提取得率的影响极为显著，其余因素间交互作用不显著，各交互作用对茶多酚提取得率的影响如下: AB>BD>BC>AD>CD>AC。
图 6 各因素交互作用对茶多酚提取得率响应面和等高线图
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利用所得二次回归方程模型预测绿茶中茶多酚的最佳提取工艺为: 提取时间37.41 s、微波输出功率369.28 w、料液比1∶45.13 (g/ml)、乙醇体积分数55.44%，该优化条件下茶多酚预测提取得率为26.42%。从实际实验条件出发，将最佳提取条件修改为: 微波提取时间37s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，并进行三次平行重复实验验证，茶多酚平均提取得率为25.56%。
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茶多酚是绿茶中的一类多酚活性物质，本实验通过建立没食子酸标准曲线、引入校正因子测算茶多酚提取得率。从支持绿色工艺和溶剂常用性角度，本实验采用常见的食品级溶剂乙醇萃取技术取代传统的有害有机溶剂萃取技术[12]。基于响应面优化法试验次数少、周期短优势[14]，为解决前期文献中有关微波提取茶多酚的报道大多局限于单因素实验研究而缺乏优化的系统实验方案[33]、各因素水平选取范围参差不齐[13, 34]以及其他工艺优化方法低精度、预测差等问题，本实验考察了微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4个单因素对茶多酚提取得率的影响，并确定各单因素适宜范围，在此基础上采用响应面优化方法预测了最佳提取条件，考虑到实际生产所需调整茶多酚最佳提取条件，并进行三次平行重复实验验证。
实验结果表明响应面设计茶多酚提取得率实际值与理论值相差不大，证明响应面实验设计在优化茶多酚提取工艺方面具有可靠性。综上，响应面优化微波辅助茶多酚的提取工艺具有操作性强、生产周期短、生产成本较低、准确度高、稳定性强的优势，能同步考察较多因素对工艺的综合影响，为茶多酚的实际生产领域提供技术支撑，在茶多酚大规模工业化生产方面具有较大的应用潜力[35, 36]。
Optimization of microwave-assisted extraction of green tea polyphenols by response surface methodology
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摘要:
目的 优化微波辅助绿茶茶多酚的提取工艺。 方法 建立没食子酸标准曲线，通过引入校正因子测定绿茶提取液中茶多酚浓度以计算茶多酚提取得率；重点研究微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4项单因素水平对茶多酚提取得率的影响，初步确定4项单因素水平的适宜范围，并采用响应面法进一步提高绿茶茶多酚提取工艺。 结果 最佳提取工艺为：提取时间37 s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，茶多酚实际提取得率为25.65%，与理论值相差不大。 结论 响应面优化的微波辅助绿茶茶多酚提取工艺省时可行、提取得率较高。 Abstract:Objective To optimize the microwave-assisted extraction process of green tea polyphenols. Methods The extraction yield of tea polyphenols was figured up by building the standard curve of gallic acid and examining the concentration of tea polyphenols in green tea extract with the introduction of a correction factor. The effects of four single factor levels of microwave extraction time, microwave output power, liquid-to-material yield, and ethanol volume fraction on the extraction yield of tea polyphenols were primarily studied in this experiment. The response surface was applied to further optimize the extraction process of green tea polyphenols after exploring the appropriate range of four single factor levels. Results The optimal extraction process was as follows: extraction time 37 s, microwave output power 350 w, material - liquid yield 1∶45 (g/ml), ethanol volume fraction 55%, and the actual extraction yield of tea polyphenols was 25.65%, which was not much different from the theoretical value. Conclusion The microwave-assisted green tea polyphenol extraction process optimized by response surface methodology is time-saving and practicable, and the extraction yield is high. -
