下载:
下载:
-
氟马西尼（flumazenil）是苯二氮䓬类受体拮抗剂，临床上常用来逆转由苯二氮䓬类药物麻醉或过量使用后所致的中枢镇静作用[1-4]，在军事应用方面，可用来拮抗镇静药物带来的“宿醉”等副作用，提高作业效能。目前，氟马西尼市售剂型为注射剂，为解决注射给药不便、疼痛不适的问题，提高使用者顺应性，开发一种便捷安全的制剂显得尤为重要。回顾既往研究，氟马西尼已被证明经鼻腔[5, 6]、舌下[7, 8]、口服[9]及直肠[10]等给药途径均有治疗效果。本研究开发氟马西尼舌下片，实现军事条件下作业人员高效、安全促醒。
氟马西尼因难溶于水，直接制备成舌下片会影响其被舌下黏膜吸收及药效发挥。本研究以羟丙基-β-环糊精为包合材料，将氟马西尼制备成包合物后再制备舌下片，以此改善氟马西尼的溶解度及溶出度。此外，还研究了氟马西尼舌下片在比格犬体内的药动学过程，并进行生物利用度评价，以期为进一步临床研发及应用提供依据。
-
药物透皮扩散试验仪（TPY-2，上海黄海药检仪器有限公司）；质谱仪（QTRAP® 5500，日本岛津公司）；TDP 单冲压片机（ZPS016，上海天祥·健台制药机械有限公司）；双向磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；旋转蒸发仪（R206D，上海申生科技有限公司）；真空干燥箱（VD53，德国Binder公司）；高效液相色谱仪（UltiMate 3000，美国Thermo公司）；色谱柱（SB-C18，美国Agilent公司）；色谱柱（XSelect®HSS T3，美国Waters公司）。
-
氟马西尼注射液（5 ml:0.5 mg，宜昌人福药业）；氟马西尼原料药（99%，江苏恩华药业股份有限公司）；内标物甲苯磺丁脲（纯度99%，美国Sigma公司）；羟丙基-β-环糊精（法国Roquette公司）；PVP K30（重庆斯泰克瑞登梅尔公司）；乳糖（荷兰DFE公司）；甘露醇（法国Roquette公司）；硬脂富马酸钠（德国JRS公司）；乙腈、乙酸铵均为质谱纯；实验用水为去离子水。
-
比格犬12只，雄性，体重7~9 kg，由北京玛斯生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0001。
-
以摩尔比2∶1称取适量羟丙基-β-环糊精与氟马西尼，加入90%乙醇溶液，超声使其溶解。将混合溶液置于45 ℃连续搅拌2 h。取混合溶液进行旋蒸，在40 ℃进行干燥，得到白色固体状包合物。
-
（1）色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：水（用磷酸调节pH值至2.0）-甲醇-四氢呋喃（80∶13∶7）；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；检测波长:230 nm；进样量：20 μl。
（2）溶液配制。空白溶液：精密称取羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。
对照品溶液：精密称取氟马西尼10 mg，置于100 ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解后定容，制得质量浓度为0.1 mg/ml的氟马西尼溶液。
供试品溶液：精密称取F-羟丙基-β-环糊精适量于容量瓶中，加入适量流动相，振摇使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
（3）专属性。分别取制备的空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20 μl，参照“色谱条件”项下进样，进行样品专属性考察（图1）。A为羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，无特征吸收峰；B为氟马西尼的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.240 min，C为F-羟丙基-β-环糊精的HPLC图谱，有吸收峰，出峰时间为8.247 min。表明该方法测定F-羟丙基-β-环糊精的专属性良好。
图 1 氟马西尼HPLC分析的专属性图谱
（4）线性。分别精密吸取“溶液配制”项下对照品溶液适量，放置于容量瓶中，加流动相稀释定容，配制6.25、12.5、25、50、75、100 μg/ml的氟马西尼系列标准品溶液，进样分析。以峰面积（A）为纵坐标，氟马西尼浓度（C/μg·ml−1）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=0.738 0C−0.171 9，r=0.999 9。结果表明，氟马西尼浓度在 6.25～100 µg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好，定量下限为6.25 µg/ml。
（5）精密度及准确度考察。分别取“线性”项下低（6.25 μg/ml）、中（25 μg/ml）、高（100 μg/ml）3个浓度的氟马西尼溶液各6份，进样分析，连续测定3 d，考察日内、日间精密度（以RSD表示）。根据随行回归方程计算各样品中氟马西尼的实测质量浓度，以实测质量浓度与理论质量浓度相比较，考察准确度（表1）。结果表明，该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 -
