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随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药问题已经成为全球面临的严重公共卫生挑战。近年来，在院内分离菌株中，革兰阴性菌（G−菌）占比远超革兰阳性菌（G+菌)，其中耐药株日益增多[1]，特别是耐碳青霉烯类肠杆菌属（CRE）、多重耐药（MDR）和泛耐药（XDR），甚至全耐药（PDR）菌株的出现（具体定义参考国际专家建议的暂行标准[2-3]），给临床抗感染治疗带来更多困难。并且不同地区抗菌药物应用和耐药菌流行分布有所不同，在2020年全国耐药监测报告中发现，各种耐药菌检出率排名前3位的地区中，北京市、上海市和河南省出现次数较多，如上海市、河南省及北京市是全国耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CR-KPN）检出率最高的3个地区[4]。作为上海市北部的区属某二级综合医院（以下简称本院），周边社区老年患者多，2022年起又承担着大量新冠患者救治任务，因此本院抗菌药物的使用量一直居高不下。
本研究收集本院2018年7月至2023年3月细菌的分离检出数据，分析近年来院内耐药菌变化趋势，有助于临床合理选择和使用抗菌药物，也为制定抗菌药物管理策略提供了数据基础。
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收集2018年7月1日至2023年3月31日本院临床分离的菌株，本次入院时间段内同一患者同一标本取第一次送检结果，并剔除重复菌株。采用法国梅里埃公司的vitek2_compact细菌鉴定仪进行菌株鉴定。
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本院主要采用MIC法，K-B法辅助进行药物敏感性试验，检验结果参考美国临床实验室标准协会（CLSI）指南。质控菌株有大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC25923等。
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使用院内检验系统、Excel软件等对每个季度分离菌株的类型和细菌耐药情况等进行统计分析和数据整理。
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菌株标本主要来源于粪便、血液、尿液、分泌物、脓液和呼吸道标本等。其中血液标本阳性率7.97%，呼吸道标本（咽拭子+痰液）阳性率33.04%，粪便标本阳性率4.59%，中段尿标本阳性率30.26%。
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2018年7月1日至2023年3月31日本院共分离检出细菌病原菌14 844株，其中G+菌4 757株（32.05%）、G−菌10 087株（67.95%），G−菌检出的菌株数是G+菌的2倍多。本院G−菌和G+菌各季度检出率较平稳，分别为68.22%和31.78%。可以看出本院致病病原细菌以G−菌为主，也是需要关注的焦点。
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G−菌中最为常见的是大肠埃希菌（G−菌中占比30.25%）、肺炎克雷伯菌（G−菌中占比29.04%）、铜绿假单胞菌（G−菌中占比22.59%）和鲍曼不动杆菌（G−菌中占比15.70%），如表1所示。
表 1 临床分离检出G−菌菌株的分布情况
菌株 菌株数 构成比（%） 大肠埃希菌 3 051 30.25 肺炎克雷伯菌 2 929 29.04 铜绿假单胞菌 2 279 22.59 鲍曼不动杆菌 1 584 15.70 如图1所示，2018年7月至2023年3月各季度检出G−菌病原菌构成比和具体检出数值基本较为稳定（2022年第2季度本院成为疫情定点医院，标本数量较少，存在一定偶然性）。大肠埃希菌占总检出菌株数的20%左右，呈下降趋势，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌在15%左右，其中肺炎克雷伯菌检出率呈上升趋势，于2020年第2季度起总体上超过大肠埃希菌检出率位居第一，铜绿假单胞菌检出率略低于肺炎克雷伯菌，近5年来鲍曼不动杆菌检出率上升较为明显，由2018年第3季度的4.96%上升至2023年第1季度的18.75%。
图 1 2018年第3季度至2023年第1季度G−菌构成比各季度检出折线图
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本院对检出的肠杆菌科细菌均进行了产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）监测。2022年大肠杆菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的检出率为43.23%和19.50%；对碳青霉烯耐药的大肠杆菌（CR-EC）和肺炎克雷伯菌检出率分别为2.92%和58.07%，对亚胺培南的耐药率逐渐趋于平稳（图2）；喹诺酮类耐药大肠杆菌（QNR-EC）检出率为58.91%，头孢曲松耐药肺炎克雷伯菌（CRO-R KP）检出率为62.41%。但头孢唑林对上述两种肠杆菌的耐药率有下降趋势 （图3）。总体上看肺炎克雷伯菌的耐药形势较大肠杆菌更为严峻，对头孢菌素类、喹诺酮类、β-内酰胺酶抑制剂（除阿维巴坦）和呋喃妥因的耐药率均>50%，对氨基糖苷类和复方新诺明耐药率>30%，仅对替加环素和头孢他啶/阿维巴坦较为敏感，具体数据详见表2。