Key words:
- green tea /
- tea polyphenols /
- content determination /
- response surface optimization /
- extraction process
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西红花为名贵药材，来源于鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。原产于地中海地区、希腊、小亚细亚和伊朗，后经西藏传入国内，故又名藏红花[1]。《本草纲目》中记载番红花“主治心忧郁积、气闷不散，活血，亦治惊悸”[2]。2020版《中国药典》描述西红花具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[3]。越来越多的现代药理研究表明，西红花具有抗肿瘤、抗血小板聚集与凋亡、抗心血管细胞凋亡、降血脂和降血糖等活性[4–6]，在健康和医疗领域具有重要作用。
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据，2020年全球癌症新发患者病例数超过1 930万例，癌症死亡患者接近1 000万例[7]。天然活性成分是抗肿瘤药物研发的重要来源[8]。有研究表明，西红花中特有的西红花酸、西红花苷等具有抗肿瘤活性[9]，已有学者在西红花治疗结直肠癌、乳腺癌等的抗肿瘤作用方面进行了相关研究[10-11]，但其主要活性成分及抗肿瘤作用机制仍需进一步探索。
网络药理学[12]将系统生物学、生物信息学、计算生物学、网络科学和靶向药理学相结合，从系统层次和生物网络的整体角度探讨成分—靶标—通路的相互作用关系，为中药多靶点、多成分、系统性、整体性的作用机制研究提供了有力的技术支撑，从而指导新药研发和临床诊疗。因此，本研究应用网络药理学结合反向分子对接的方法，对西红花的抗肿瘤作用成分及靶点机制进行研究，为深入探索西红花抗肿瘤药效物质基础及作用机制提供参考。
1. 方法
1.1 西红花化学成分获取
利用TCMSP平台获取西红花化学成分，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL) 是药物筛选的关键参数，一般设置OB≥30%和DL≥0.18的化学成分作为候选药效成分，并结合文献报道[13–15]补充4个西红花化学成分。
1.2 西红花活性成分和肿瘤疾病相关靶点整理
应用TCMSP平台和PharmMapper[16]工具获取西红花活性成分的作用靶点，并借助UniProt数据库将靶点转换为对应基因。以“tumor”、“cancer”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）和TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行检索。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，作为药物作用于疾病的预测靶点。
1.3 “成分-靶点”网络的构建
根据预测的西红花药效成分、交集靶点，使用Cytoscape 3.9.1软件建立“成分-靶点”的网络图。
1.4 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）的构建与分析
将药物疾病交集靶点输入String数据库构建PPI网络进行初步筛选，再将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1中，以半数degree为参考标准，选取关键靶点。
1.5 基因功能注释和富集通路分析
将筛选获得的37个核心靶点录入Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html），物种设置为人，选择Custom Analysis，设置P<0.01，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
1.6 分子对接
将筛选出的西红花主要活性成分通过PubChem下载SDF格式；利用RCSB PDB数据库下载关键蛋白靶点，优先选择有配体、结构相对完整的晶体结构，并采用AutoDock Tools对获取的PDB蛋白分子进行除水、加氢、计算电荷预处理；使用AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能；选取最优构象，使用PyMOL软件做出3D结合模式图。
2. 结果
2.1 西红花化学成分获取
通过TCMSP获得70个西红花化学成分，设置OB≥30%且DL≥0.18进行筛选，再添加文献检索相关成分，共获得9个西红花活性成分，见表1。
表 1 西红花活性成分序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 2.2 西红花活性成分和肿瘤疾病靶点
将TCMSP平台和PharmMapper获取结果进行整理，并借助UniProt数据库进行靶基因匹配，获得201个潜在靶点。以“tumor”和“cancer”为关键词，在GeneCards、OMIM和TTD数据库进行预测整理，剔除重复，筛选得到5896个潜在疾病靶点。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，共得到可作为药物作用于疾病的179个预测靶点。
2.3 “成分-靶点”网络的构建与分析