取氟马西尼和F-HP-β-CD（相当于氟马西尼10 mg），按照溶出度测定法（2020年版《中国药典》四部通则0931溶出度测定法第二法浆法），选用100 ml去离子水为溶出介质，温度设定为（37±0.5）℃，转速为100 r/min，于1、2、5、10、15、30 min时取样过滤，并补充相同体积、相同温度的空白溶出介质。取续滤液稀释后， 参照“ 色谱条件”项下，利用HPLC法进行浓度测定，计算各时间点溶出度，并与原料药进行比较。
如图2所示，5 min时 F-羟丙基-β-环糊精的溶出度大于95%，而氟马西尼30 min溶出度约30%。表明氟马西尼与羟丙基-β-环糊精包合能提高药物的溶出度，进而提高生物利用率，为后续氟马西尼舌下片制备提供了基础。
图 2 氟马西尼及包合物体外溶出曲线
-
称取处方量F-HP-β-CD、乳糖、甘露醇、硬脂富马酸钠，过100目筛备用。将辅料（除硬脂富马酸钠外）与F-HP-β-CD等量递增混匀。加入适量10% PVP K30 的 90% 乙醇溶液制成软材，过16目筛制粒，40℃烘干2 h。加硬脂富马酸钠，混匀，单冲压片机制成片剂。每片含氟马西尼0.2 mg。
-
取氟马西尼舌下片3批次（批号：20220615-1、20220615-2、20220615-3），按照溶出度测定法，选用50 ml去离子水为溶出介质，温度设定在（37±0.5） ℃，转速为100 r/min，于5、15、30、60 min取样过滤。其余同“2.1.3” 项操作。如表2所示，氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。
表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39 -
（1）色谱柱。XSelect HS T3（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；柱温：15 ℃；流动相： A相为水（含1 mmol/L乙酸铵），B 相为乙腈；梯度洗脱：0.01～1.30 min, 30%B；1.30～1.80 min, 30%~95%B；1.80～1.81 min，95%B；1.81～2.20 min，30%B；流速：0.6 ml/min；进样量：8 μl。
（2）质谱条件。正离子电喷雾离子化（ESI）方式，多反应监测（MRM）；喷雾电压：5.5 kV；源温度：500℃；雾化气为60 psi；辅助加热气为60 psi；气帘气为40 psi；离子对、去簇电压、碰撞室出口电压及碰撞能量等参数见表3。
表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22 -
取100 μl血浆样品到EP管中，加入600 μl内标液（200 ng/ml甲苯磺丁脲的乙腈溶液）。涡旋混匀1 min，13 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min。取上清液适当稀释后放置于进样瓶中， 8 μl进样检测。
-
在上述提取条件及色谱、质谱条件下，测定空白血浆、含内标溶液的血浆样品、含氟马西尼的血浆样品以及给药后比格犬血浆样品，记录色谱图见图3。结果表明，氟马西尼和内标甲苯磺丁脲保留时间分别为1.63 min和1.94 min，血浆中的内源性物质不干扰测定。
图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
-
比格犬空白血浆中精密加入不同浓度的氟马西尼对照品溶液5 μl，配制浓度分别为0.2、0.5、1、2、10、50、100、200 ng/ml的系列对照品血浆样品，按照“ 2.2.2” 项下方法操作，记录峰面积。以氟马西尼浓度C为横坐标，氟马西尼与内标物的峰面积比值（AF/ATOL）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为AF/ATOL=0.008 3C+0.000 9，r=0.998 1。氟马西尼在 0.2～200 ng/ml浓度范围线性关系良好。本法测定血浆中氟马西尼的最低定量限为0.2 ng/ml。
-
用空白比格犬血浆配制低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）3个浓度的对照品血浆样品各6份，按照“2.2.2”项下方法操作，连续测定3 d，随行标曲计算其浓度，算得血浆样品测定方法的精密度和准确度，结果如表4所示。数据表明该方法精密度、准确度良好，符合生物样本分析要求。
表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38 -
取空白血浆平行配制氟马西尼、内标物甲苯磺丁脲低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度样品各6份，按照“ 2.2.2”项下方法预处理并进样分析，记录峰面积A1；取空白血浆按“2.2.2”项下方法预处理后，加入低、中、高浓度氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲后进样分析，记录峰面积A2；用甲醇配制含氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲低、中、高浓度溶液，进样分析，记录峰面积A3。A1与A2比值为提取回收率； A2与A3比值为基质效应（表5）。实验结果表明，低、中、高浓度氟马西尼提取回收率为86.12 %~87.43 %，基质效应为105.87 %～106.28 %。提取回收率和基质效应均在80 %～120 %，RSD均<15%，符合生物样本分析要求。
表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73 -