图 2 大肠杆菌和肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药率折线图
图 3 大肠杆菌和肺炎克雷伯菌头孢唑林耐药率折线图
表 2 2022年大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药率（%）
检测项目 大肠埃希菌
（n=393）肺炎克雷伯菌
（n=331）ESBL检测 43.23 19.50 氨苄西林 78.64 100.00 氨苄西林/舒巴坦 35.56 66.42 哌拉西林/他唑巴坦 3.21 57.08 头孢唑林 56.95 66.22 头孢呋辛 64.52 55.57 头孢曲松 53.41 62.41 头孢他啶 26.48 60.59 头孢吡肟 16.25 57.85 头孢替坦 4.44 53.33 头孢哌酮/舒巴坦 5.34 56.82 头孢他啶/阿维巴坦 1.32 1.89 氨曲南 32.87 60.00 亚胺培南 2.51 55.76 美罗培南 2.52 55.46 厄他培南 2.92 58.07 庆大霉素 29.43 50.70 妥布霉素 10.06 47.54 阿米卡星 2.17 32.99 替加环素 0.31 4.62 环丙沙星 58.91 60.83 左氧氟沙星 58.88 60.57 复方新诺明 41.07 39.58 呋喃妥因 1.45 50.31 -
2022年碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CR-PA）和鲍曼不动杆菌（CR-AB）的检出率为22.02%和74.34%，2020年耐药率上升，现趋于稳定（CR-PA检出率约25%，CR-AB检出率约80%）；多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）检出率26.41%，多重耐药鲍曼不动杆菌（MDR-AB）的检出率为74.34%；铜绿假单胞菌对氨基糖苷类、头孢他啶和头孢吡肟敏感性较好，耐药率均<20%，对氟喹诺酮类的耐药率<30%。鲍曼不动杆菌耐药性高，对头孢菌素类、碳青霉烯类和喹诺酮类的耐药率均>70%，对氨基糖苷类的耐药率>60%，仅对替加环素敏感率高，具体数据详见表3。
表 3 2022年铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药率（%）
检测项目 铜绿假单胞菌
（n=269）鲍曼不动杆菌
（n=289）氨苄西林 100.00 100.00 氨苄西林/舒巴坦 98.83 62.17 哌拉西林/他唑巴坦 5.10 70.88 头孢唑林 100.00 100.00 头孢呋辛 − − 头孢曲松 98.83 71.93 头孢他啶 6.44 72.10 头孢吡肟 5.73 72.71 头孢替坦 100.00 100.00 头孢哌酮/舒巴坦 6.49 49.85 头孢他啶/阿维巴坦 4.03 − 氨曲南 19.69 100.00 亚胺培南 22.02 72.10 美罗培南 17.48 74.34 厄他培南 − − 庆大霉素 17.28 67.03 妥布霉素 18.68 66.36 阿米卡星 0 60.83 替加环素 − 3.37 环丙沙星 26.41 73.61 左氧氟沙星 24.13 72.05 复方新诺明 98.83 23.79 呋喃妥因 100.00 100.00 注：“−”表示不适用。 -
近5年本院检出数居于前列的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌和表皮葡萄球菌，2022年病原菌的流行分布情况与Chinet报道[5]基本一致。本院各季度细菌分离检出构成比基本稳定，反映出本院收治的患者及病种较为稳定，未出现院内感控问题。但细菌耐药仍较严重，特别是G− 菌CRE（对碳青霉烯类抗生素耐药菌）、MDR和XDR问题。肺炎克雷伯菌耐药形势严峻，总体耐药率要高于Chinet报道[5]。大肠杆菌的耐药率与Chinet报道[5]大体一致。碳青霉烯类一直被称为治疗肠杆菌科多重耐药菌（尤其是ESBLs菌）的“最后一道防线”，但随着抗菌药物的滥用，对其的耐药菌株的检出率呈上升趋势[6]。2022年本院肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率远高于2022年Chinet报告中的22.60%和24.20%，在2021年第2季度也开始出现对厄他培南耐药菌株，2023年第1季度对亚胺培南耐药率高达54.82%。
目前提出4种CRE耐药机制：①产碳青霉烯酶（产KPC为主的A类碳青霉烯酶、以锌离子为活性中心的B类金属β-内酰胺酶和D类的OXA-48）；②产AmpC酶或ESBLs合并外膜蛋白的丢失或改变；③结合位点的缺失、数量下降或亲和性降低/药物作用靶点的改变；④外排泵的高表达/细菌外排泵系统的改变。碳青霉烯酶又分为A类、B类和D类[7]。经研究表明，CRE耐药机制主要是产碳青霉烯酶，其中CR-KP最常见，其耐药机制与总体CRE一致并有相关研究[8-11]佐证。另外有研究表明，CR-KP重要的是有AcrAB-TolC外排泵，该泵是由外膜通道TolC、位于内膜的继发性主动转运体AcrB和周质蛋白AcrA三者构成的完整膜蛋白，该主动转运系统可有方向性的运输不同的化合物，使得肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物产生耐药[12]。CRE对目前临床上常应用的绝大多数抗菌药物都耐药，给临床治疗带来巨大困难。在应对泛耐药Kpn，有研究[13]提出增加药物敏感试验（CLSI未推荐）的种类，为临床治疗感染提供有效选择。