将西红花的9个活性成分与预测到的179个潜在靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络（图1），网络中绿色代表药物作用于疾病的靶点，蓝色代表西红花活性成分，全图包括189个节点、299条边，其中degree值排名靠前的活性成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ，这些可能是西红花发挥抗肿瘤作用的潜在活性成分。
2.4 蛋白相互作用PPI的构建与分析
将疾病与活性成分的潜在靶点导入String数据库，采用Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，依据degree值进行排序，以大于半数degree值为标准进行两次筛选，获取核心靶点37个（图2）。度值排名前5的靶点分别为EGF、MMP9、NFKBIA、IL-1B和IL-10，提示这些靶点可能是西红花发挥抗肿瘤作用的关键潜在靶点。
2.5 基因功能注释和富集通路分析
GO分析常用于注释基因和基因产物生物功能，分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）三部分。此次GO富集分析共得到BP富集结果193个、CC富集结果83个和MF富集结果123个，选取排名前10的条目绘制GO功能分析图（图3）。如图3所示，BP主要涉及对激素的反应、对脂质的反应、对异源刺激的反应等；CC主要涉及膜筏、膜微区、囊腔、细胞质囊泡腔等；MF主要涉及转录因子结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等。通过比较发现，细胞生物过程富集的基因数较多，说明西红花可能主要通过调节生物过程发挥抗肿瘤作用。
KEGG分析共富集到194条信号通路，其中34条癌症相关通路，并对前20条通路绘制气泡图（图4）。依据KEGG分析，西红花可能通过p53信号通路、TNF通路发挥抗肿瘤作用,可能对膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤具有治疗作用，西红花靶点-通路相互作用网络见图5，红色三角形代表与肿瘤相关的信号通路，蓝色矩形代表关键靶点。其中，西红花通过膀胱癌信号通路调控EGF、MMPs、Raf、VEGF、ERK等基因发挥抗肿瘤作用（图6），红色矩形代表西红花可能干预的关键靶点。
2.6 分子对接
将前15个潜在核心靶点与西红花活性成分进行分子对接。结合能(affinity)<0表明配体分子能够与受体蛋白自发结合，结合能≤−17.78 kJ/mol表明配体与受体有一定的结合活性，结合能≤−20.92 kJ/mol 表明配体与受体有较好的结合活性，结合能≤−29.29 kJ/mol 表明配体与受体有强的结合活性[17],且结合能越低,表明对接的效果越好，结合的构象越稳定[18]。经AutoDock Vina对接，将得到的结合能数据使用热图展示（图7）。本研究结合自由能小于−20.92kJ/mol 的活性成分有102个，占75.6%；小于−29.29kJ/mol 的活性成分有73个，占54.1%，可见这些核心化合物与受体结合活性较高，结构相对稳定。选取结合能力最好的4个组合用Pymol软件进行可视化处理（图8）。
3. 讨论
肿瘤的发生和发展是多基因、多步骤的结果。中药多成分、多靶点的特点使其在肿瘤治疗方面有独特的优势。大量的临床实践表明，中药在治疗肿瘤中能够改善症状、提高患者生存质量、延长生存期等，有着其他治疗药物及手段不可替代的作用[19-20]。以中药黄芪为例，不仅可以通过Wnt5/β-catenin信号通路抑制肿瘤生长[21]，同时具有通过PD-L1下调诱导耐药黑色素瘤的干性抑制和化疗敏感性增强的作用，可以减少化疗药物用量[22]，还能充当免疫佐剂，提高患者免疫力，改善生存质量[23]。网络药理学最大的优势在于可以运用系统生物学的分析，为中药多成分、多靶点、多通路的机制研究提供有力的技术支撑[12]，其分析理念和技术路径又与中医药治疗疾病的整体观相契合，已用于多种中药和中药复方作用机制的研究，如灯盏细辛、半枝莲等中药和茵陈蒿汤、桃红四物汤等中药复方，利用网络药理学的方法得到治疗机制的详细阐述和证明[24–27]，为中药药理作用机制的探索提供了很好的参考。
本研究发现西红花中多种成分，如西红花酸、西红花苷等可与IL-6、AKT1、CCND1、IL-1β、MMP9、EGFR、TP53靶点产生适度结合，提示这些靶点可能是西红花中活性成分发挥抗肿瘤作用的关键靶点。研究发现，AKT1是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的重要靶点，被磷酸化激活后可以促进细胞的增殖与存活，与肿瘤细胞的生长密切相关[28]。多项研究表明，通过抑制AKT1可以治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种实体癌[29]。EGFR与一些全球发病率和致死率高的癌症发病机制直接或间接相关，包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌等[30]。当EGFR过度表达时，细胞表面会出现过量的受体，诱导正常的细胞转化为癌细胞，并为癌细胞持续生存提供条件[31]。CCND1是细胞周期家族的一员[32]，公认的原癌基因,在甲状旁腺瘤、乳腺癌、肝癌及食管、肺、头颈部鳞状细胞癌的发生、发展过程中均起着重要作用[33-34]。西红花苷是由西红花酸和龙胆二糖或葡萄糖结合形成的二萜苷类化合物，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的差别在于分子中糖苷基数目的多少 [35]。西红花酸已具有抗肿瘤作用，以其为苷元形成的西红花苷同样也表现出较好的抗肿瘤活性，其中西红花苷Ⅱ的表现最好。西红花苷可以通过P53途径下调细胞周期蛋白d1和p21的表达，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，从而抑制肿瘤生长[36]。分子对接的结果与GO富集分析、KEGG通路富集分析结果一致，验证了网络药理学分析结果的正确性。