取空白血浆加入氟马西尼标准品溶液，配制成低（0.6 ng/ml）、中（6 ng/ml）、高（160 ng/ml）浓度的血浆样品，每个浓度平行6份，按“2.2.2”项下操作，分别考察其室温放置4 h、反复冻融3次以及−20 ℃放置30 d的稳定性，结果见表6。表明在上述条件下样品均稳定。
表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87 -
采用双周期双交叉实验设计方案。将12只比格犬随机分为2组，分别给予氟马西尼舌下片（0.2 mg）和注射剂（0.1 mg），清洗期为1周。给药前禁食12 h，自由饮水。于给药后10 min、20 min、30 min、45 min、1.0 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2.0 h 、2.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h由腿静脉取血2 ml，置于肝素钠采血管中，12 000 r/min离心10 min ，取上层血浆按“2.2.2”项下方法处理后测定。
-
比格犬给予氟马西尼舌下片与氟马西尼注射液后，血药浓度-时间曲线如图4。用WinNonlin 7.0药动学软件对所测数据进行非房室模型分析，得到主要药动学参数见表7。
图 4 氟马西尼舌下和静注给药的血药浓度-时间曲线图（
$ \bar{x} $ ±s,n=12）表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 − 舌下片和注射剂的峰浓度分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml，两者达峰时间分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h ，AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；根据数据拟合计算得到主要药动学参数，并计算出氟马西尼舌下片的绝对生物利用度，结果如表7。计算得出氟马西尼舌下片绝对生物利用度约为52.68 %。
-
本课题首先制备了氟马西尼-羟丙基-β-环糊精包合物，实验表明，包合物能显著改善氟马西尼的溶解性能和溶出度，促进药物透膜吸收，在此基础上将包合物进一步制成氟马西尼舌下片。溶出度测定结果表明，舌下片在5 min时的累积溶出度已超过60%，15 min内可完全溶出。
实验建立了LC-MS法测定比格犬血浆中氟马西尼浓度，经过方法学验证，该方法适用于氟马西尼在比格犬体内的药动学研究。药动学实验结果表明，氟马西尼舌下片在比格犬体内的舌下黏膜吸收迅速， 30 min左右达峰值（Cmax=6.36 ng/ml）。氟马西尼舌下片绝对生物利用度为52.68 %，而根据既往研究报道，氟马西尼口服给药生物利用度仅为16%[11]，说明将氟马西尼与HP-β-CD包合后制备成舌下片给药能够显著提高其透舌下黏膜吸收以及生物利用度。另据文献报道[12]，静脉注射0.1～0.2 mg氟马西尼注射液可有效拮抗苯二氮䓬类药物镇静催眠作用，比较氟马西尼注射剂（0.1 mg）及氟马西尼舌下片（0.2 mg）药动学参数，二者AUClast值无显著性差异，且舌下片在达峰后血药浓度始终高于注射剂，表明氟马西尼舌下片可持续有效拮抗镇静催眠药物。
Preparation and pharmacokinetics of flumazenil sublingual tablet
-
摘要:
目的 制备氟马西尼舌下片，对其在比格犬体内的药动学进行研究，评价其生物利用度。 方法 以羟丙基-β-环糊精为包合材料制备氟马西尼包合物，后压片制备氟马西尼舌下片。采用双周期交叉实验设计，将12只比格犬随机分成2组，分别给予氟马西尼舌下片和注射剂。建立LC-MS法测定血浆中氟马西尼含量，并进行方法学验证。利用WinNonlin 药动学软件计算药动学参数及生物利用度。 结果 采用羟丙基-β-环糊精包合后能有效提高氟马西尼溶出度，促进其舌下黏膜吸收。氟马西尼舌下片15 min内可完全溶出。药动学研究中，氟马西尼注射剂和舌下片AUClast分别为（8.41±2.15）和（8.86±2.83） h·ng·ml−1；Cmax分别为（10.96±2.62）和（6.36±2.14） ng/ml；tmax分别为（0.18±0.05）和（0.58±0.24） h。氟马西尼舌下片生物利用度为52.68 %。 结论 该研究利用包合物制备氟马西尼舌下片，达到安全、高效递送的目的。建立LC-MS法测定氟马西尼血药浓度，其优点在于操作简单、准确灵敏。 Abstract:Objective To prepare flumazenil sublingual tablets and study its bioavailability. Methods Flumazenil sublingual tablets were prepared by compressing flumazenil inclusion compound with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as the inclusion material. In a double-cycle crossover trial, twelve beagle dogs were randomly divided into two groups, one group receiving flumazenil sublingual