本院非发酵菌（特别是鲍曼不动杆菌）分离检出率有逐渐上升趋势，临床上分布广泛，耐药形势极为严峻。CR-AB检出率要高于2022年Chinet监测[5]。鲍曼不动杆菌已成为我国医院感染最主要病原菌，在院内广泛存在，且其抵抗力强、定植和污染多，可通过医务工作者的手和污染的医疗器械以及空气等引起院内感染，病死率高[14]。本院鲍曼不动杆菌检出率增长过快，且对大多数抗菌药物的耐药率高于75%。肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等细菌耐药未能有效改善，以及近年来出现CRE、MDR和XDR问题等，这些情况都需要引起临床警惕。在2020年第1季度本院细菌耐药有小幅度上升情况，可能与疫情爆发，大量使用抗菌药物进行经验治疗有一定相关性。
前7批国家组织药品集中带量采购，已有42种抗菌药物（不包括局部用药）被纳入其中，美罗培南、法罗培南、厄他培南已被纳入第7批集中大量采购中。有专家对于碳青霉烯类纳入集采表示担忧，为此，中华医学会临床药学分会与中华医学会细菌感染与耐药防治分会针对医疗机构在抗菌药物集采执行过程中面临的问题，组织药学、感染、医保、政策及方法学专家共同撰写专家共识[15]。抗菌药物目录管理在药品集采常态化背景下，医疗机构应主动及时开展抗菌药物供应目录遴选和评估工作，确保本医疗机构抗菌药物目录科学合理前提下，开展病原菌耐药情况的分析和研究，有助于提高临床抗感染治疗的针对性和有效性，更能及时发现问题和遏制细菌耐药。
Retrospective analysis of the epidemic characteristics of Gram-negative bacteria in a second-class hospital in Shanghai
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摘要:
目的 回顾性分析医院内分离病原细菌（特别是革兰阴性菌，G−菌）的分布情况和耐药特征，以促进医院合理使用抗菌药。 方法 收集2018年7月至2023年3月每季度全院分离检出的病原菌以及药物敏感试验结果，并进行回顾性分析。 结果 共分离检出病原细菌14 844株，其中，革兰阳性菌（G+菌）4 757株（32.05%），G−菌10 087株（67.95%）。产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌检出率为43.23%，对碳青霉烯类和加酶抑制剂保持着较高的敏感性，敏感率约99.00%。肺炎克雷伯菌的耐药情况较为严重，出现耐碳青霉烯、多重耐药和泛耐药菌。2022年，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌检出率为54.82%；非发酵菌中碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌和碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的检出率为22.02%和74.34%，多重耐药的鲍曼不动杆菌的检出率>70%。 结论 G−菌耐药问题仍较为严重，特别是肺炎克雷伯和鲍曼不动杆菌。细菌耐药问题给临床治疗带来极大的挑战，有必要进行定期监测以促进合理用药。 Abstract:Objective To retrospectively analyze the distribution and drug resistant characteristics of isolated pathogens （especially Gram-negative bacteria） in hospital and promote the rational use of antibacterial drugs. Methods The pathogens and drug sensitivity test results were collected from the whole hospital every quarter from July 2018 to March 2023, and were conducted retrospective analysis. Results A total of 14 844 pathogens were isolated and detected, including 4 757 Gram-positive bacteria （32.05%） and 10 087 Gram-negative bacteria （67.95%）. The detection rate of extended spectrum beta-lactamases Escherichia coli was 43.23%, and it maintained high sensitivity to carbapenems and enzyme inhibitors, and the sensitivity rate was about 99.00%. The drug resistance of Klebsiella pneumoniae was more serious, and