Buyun等学者在肝癌Hep3B和HepG2细胞中使用西红花苷抑制了IL-6对STAT3以及细胞周期蛋白D1的激活，验证了西红花对肝癌细胞的抗增殖，凋亡和阻断入侵作用[37]。在转移性乳腺癌的研究中，Ali等研究人员在体内和体外实验中均证明了西红花苷可以通过VEGF和MMP9下调发挥抗肿瘤作用，而且对乳腺癌的转移扩散有较好的抑制作用[38]。这些研究成果在一定程度上验证了利用网络药理学探究发现的西红花抗肿瘤作用机制的可行性。
综上所述，本研究利用网络药理学结合分子对接技术，探究西红花抗肿瘤作用的活性成分、作用靶点及信号通路。发现西红花抗肿瘤的作用具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，其中以西红花苷为代表的西红花特有化学成分显示出了良好的抗肿瘤活性，可以在多条肿瘤发生通路中发挥作用，为西红花治疗肿瘤的深入研究提供了理论基础。但这些结果受限于各个数据库信息的片面性，而且只关注了成分，没有考量到成分的含量及其之间是否存在相互作用，预测的结果存在一定的片面性和局限性，需要进一步进行体内、外实验验证。
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表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 
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表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80
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表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49
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表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28
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[1] 陈峰, 尹鹏, 郭桂义, 等. 响应面法优化提取绿茶茶多酚工艺研究[J]. 茶叶通讯, 2020, 47(4):659-664. [2] DENG G Y, WU Y, SONG Z Y, et al. Tea polyphenol liposomes overcome gastric mucus to treat Helicobacter pylori infection and enhance the intestinal microenvironment[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2022,14(11):13001-13012. doi: 10.1021/acsami.1c23342 [3] WANG D X, WANG T T, LI Z M, et al. Green tea polyphenols upregulate the Nrf2 signaling pathway and suppress oxidative stress and inflammation markers in D-galactose-induced liver aging in mice[J]. Front Nutr,2022,9:836112. doi: 10.3389/fnut.2022.836112 [4] YE Y S, WARUSAWITHARANA H, ZHAO H Y, et al. Tea polyphenols attenuates inflammation via reducing lipopolysaccharides level and inhibiting TLR4/NF-κB pathway in obese mice[J]. Plant Foods Hum Nutr,2022,77(1):105-111. doi: 10.1007/s11130-021-00937-0 [5] 李露, 吕佳倩, 江承佳, 等. 茶多酚对心血管保护作用的研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(19):283-288. [6] 叶晴, 刘毅, 陈金鹏, 等. 绿茶化学成分及药理作用研究进展[J]. 药物评价研究, 2021, 44(12):2711-2719. [7] RAJAN L, RADHAKRISHNAN A, ALAGARSAMY K N, et al. Green tea polyphenols in cardiometabolic health: a critical appraisal on phytogenomics towards personalized green tea[J]. PharmaNutrition,2022,20:100296. doi: 10.1016/j.phanu.2022.100296 [8] 左小博, 孔俊豪, 杨秀芳, 等. “十三五”期间我国茶叶深加工科技发展报告[J]. 中国茶叶加工, 2021(3):5-11. [9] 杨新, 陈莉, 卢红梅, 等. 茶多酚提取与纯化方法及其功能活性研究进展[J]. 食品工业科技, 2019, 40(5):322-328,332. [10] 郝治华, 李颖, 张唐伟, 等. 响应曲面法优化复合酶提取林芝绿茶中茶多酚工艺[J]. 