tablets and the other receiving flumazenil injections. LC-MS method was developed and validated to determine flumazenil plasma concentration. The pharmacokinetic parameters and bioavailability were calculated using WinNonlin pharmacokinetic software. Results In the pharmacokinetic study, AUClast of flumazenil injection and sublingual tablet was （8.41±2.15） and （8.86±2.83） h·ng·ml−1, respectively; Cmax was （10.96±2.62） and （6.36±2.14） ng/ml, respectively; tmax was （0.18±0.05） and （0.58±0.24） h, respectively. The bioavailability of flumazenil sublingual tablet was 52.68%. Conclusion Clathrates were used to prepare flumazenil sublingual tablets to achieve safe and efficient delivery. LC-MS method was established for the determination of flumazenil plasma concentration, and the advantages were simple, accurate and sensitive. -
Key words:
- flumazenil /
- sublingual tablet /
- beagles /
- pharmacokinetics
-
拉莫三嗪是一种苯基三嗪类药物，化学名为6-（2,3-二氯苯基）-1,2,4-三嗪-3,5-二胺，属于第二代抗癫痫药物，临床上常被用于治疗部分性发作癫痫、难治性癫痫、青少年肌阵挛癫痫、癫痫持续状态等[1-4]。拉莫三嗪不经细胞色素P450酶代谢，主要由尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）作用，与葡萄糖醛酸键合，生成无药理活性的代谢物[5]。同其他抗癫痫类药物一样，拉莫三嗪治疗范围（3～14 μg/ml）较窄，易发生中毒反应。
研究拉莫三嗪治疗的446例患者中有20.88%发生不良反应，最常见的有头痛、皮疹、乏力等，严重不良反应有DIC、Lyell综合征、Stevens-Johnson综合征等，研究认为这可能与拉莫三嗪的血药浓度有关[6-7]。因此，随着拉莫三嗪在临床上的广泛应用，治疗药物监测（TDM）成为指导拉莫三嗪合理用药的一种安全有效的手段。本研究旨在通过中心切割二维液相色谱法，建立测定人血浆中拉莫三嗪药物浓度的方法，便于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作，为临床个体化用药指导提供监测数据支持。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Shimadzu LC-20A日本岛津高效液相色谱仪（真空脱气机，分析型色谱泵，SPD双波长检测器）；ALK-108二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）；色谱柱SNCB（T）-1A（硅胶，4.6 mm ×50 mm, 5 µm）、Symmetry C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）、SBX4-MA（树脂，3.0 mm×10 mm,5 µm）均购自湖南德米特仪器有限公司；QUINTIX125D-1CN精密电子天平（赛多利斯（上海）贸易有限公司）；超纯水机（德国Think-lab Corporation）；HC-2062高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。
1.2 试药与试剂
拉莫三嗪标准品（批号：100775-201902，纯度99.9%，中国食品药品检定研究院）；乙酸铵（批号：5666364，纯度98.0%，天津迪马科技有限公司）；甲醇（色谱纯，上海科丰实业有限公司）；乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）；VCV-1D移动相（湖南德米特仪器有限公司）；空白血浆（联勤保障部队第九〇〇医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件与原理
第一维色谱系统中，一维色谱柱：SNCB（T）-1A（硅胶，4.6 mm×50 mm, 5 µm），流动相A：VCV-1D移动相[甲醇-乙腈-磷酸铵水溶液（V/V/V=1∶3∶3，氨水调pH至7.0）]，流速：0.4 ml/min；流动相B：水，流速：1.0 ml/min。第二维色谱系统中，二维色谱柱：Symmetry C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm），流动相：乙腈:10 mmol/L乙酸铵溶液（25∶75），流速：1.0 ml/min；中间色谱柱：SBX4-MA（树脂，3.0 mm×10 mm,5 µm）。柱温：45 ℃，紫外检测波长：306 nm，进样量：200 μl。时间程序：0～2 min样品进样和第一维色谱分离；2～4 min目标物通过中间色谱柱转移至第二维色谱；4～10 min目标物在第二维色谱中分离分析。