carbapenem-resistant, multi-drug resistance and extensively-drug resistance appeared. In 2022, the detection rate of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was 54.82%; the detection rates of carbapenem-resistant Pseudomonas Aeruginosa and carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in non-fermentative bacteria were 22.02% and 74.34%, the detection rate of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii was >70%. Conclusion The problem of drug resistance of Gram-negative bacteria was still serious, especially in Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii. The problem of bacterial resistance poses great challenges to clinical treatment, and it is necessary to conduct regular monitoring and promote rational drug use. -
Key words:
- bacterial resistance /
- antibiotics /
- Gram-negative bacteria
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复方金钱草颗粒由广金钱草、车前草、光石韦以及玉米须四味中药材组成，现执行标准为《中国药典》（一部）2015年版及国家食品药品监督管理总局药品补充批件（2016B00026）。该药具有清热利湿、通淋排石的作用，在临床上用于治疗湿热所致的热淋、石淋，症见尿频、尿急、尿痛、腰痛的患者，以及泌尿系结石、尿路感染见上述证候者[1]。现代药理学研究也显示复方金钱草颗粒具有防治草酸钙结石形成、促进输尿管蠕动和增加尿量、抗炎[2-5]及增加冠脉血流量、保肝利胆[3-5]、免疫调节等作用[5]。复方金钱草颗粒中的化学成分包含黄酮类[5-8]、甾醇类[5,7-9]、生物碱类[5-7]、萜类[5,7,9]、酚酸类[5-6,8]、挥发油[5,7]、多糖类等[6-7]。由于复方金钱草颗粒成分复杂，目前尚无全面的化学成分鉴定工作。本研究致力于建立起一种快速有效的系统分析方法，同时定性地鉴别其多种化合物成分，为其有效成分研究提供依据。
1. 试剂与仪器
1.1 试剂
分析纯无水乙醇（中国医药集团上海化学试剂公司）；质谱纯甲酸、质谱纯乙腈、0.22 µm滤膜（德国Merck集团）；复方金钱草颗粒（规格：10g，广西万通制药有限公司）
1.2 仪器
BP121S电子分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q A10超纯水净化系统(美国Millipore公司)；KQ-400KDB超声波清洗器（400W, 40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；X1R-230 V台式离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6538四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）。
2. 试验方法
2.1 色谱和质谱条件
2.1.1 色谱条件
采用Agilent 1290超高效液相色谱仪(UHPLC)，色谱柱为XBridge BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 2.5 µm )，柱温为40 ℃，进样量为3 µl，流动相由0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)组成，梯度洗脱，洗脱条件见表1，分析时间为19 min，流速为0.4 ml/min。
表 1 流动相梯度洗脱条件时间(t/min) A(%) B(%) 0 98 2 2 98 2 12 40 60 17 2 98 19 2 98 2.1.2 质谱条件
采用Agilent 6538四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF/MS)，质谱参数如下：电喷雾离子源（正离子模式）；质谱扫描范围: 50～1500 m/z；干燥气温度为350 ℃；干燥气流速为11 L/min；雾化气压力为45 psig；毛细管电压为4000 V；碎片电压为120 V；Skimmer电压为60 V；参比离子m/z为121.0509和922.0098。
2.2 供试品溶液制备
精密称取2.0 g复方金钱草颗粒，置于50 ml具塞三角烧瓶中，加入55 %乙醇提取溶剂25 ml，称定质量并记录，在55 ℃水浴中超声加热回流提取药液10 min，经室温冷却后，再次称定并用提取溶剂补足损失的质量，15000 r/min离心20 min，取上清液并经0.22 µm滤膜过滤，得提取液。