河北师范大学学报(自然科学版), 2021, 45(1):53-60. [11] 李文婷, 车振明, 罗梦莹. 超临界CO2萃取绿茶中茶多酚工艺的研究[J]. 食品工业, 2011, 32(7):22-24. [12] 左小博, 孔俊豪, 杨秀芳, 等. 茶多酚产业现状与发展展望[J]. 中国茶叶加工, 2019(4):14-20. [13] 李刚凤, 汪辉喜, 陈仕学, 等. 微波法提取低档绿茶多酚工艺研究[J]. 粮食与油脂, 2015, 28(1):60-62. [14] 李石敬敏, 许军, 高颖洁, 等. 超声-离子沉淀法提取茶多酚及茶多酚还原修饰石墨烯研究[J]. 化工技术与开发, 2018, 47(6):14-18. [15] 王凯博, 逄涛, 陶丽红, 等. 废弃茶叶中茶多酚的超声波辅助提取及纯化工艺研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2016, 31(5):959-966. [16] 张龙笛. 南丰蜜桔果皮精油和果胶的分离提取研究[D]. 南昌: 江西科技师范大学, 2021. [17] 赵少甫, 韩伟. 试验设计与优化方法在中药提取中的应用[J]. 机电信息, 2016(20):38-45. [18] 孙丽娜, 杨源涛, 王雪怡, 等. 响应面优化法在药学领域的应用[J]. 科技创新与应用, 2017(23):36-37. [19] 魏佳宁, 郝昊, 常衢通, 等. 基于演化算法的约束区域均匀仿真实验设计方法[J]. 系统仿真学报, 2021, 33(7):1591-1599. [20] 杨晓丽, 徐云惠, 陈静. 应用MATLAB实现茶多酚提取均匀试验设计数据的高效拟合[J]. 昭通学院学报, 2014, 36(5):32-35. [21] 王跃生, 欧阳旭, 王丹辉, 等. 数学模式试验设计方法的优缺点比较及其在中药研究应用中的适宜性分析[J]. 中药新药与临床药理, 2010, 21(2):207-210. [22] BETTIN F, COUSSEAU F, MARTINS K, et al. Effects of pH, temperature and agitation on the decolourisation of dyes by laccase-containing enzyme preparation from Pleurotus sajor-caju[J]. Braz Arch Biol Technol,2019,62(03):e19180338-e19180359. [23] 曾光远, 王飞. 影响酒石酸铁比色法测定结果的因素[J]. 监督与选择, 2008(S1):67-69. [24] 邓祥, 韩伟. 酒石酸亚铁-标准曲线法检测绿茶提取物中茶多酚含量[J]. 南京工业大学学报(自然科学版), 2020, 42(5):677-682. [25] 张小荣, 耿广琴, 赵沙沙, 等. Box-Behnken响应面法优化红芪多糖水提醇沉工艺研究[J]. 中兽医医药杂志, 2022, 41(2):7-14. [26] SANG S M, LAMBERT J D, HO C T, et al. The chemistry and biotransformation of tea constituents[J]. Pharmacol Res,2011,64(2):87-99. doi: 10.1016/j.phrs.2011.02.007 [27] 蒋丽, 王雪梅, 全学军, 等. 不同提取方法对茶多酚理化性质的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(14):136-139. [28] DRUZYNSKA B, STEPNIEWSKA A, WOLOSIAK R. The influence of time and type of solvent on efficiency of the extraction of polyphenols from green tea and antioxidant properties obtained extracts[J]. Acta Sci Pol Technol Aliment,2007,6(1):87-99. [29] 兰林, 汪晟羽, 张晋森, 等. 响应面法优化竹叶青茶末中茶氨酸的提取工艺[J]. 茶叶通讯, 2021, 48(4):701-706,711. doi: 10.3969/j.issn.1009-525X.2021.04.017 [30] 叶文斌, 马应丽, 李娜, 等. 响应面法优化陇南黄樱桃低糖保健酱配方研究[J]. 保鲜与加工, 2021, 21(12):51-58. [31] 赵滢, 刘利娥, 韩萍, 等. 响应面法优化超声辅助提取蔓菁多糖工艺及其体外抗氧化性研究[J]. 食品工业科技, 2020, 41(7):139-145. [32] 朱莹, 陈红名, 白雅芝, 等. 响应面法优化超声辅助提取芒果多糖工艺[J]. 吉林医药学院学报, 2021, 42(2):90-93. [33] 谢小花, 戴缘缘, 陈静, 等. 微波法从绿茶中提取茶多酚的工艺研究[J]. 佳木斯大学学报(自然科学版), 2019, 37(3):443-446. [34] 徐方祥, 郑博文, 苏袁宁, 等. 微波辅助双水相提取绿茶中茶多酚的研究[J]. 食品工业科技, 2017, 38(17):188-192,201. [35] 成荣敏, 詹从红, 夏婷婷, 等. 响应面分析法及其在大学化学实验中的应用研究[J]. 化学教育(中英文), 2021, 42(2):30-33. [36] 张扬, 钱磊, 訾惠君, 等. 响应面分析法在食用菌领域的应用[J]. 中国食用菌, 2021, 40(5):1-4. -
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