二维液相色谱将分离原理不同的两支色谱柱经一定接口和柱切换技术耦合在一起，通过加入不同的流动相进行选择性分离。样品在第一维色谱进行初步富集分离，经过纯化后将目标组分利用柱切换技术由中间柱转移系统转移到第二维中，最后目标组分在第二维色谱中分离分析。当目标组分在第二维色谱中分离分析时，纯化柱已经逐渐开始清洗，以备样品的再次进入，由此间隔不断地运行。二维液相色谱系统结构见图1；工作原理示意图见图2。
2.2 拉莫三嗪标准品储备液的配制
精密称取拉莫三嗪标准品7.90 mg,置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，配制成浓度为79.00 μg/ml的拉莫三嗪标准品储备液，存放在−80 ℃冰箱中备用。
2.3 含药血浆样品的处理
精密吸取含药血浆样品200 μl至1.5 ml EP管中，再精密加入甲醇600 μl沉淀蛋白，涡旋混合1 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析。
2.4 方法学验证
2.4.1 专属性
制备空白血浆、空白血浆+拉莫三嗪对照品溶液（浓度为7.90 μg/ml），按照“2.3”项下方法处理，将空白血浆、拉莫三嗪对照品、空白血浆+拉莫三嗪对照品按“2.1”项下色谱条件进样测定，观察有无内源性干扰，如图3所示。结果表明，拉莫三嗪出峰时间为8.506 min左右。血浆中的内源性物质对拉莫三嗪的出峰时间和峰面积无明显干扰（理论踏板数为8 843，对称因子为1.13）。
2.4.2 标准曲线及检测限
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成系列浓度梯度溶液（39.50、19.75、9.88、4.94、2.47、1.24 μg/ml），按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合。得到线性回归方程：Y=146 470X-36 830,r=0.999 9，表明拉莫三嗪血药浓度在1.24～39.50 μg/ml时，线性关系良好，定量下限浓度为1.24 μg/ml（S/N=10），检测限为0.02 μg/ml（S/N=3）。
2.4.3 精密度与准确度
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成浓度为高、中、低（31.60、7.90 、1.98 μg/ml）以及定量下限（1.24 μg/ml）4个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。1 d内不同时间测定5次及3 d内每天进样1次，考察其日内和日间精密度/准确度。结果如表1～2所示，高、中、低3个浓度的日内RSD均小于5%，日间RSD均小于10%；日内准确度范围为102.17%~111.17%，日间准确度范围为99.80%~107.31%；定量下限浓度的日内、日间RSD均小于5%，日内准确度为100.65%，日间准确度为100.50%。
表 1 日内精密度/准确度测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD/准确度
（%）31.60 32.28 0.65 2.02/102.17 7.90 8.27 0.24 2.93/104.66 1.98 2.20 0.06 2.74/111.17 1.24 1.25 0.01 0.58/100.65 表 2 日间精密度测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD/准确度
（%）31.60 31.57 1.34 4.23/99.92 7.90 7.88 0.67 8.54/99.80 1.98 2.12 0.19 9.15/107.31 1.24 1.25 0.01 0.52/100.50 2.4.4 回收率
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低（31.60、7.90、1.98 μg/ml）3个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果如表3所示，回收率RSD均小于5%，其变化范围在89.95%～96.15%之间。
表 3 回收率测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD
（%）回收率
（%）31.60 30.03 0.58 1.92 95.04 7.90 7.11 0.30 4.19 89.95 1.98 1.90 0.02 0.90 96.15 2.4.5 稳定性
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低（31.60、7.90、1.98 μg/ml）3个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别考察血浆样品室温放置24 h、反复冻融3次以及−40 ℃保存2周的稳定性。结果如表4所示，测定浓度/标准浓度比值范围在87.01%~115.88%。符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则中，9012生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。