2.3 复方金钱草颗粒中化学成分数据库的建立
复方金钱草颗粒由广金钱草、车前草、光石韦和玉米须等四味中药材组成。通过搜索中国知网、万方数据、PubMed等网站中关于复方金钱草颗粒及其四味中药材的文献，检索上海有机化学研究所的化学专业数据库、TCMID来建立复方金钱草颗粒化学成分数据库，其相关信息包括化合物中英文名称、分子式以及相对分子质量。
3. 结果与讨论
3.1 四极杆飞行时间质谱成分筛查
复方金钱草颗粒UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图见图1。应用Qualitative Analysis质谱分析软件计算可能的分子组成(误差<8 ppm)，结合复方金钱草颗粒化学成分数据库，对复方金钱草颗粒提取溶液所得色谱图上色谱峰进行分析，利用精确分子量匹配和碎片离子归属策略，初步尝试鉴定出51个化学成分，结果如表2所示。
表 2 复方金钱草颗粒化学成分鉴别分析结果序号 名称 分子式 M+X m/z 质量 误差(ppm) 1 b 水苏糖 C24 H42 O21 (M+H)+ 667.2312 666.2244 3.86 2 b 桂皮酸 C9 H8 O2 (M+H)+ 149.0594 148.052 −3.2 3 abd 原儿茶酸 C7 H6 O4 (M+H)+ 155.0335 154.0261 −3.44 /龙胆酸 4 a 广金钱草内酯 C8 H13 N O3 (M+H)+ 172.0968 171.0894 −0.75 5 bd 咖啡酸 C9 H8 O4 (M+H)+ 181.0493 180.0421 −0.79 6 abcd 绿原酸 C16 H18 O9 (M+H)+ 355.1028 354.0955 1.1 7 b 丁香酸 C9 H10 O5 (M+H)+ 199.0607 198.0531 1.24 8 a 香橙素 C15 H12 O6 (M+H)+ 289.0716 288.0641 2.62 9 ab 黄芩素 C15 H10 O5 (M+H)+ 271.0609 270.0535 2.66 /染料木素 /芹菜素 10 c (R/S)-eriodictyol-8-C-β-D-glucopyranoside C21 H22 O11 (M+H)+ 473.1063 450.118 3.88 11 a 芸香苷 C27 H30 O16 (M+H)+ 611.1623 610.1551 2.79 12 ac 槲皮素 C15 H10 O7 (M+H)+ 303.0505 302.0432 1.78 /3,5,7,4'-tetrahydroxy-coumaronochromone /6-羟基木犀草素 13 b 大车前苷 C17 H24 O10 (M+H)+ 389.1458 388.1385 4.04 14 bd 对-香豆酸 C9 H8 O3 (M+H)+ 165.0547 164.0476 1.45 15 a homoadonivernite C26 H28 O15 (M+H)+ 581.152 580.1445 2.96 /刺苞菊苷 16 a 维采宁-2 C27 H30 O15 (M+H)+ 595.1672 594.1597 2.08 17 b 桃叶珊瑚苷元 C9 H12 O4 (M+H)+ 185.0816 184.0742 3.46 18 a 6-C-glycopyranosyl-8-C-xyloeyl apigenin C26 H28 O13 (M+H)+ 549.1621 548.1552 4.12 /6-C-glycopyranosyl-8-C-glycopyranosyl apigenin 19 ab 阿魏酸 C10 H10 O4 (M+H)+ 195.0654 194.058 0.71 /咖啡酸甲酯 20 b 黑麦草内酯 C11 H16 O3 (M+H)+ 197.117 196.1097 −1.16 21 b 车前黄酮苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 22 b 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 23 a 异槲皮苷 C21 H20 O12 (M+H)+ 465.1033 464.0965 2.16 /紫花杜鹃素丁 /6-hydroxyl luteolin 7-O-glucoside 24 c 杧果苷 C19 H18 O11 (M+H)+ 423.0933 422.0861 2.84 /异杧果苷 25 a 山柰酚-3-O-芸香糖苷 C27 H30 O15 (M+H)+ 595.1672 594.1597 2.08 26 a 维采宁-1 C26 H28 O14 (M+H)+ 565.1572 564.1498 3.42 /维采宁-3 /异夏佛塔雪轮苷 /夏弗塔雪轮苷 27 abd 对羟基苯甲酸 C7 H6 O3 (M+H)+ 139.039 138.0317 0.31 /水杨酸 /原儿茶醛 28 a 异荭草素 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 29 a 牡荆素 C21 H20 O10 (M+H)+ 433.1137 432.1064 1.65 /异牡荆素 /大波斯菊苷 /染料木苷 30 a 三叶豆苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 31 ab 5, 7-dihydroxy-2', 4'-dimthoxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C23 H26 O11 (M+H)+ 479.1563 478.149 3.11 /[(2R,3S,4S,5R,6R)-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl] (E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoate /木通苯乙醇苷A /木通苯乙醇苷B /车前草苷 A /车前草苷 B /3,4-Dihydroxyphenethylalcohol-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside /去鼠李糖洋丁香酚苷 32 b 车前草苷D C29 H36 O16 (M+H)+ 663.19 640.1989 −2.26 /大车前苷 33 b 异洋丁香酚苷 C29 H36 O15 (M+H)+ 647.195 624.2038 −2.67 /洋丁香酚苷 /Beta-D-Glucopyranoside, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl 3-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-, 6-(3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate), (E)- 34 b 黄芩苷 C21 H18 O11 (M+H)+ 447.0938 446.0864 3.35 35 b 高车前苷 C22 H22 O11 (M+H)+ 463.1239 462.117 1.7 36 a 5, 7-Dihydroxy-2'-methoxy-3', 4'-methylenedioxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C23 H24 O12 (M+H)+ 493.136 492.1282 2.96 37 abcd 山柰酚 C15 H10 O6 (M+H)+ 287.0558 286.0482 1.45 /木犀草素 /2’-Hydroxygenistein /高山黄芩素 38 a 5, 7-Dihydroxy-2', 3', 4'-trimethoxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C24 H28 O12 (M+H)+ 509.1668 508.1596 2.93 39 b 异角胡麻苷 C31 H40 O15 (M+Na)+ 675.2281 652.2391 3.69 /角胡麻苷 40 a 5, 7-Dihydroxy-2'-methoxy-3', 4'-methylenedioxy-isoflavanone C17 H14 O7 (M+H)+ 331.0824 330.0748 2.45 41 a 5, 7-Dihydroxy-2', 3', 4'-trimethoxy-isoflavanone C18 H18 O7 (M+H)+ 347.112 346.105 −0.6 42 a Homoferreirin C17 H16 O6 (M+H)+ 317.1034 316.0959 3.82 43 a 大豆皂苷 I C48 H78 O18 (M+H)+ 965.5112 942.5214 2.75 44 b 桃叶珊瑚苷 C15 H22 O9 (M+H)+ 347.1352 346.1279 4.44 45 d 亚油酸 C18 H32 O2 (M+H)+ 303.2303 280.2408 2.2 46 d 邻苯二甲酸二丁酯 C16 H22 O4 (M+H)+ 301.1421 278.1531 4.47 47 d Bis[(2R)-2-ethylhexyl] benzene-1, 2-dicarboxylate C24 H38 O4 (M+H)+ 413.2681 390.2798 7.14 注：a. 广金钱草中的成分；b. 车前草中的成分；c. 光石韦中的成分；d. 玉米须中的成分 3.2 同位素分布验证
对于以上鉴别分析结果，在数据匹配的基础上，我们还利用峰物质特征的同位素分布进行验证。以4号峰广金钱草内酯和11号峰芸香苷为例，采用Qualitative Analysis软件的“显示预测的同位素分布”功能分别对这两种化合物的同位素峰进行匹配，其结果见图2和图3。图中结果明显可见，该两种离子理论上的同位素峰强度比、出峰位置(由方框表示)与实际测得的(由竖线峰表示)结果吻合良好，4号化合物广金钱草内酯的吻合分数为99.94，11号化合物芸香苷的吻合分数为95.28。以上结果证明鉴别分析结果准确。
3.3 同分异构体的区分
实验中我们发现复方金钱草颗粒中含有多组同分异构体，本文采用ACD/ChemSketch软件计算化合物的油水分配系数logP值判断出峰顺序。以16号峰维采宁-2与25号峰山柰酚-3-O-芸香糖苷为例，在UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图中，提取m/z为595.1672的离子，结果见图4。
维采宁-2和山柰酚-3-O-芸香糖苷的结构式如图5所示。采用ACD/ChemSketch软件计算它们的油水分配系数logP值分别为−0.10(±0.94)和1.96(±1.45)，表明山柰酚-3-O-芸香糖苷的疏水性更强，在反相色谱柱中的保留时间则越长，确定这两个化合物的出峰顺序维采宁-2在前，山柰酚-3-O-芸香糖苷在后，从而对异构体的色谱峰进行相应归属。