表 4 稳定性测定结果（n=5）检测条件 药物浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）测定浓度/标示浓度
（%）室温放置24 h 31.60 33.50 106.02 7.90 8.39 106.25 1.98 2.29 115.88 反复冻融3次 31.60 29.29 92.67 7.90 6.87 87.01 1.98 2.04 103.00 −40 ℃保存2周 31.60 31.05 98.25 7.90 7.80 98.70 1.98 2.11 106.73 3. 讨论
3.1 检测方法的选择
查阅国内外文献可知，目前拉莫三嗪血药浓度测定方法[8-15]有HPLC法、液-质联用法、免疫荧光法。HPLC法测定血药浓度时，须经过复杂的前处理；质谱法的仪器成本和检测成本都较高，且对操作人员要求高，不利于临床推广使用；免疫分析操作简单、速度快，但其检测试剂盒价格昂贵。本研究采用的中心切割二维液相色谱系统是将分离机理不同、互相独立的两根或三根色谱柱以串联方式组合，目标化合物被转移至分析柱后，可对一维柱及中间柱进行在线反向冲洗，可有效减少色谱柱的污染。且与传统HPLC相比，二维液相具有进样体积大（最高可达1 000 µl）、在线净化除杂、富集等功能，可有效避免传统液相色谱测定中因仪器灵敏度和色谱柱分离度的限制，提高临床样本检测的准确性；若质控样品在允许的靶值范围内，则无需每天测定随行标准曲线，可有效缩短临床样本的检测时间，提高仪器的使用率。
高效液相色谱法和液-质联用法大多采用内标法定量，而内标物的选择需考虑其与待测物的物理化学性质是否相似，有时候难以找到合适的内标物；此外，内标物的纯度对定量结果也有很大影响。而二维液相色谱法则采用了外标法定量，在本实验中日内、日间精密度RSD均小于10%，日内准确度的范围为102.17%~111.17%，日间准确度的范围为99.80%~107.31%，以上结果均证明采用外标法是可靠的，不仅实现准确地定量分析，还避免了选取内标的繁琐操作，使得临床上大量样本的检测更具可操作性。除此之外，流动相B还可根据时间程序设定进行自动化调控，早期阶段可增加第一维色谱柱的极性，使待测组分聚集于色谱中，减少损失。一旦样品进入分析阶段，后台即可启动自动清洗系统，自动清洗二维色谱的连接管路、微流控部件与色谱柱，从而确保连续分析期间的系统可靠性，且延长了色谱柱的使用寿命。
3.2 二维液相色谱的优势
本实验选用200 µl的进样量，相比传统HPLC法仅几微升的进样量来说，二维液相色谱法可在线处理大体积进样，实现样品的在线浓缩与富集，有效消除基质干扰，且二维液相色谱法具有的全息反射长光程检测技术可将检测器提高1.2~1.8倍，使得灵敏度大幅度提高；二维液相色谱法还利用双级流体调制控制技术，巧妙的通过辅助流动相-水在线调制一维流动相-VCV-1D移动相，改变流动相特性、提高分离能力；本次实验过程中，通过组合调配理化性质不同的色谱柱，利用其分离能力的不同，增加色谱柱对目标物质的选择性，精准控制目标物质的迁移。对比其他色谱法，二维液相色谱法的分离能力大幅度提高[16]。
3.3 生物样品前处理
目前常用的生物样品前处理方法有蛋白沉淀法、液-液萃取法和固相萃取法。液-液萃取法以及固相萃取法过程复杂且成本较高[17-18]，而蛋白沉淀法能够最大限度地保留样品中的物质，操作简单且成本较低[19]，其中，有机溶剂沉淀法是蛋白沉淀法最常用的方法。血浆或血清样品常采用甲醇或乙腈沉淀蛋白，样品与沉淀剂比例为乙腈最低1∶2，甲醇最低1∶3（通常1∶5以上效果最佳）。本研究实验样品为血浆，且配置标曲所用的溶剂为甲醇，为了避免不同有机试剂对检测的干扰，因此选择甲醇为沉淀试剂，样品与甲醇的比例为1∶3。
3.4 色谱柱的筛选以及流动相的选择
预实验时采用的一维色谱柱是SNCB-1A色谱柱，固定相为硅胶，当含药血浆样品通过色谱柱时，其中的各组分会因其与固定相的亲和力差异而发生不同的吸附或扩散现象，与湖南德米特公司提供的配套试剂VCV-1D移动相互相作用，能实现在线萃取聚焦功能，极大地简化了前处理过程，提高仪器的灵敏度，其结果分离度良好，有较好的峰型，且无拖尾现象，采用“中心切割技术”只将一维中洗脱出来的目标组分切割后再转入第二维分析。而二维色谱柱采用的是非极性的C18柱，进行洗脱时选择性差异取决于不同pH下的溶解性。拉莫三嗪在水中不易溶解，但在氯仿、二氯甲烷等有机溶剂中易溶解。目前常用的流动相包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲液等。参考以上流动相进行预实验，拉莫三嗪并不能完全分离分析。考虑到拉莫三嗪是一种弱碱性的药物，在酸性条件下易于质子化，而在碱性条件下易于去质子化。因此，为了保证其在分离过程中的稳定性和分离效果，需选择适当的缓冲液进行调节；又因拉莫三嗪分子结构中含有芳香环，具有一定的极性，则需选择一定极性的流动相来实现其与固定性的相互作用，从而实现有效分离。经多次实验后，确定二维流动相（乙腈-乙酸铵）比例为25:75，在此条件下拉莫三嗪具有良好的峰型且无拖尾现象。
综上考虑，本研究选用色谱柱SNCB-1A、Symmetry C18作为二维液相色谱法的第一维色谱柱、第二维色谱柱，VCV-1D移动相为第一维流动相，乙腈-乙酸铵溶液为第二维流动相。
3.5 进样量的选择