我们还用此方法对同一分子式的一组多个同分异构体进行logP值的排序，以确定这些成分的出峰顺序来进行归属。例如在总离子流图中，第21、22、28、30号峰为一组同分异构体，分别为车前黄酮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、异荭草素和三叶豆苷，其结构式如图6所示。在UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图中，提取m/z为449.1089的离子，结果见图7。对它们的油水分配系数logP值进行排序，可知该4种同分异构体的出峰顺序，结果如表3所示。
表 3 同分异构体（21、22、28和30号峰）的归属结果出峰编号 化合物名称 logP值 保留时间(t/min) 21 车前黄酮苷 −0.30±0.64 11.320 22 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 −0.09±0.64 11.675 28 异荭草素 1.58±0.88 13.999 30 三叶豆苷 1.95±1.43 14.355 4. 讨论
本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技术，实现了对中成药复方金钱草颗粒中多成分的快速定性分析，共鉴定出2个苯乙醇苷类、1个低聚糖类、8个酚酸类、27个黄酮类、1个生物碱类、5个萜类、1个脂肪酸类、2个酯类成分（共47个活性成分），该技术为中药复方多成分分析提供了一种有效、可靠的方法，也同样适用于其他中药复方复杂体系的化学成分分析。
由于中药复方化学成分较单味药材更多更复杂，因而同分异构体的情况非常普遍。使用的四极杆复合飞行时间质谱（Q-TOF）在保持了较高的检测灵敏度以及质量准确性的前提下，可以对样本中所有的成分的质荷比进行全谱采集。这种技术使数据采集效率有了极大的提高，更加适用于中药重要复杂体系化学成分的鉴定。
虽然本研究基于复方金钱草颗粒化学成分数据库，利用精确分子量匹配和碎片离子归属策略并辅以软件计算的方法鉴定出了多个化学成分，但仍有大量的同分异构体无法被有效地区分开来，因此，在下一步实验中，使用标准品对照的方法进行更精确地鉴定。
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表 1 临床分离检出G−菌菌株的分布情况
菌株 菌株数 构成比（%） 大肠埃希菌 3 051 30.25 肺炎克雷伯菌 2 929 29.04 铜绿假单胞菌 2 279 22.59 鲍曼不动杆菌 1 584 15.70 
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表 2 2022年大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药率（%）
检测项目 大肠埃希菌
（n=393）肺炎克雷伯菌
（n=331）ESBL检测 43.23 19.50 氨苄西林 78.64 100.00 氨苄西林/舒巴坦 35.56 66.42 哌拉西林/他唑巴坦 3.21 57.08 头孢唑林 56.95 66.22 头孢呋辛 64.52 55.57 头孢曲松 53.41 62.41 头孢他啶 26.48 60.59 头孢吡肟 16.25 57.85 头孢替坦 4.44 53.33 头孢哌酮/舒巴坦 5.34 56.82 头孢他啶/阿维巴坦 1.32 1.89 氨曲南 32.87 60.00 亚胺培南 2.51 55.76 美罗培南 2.52 55.46 厄他培南 2.92 58.07 庆大霉素 29.43 50.70 妥布霉素 10.06 47.54 阿米卡星 2.17 32.99 替加环素 0.31 4.62 环丙沙星 58.91 60.83 左氧氟沙星 58.88 60.57 复方新诺明 41.07 39.58 呋喃妥因 1.45 50.31
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表 3 2022年铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药率（%）
检测项目 铜绿假单胞菌
（n=269）鲍曼不动杆菌
（n=289）氨苄西林 100.00 100.00 氨苄西林/舒巴坦 98.83 62.17 哌拉西林/他唑巴坦 5.10 70.88 头孢唑林 100.00 100.00 头孢呋辛 − − 头孢曲松 98.83 71.93 头孢他啶 6.44 72.10 头孢吡肟 5.73 72.71 头孢替坦 100.00 100.00 头孢哌酮/舒巴坦 6.49 49.85 头孢他啶/阿维巴坦 4.03 − 氨曲南 19.69 100.00 亚胺培南 22.02 72.10 美罗培南 17.48 74.34 厄他培南 − − 庆大霉素 17.28 67.03 妥布霉素 18.68 66.36 阿米卡星 0 60.83 替加环素 − 3.37 环丙沙星 26.41 73.61 左氧氟沙星 24.13 72.05 复方新诺明 98.83 23.79 呋喃妥因 100.00 100.00 注：“−”表示不适用。
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