相比于普通液相的进样量，二维液相色谱的要大十几倍，主要是因为一维色谱柱的柱长比较短，仅50 mm，因此，柱压不会因为较大的进样量而明显增加。除此之外，还有流动相B的洗脱作用，可使待测样品在色谱柱上富集，故当进样量增加时，峰型也不受影响。本实验中进样量采用200 μl，是基于定量限需满足临床血药浓度的测定要求来确定的。若还需提高检测灵敏度，进样量最高可以达到1 ml。
4. 结论
本研究建立的中心切割二维液相色谱测定方法操作简单、稳定性好、灵敏度高、重现性好，便于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作，可为临床个体化用药指导提供可靠的监测数据支持。
-
图 3 氟马西尼及内标物甲苯磺丁脲专属性图谱
A. 比格犬空白血浆色谱图；B. 含内标的比格犬血浆色谱图；C. 含氟马西尼的比格犬血浆色谱图；D. 给药后比格犬血浆样品色谱图；左图: 内标甲苯磺丁脲；右图: 氟马西尼
表 1 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度 （ρB/µg·ml−1） 日内 日间 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 实测浓度 （ρB/µg·ml−1） 准确度（%） 精密度RSD（%） 6.25 6.27±0.12 100.32 1.91 6.32±0.05 101.12 0.84 25 25.19±0.46 100.76 1.85 25.26±0.34 101.04 1.36 100 99.85±0.39 99.85 0.39 99.74±1.28 99.74 1.28 
下载: 导出CSV
表 2 氟马西尼舌下片的溶出度检查结果（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）批号 溶出度（%） 5 min 15 min 30 min 60 min 20220615-1 60.14±0.98 95.89±0.62 98.29±1.36 98.86±0.43 20220615-2 63.23±1.91 96.18±2.50 98.76±1.32 98.31±1.52 20220615-3 66.74±1.92 97.56±1.07 97.45±1.26 97.89±1.39
下载: 导出CSV
表 3 质谱条件
检测物 母离子 子离子 去簇电压
（U/V）碰撞室出口
电压（U/V）碰撞能量
（U/V）氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25 甲苯磺丁脲 271.0 74.2 70 15 22
下载: 导出CSV
表 4 氟马西尼日内、日间精密度与准确度（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）样品浓度
（ρB/ng·ml−1）日内 日间 实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)实测浓度
（ρB/ng·ml−1）准确度
（%）精密度
RSD(%)0.6 0.60±0.02 95.35 3.09 0.59±0.03 96.70 9.99 6 6.10±0.23 101.72 3.85 6.25±0.28 104.20 4.42 160 167.76±4.31 104.85 2.57 167.76±5.66 104.85 3.38
下载: 导出CSV
表 5 提取回收率及基质效应（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）氟马西尼样品浓度
（ρB/ng·ml−1）提取回收率
（%）RSD
（%）基质效应
（%）RSD
（%）0.6 87.43±2.49 2.55 105.87±5.61 5.30 6 86.35±2.67 2.77 105.99±6.61 6.03 160 86.12±3.70 3.85 106.28±3.97 3.73
下载: 导出CSV
表 6 氟马西尼室温放置4 h、冻融及长期冻存稳定性（
$ \bar{x} $ ±s,n=6）放置条件 样品浓度（ρB/ng·ml−1） 回收率（%） RSD（%） 室温4 h 0.6 98.33±1.02 3.51 6 99.67±1.63 3.71 160 106.25±5.26 3.09 反复冻融3次 0.6 95.52±1.03 1.08 6 99.36±2.25 3.52 160 102.71±3.82 2.32 −20 ℃放置30 d 0.6 97.72±1.32 2.73 6 101.37±1.25 3.44 160 105.48±3.69 3.87
下载: 导出CSV
表 7 氟马西尼舌下和静注给药的药动学参数（
$ \bar{x} $ ±s，n=12）观测参数 氟马西尼舌下片
（0.2 mg）氟马西尼注射剂
（0.1 mg）t1/2（t/h） 0.78±0.25 0.58±0.08 tmax （t/h） 0.58±0.24 0.18±0.05 Cmax ρB/（ng·ml−1） 6.36±2.14 10.96±2.62 AUClast （h·ng·ml−1） 8.86±2.83 8.41±2.15 MRTlast （t/h） 1.23±0.25 0.66±0.08 Vz （L/kg） 3.21±1.68 0.89±0.21 CL [L/（h·kg）] 2.83±1.02 1.09±0.25 F（%） 52.68 −
下载: 导出CSV
-
[1] CHEN X, SANG N E, SONG K C, et al. Psychomotor recovery following remimazolam-induced sedation and the effectiveness of flumazenil as an antidote[J]. Clin Ther, 2020, 42(4):614-624. doi: 10.1016/j.clinthera.2020.02.006 [2] KIM J J, GHARPURE A, TENG J F, et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines[J]. Nature, 2020, 585(7824):303-308. doi: 10.1038/s41586-020-2654-5 [3] CIMOLAI N. Zopiclone overdose and flumazenil rescue[J]. Can Med Assoc J, 2017, 189(16):E613. doi: 10.1503/cmaj.732933 [4] BENINI A, GOTTARDO R, CHIAMULERA C, et al. Continuous infusion of flumazenil in the management of benzodiazepines detoxification[J]. Front Psychiatry, 2021, 12:646038. doi: 10.3389/fpsyt.2021.646038 [5] BAILEY A M, BAUM R A, HORN K, et al. Review of intranasally administered medications for use in the emergency department[J]. J Emerg Med, 2017, 53(1):38-48. doi: 10.1016/j.jemermed.2017.01.020 [6] CORRIGAN M, WILSON S S, HAMPTON J. Safety and efficacy of intranasally administered medications in the emergency department and prehospital settings[J]. Am J Health Syst Pharm, 2015, 72(18):1544-1554. doi: 10.2146/ajhp140630 [7] TROTTI L M, SAINI P, KOOLA C, et al. Flumazenil for the treatment of refractory hypersomnolence: clinical experience with 153 patients[J]. J Clin Sleep Med, 2016, 12(10):1389-1394. doi: 10.5664/jcsm.6196 [8] KATZ N, PILLAR G, PELED E, et al. Sublingual flumazenil for the residual effects of hypnotics: zolpidem and brotizolam[J]. Clin Pharmacol Drug Dev, 2012, 1(2):45-51. doi: 10.1177/2160763X12437201 [9] KASTELEIJN-NOLST TRENITÉ D G A, GROENWOLD R H H, SCHMIDT B, et al. Single dose efficacy evaluation of two partial benzodiazepine receptor agonists in photosensitive epilepsy patients: a placebo-controlled pilot study[J]. Epilepsy Res, 2016, 122:30-36. doi: 10.1016/j.eplepsyres.2016.02.003 [10] HARET D. Rectal Flumazenil can save the day[J]. Pediatr Anesth, 2008, 18(4):352. [11] ROUSSEAU-BLASS F, CRIBB A E, BEAUDRY F, et al. A pharmacokinetic-pharmacodynamic study of intravenous midazo-lam and flumazenil in adult New Zealand white-californian rabbits ( Oryctolagus cuniculus)[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2021, 60(3):319-328. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-20-000084 [12] SCHULT R F, OMAR D, WIEGAND T J, et al. Experience with lower dose flumazenil at an academic medical center[J]. Am J Emerg Med, 2021, 49:399-401. doi: 10.1016/j.ajem.2021.02.002 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 6448
- HTML全文浏览量: 1467
- PDF下载量: 37
- 被引次数: 0
