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顺式阿曲库铵(cisatracurium, CA)是一种新型中时效非去极化肌松药,其结构式如图1,因其代谢方式(Hofmann elimination,霍夫曼降解)独特,同时释放较低水平的组胺,在临床麻醉过程中被广泛应用。因与其他非去极化肌松药一样,存在术后肌松残留作用[1],且已成为麻醉后呼吸系统不良事件的主要原因。因此,为保证患者围术期安全,对顺式阿曲库铵进行血药浓度监测十分必要。
CA的稳定性主要受温度和pH影响,温度和pH升高可加快其消除,因此离体后的生物样本稳定性是血药浓度监测方法建立的一个难点。国内外文献报道测定人血浆中CA浓度的方法主要为高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FD)及高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)[2-6],但样本前处理方法较为复杂。本研究在既往文献报道的基础上,建立了一种更加简便、准确、快速、稳定的LC-MS方法,适用于人血浆中CA的血药浓度测定。
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Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 3 µm),柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈溶液。线性梯度洗脱:0 ~1 min, 20% B;1~3 min,50% B;3 ~5 min,20% B; 5 ~10 min,20% B。流速0.3 ml/min;进样量2 µl。
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采用正离子工作模式;离子源为ESI源;多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)。毛细管电压4 000 V;干燥器温度350 ℃;干燥气流速12 L/min;雾化器压力35 psi。MRM监测离子对,离子驻留时间、碰撞诱导解离电压及碰撞能量等参数见表1。典型质谱图见图2。
表 1 质谱条件
成分 母离子 子离子 驻留时间(t/ms) 碰撞电压(U/V) 电子倍增电压( U/V) 碰撞能量(U/V) CA 464.4 358.4 20 110 200 20 PPF 342.2 166.2 200 130 200 17 -
CA标准储备液:精密称取CA 10 mg置10 ml容量瓶,加入2%甲酸甲醇溶液至刻度,溶解混匀,配制成相当于CA质量浓度为1 mg/ml的储备液,于冰箱(4 ℃)备用。
CA标准工作液:精密吸取CA储备液适量,用50%甲醇水溶液配制成系列浓度的工作溶液,其中,CA质量浓度分别为5 000、2 500、1 000、500、250、100、20 ng/ml。
PPF标准储备液:精密称取PPF 0.4 mg置2 ml容量瓶,加甲醇至刻度,溶解混匀,配制成相当于PPF质量浓度为0.2 mg/ml的储备液,于冰箱(4 ℃)备用。
PPF标准工作液:精密吸取PPF储备液适量,配制成200 ng/ml的含内标乙腈溶液。
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精密吸取血浆30 μl,加入2%甲酸水溶液30 μl,振摇10 s,再加50 μl含内标乙腈溶液后旋涡振荡10 s,12 000 r/ min离心10 min,转移上清液置进样瓶,进样。
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取空白人血浆,精密加入不同浓度的对照品溶液,配制成CA浓度为500、250、100、50、25、10、2 ng/ml的血浆标准品。以浓度为X轴,样品峰与内标峰的比值为Y轴,进行线性回归,经“1/X”权重得回归方程分别为:Y = 7.43×10–3 + 1.99 × 10–2X (r = 0.996 5)。结果表明,CA在2~500 ng/ml内,线性关系良好。本方法CA的定量下限为2 ng/ml。
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配制CA浓度分别为8、80、400 ng/ml的血浆样品,日内误差以3个浓度各5个样品的测定结果表示;日间误差以3个浓度样品分别3个批次结果表示。人空白血浆分别加入不同浓度CA工作溶液,按照“2.3”项下方法提取后,相同色谱条件进行浓度测定。同时测定用流动相稀释为相应浓度的无基质溶液的峰面积,以计算绝对回收率。结果如表2所示。
表 2 CA人血浆样品的系统精密度与准确度(回收率)
CA理论浓度(ng/ml) 日内 日间 测得浓度(ng/ml) 精密度RSD(%) 准确度REC(%) 测得浓度(ng/ml) 精密度RSD(%) 准确度REC(%) 8 8.53 2.39 106.67 8.52 2.00 106.46 80 89.54 1.77 111.93 88.16 3.48 110.19 400 390.53 15.9 97.63 398.59 5.19 99.65 -
空白血浆分别配制成8、80、400 ng/ml的样品,每批次各3个,分别考察其①室温下放置4 h;②处理后室温放置24 h;③-80 ℃放置14 d的稳定性。结果如表3所示。
表 3 CA人血浆样品不同条件下的稳定性
时间 样品浓度(ng/ml) REC(%) RSD(%) 室温4 h 低 103.50 9.28 中 98.27 5.26 高 101.33 3.73 处理后室温24 h 低 77.22 5.37 中 112.95 10.83 高 110.46 6.80 –80 ℃ 14 d 低 75.40 7.95 中 113.67 23.61 高 98.22 1.69 -
取6个不同来源的人空白血浆30 μl,除不加内标外,其余按“2.3”项下操作,取上清液,分别制备成CA浓度为31.25和1 000 ng/ml;PPF浓度为200 ng/ml的溶液,进样测定,记录峰面积。另用流动相将CA稀释成31.25和1 000 ng/ml;PPF浓度为200 ng/ml浓度的溶液,进样测定,记录峰面积。
基质效应=(空白基质中添加工作溶液峰面积/重组溶液中添加工作溶液峰面积)×100%
CA的基质效应为52%(RSD 2.09%~15.33%)。PPF的基质效应为96.71%(RSD4.6%)。
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采用肌松仪监测患者注射苯磺顺式阿曲库铵后神经肌肉阻滞程度。给予4个成串刺激(train of four stimulation,TOF),给药后,T4最先发生衰减,T1最后衰减。当T1消失即仪器显示为0时,肌肉阻滞程度最大,随后逐渐恢复。分别在T0(T1消失至0)、TOFr 50(恢复至50%)、TOFr 90(恢复至90%)时采集输液对侧动脉血3 ml,并及时保存于4 ℃冰箱中。采用建立的方法测定样本血药浓度,结果见表4。同时记录T0(给药结束到T1消失至0)、TOFr50(给药结束到恢复至50%)、TOFr90(给药结束到恢复至90%)发生所需时间,结果见表5、表6。
表 4 6例受试者血浆中CA血药浓度测定结果
TOF (%) 浓度(ng/ml) 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 0 445.02 525.30 253.83 165.29 150.57 309.22 50 76.58 125.65 68.71 68.99 53.18 58.46 90 44.10 71.80 60.72 71.74 41.12 45.07 表 5 6例受试者临床资料
基本信息 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 性别 女 女 女 男 女 男 年龄(岁) 50 49 53 70 36 40 体重(m/kg) 70 75 60 50 53 80 身高(l/cm) 165 165 164 161 165 173 表 6 6例受试者达到各TOF值的时间
TOF(%) 时间(t/min) 0 10 15 15 20 20 20 50 70 70 65 65 65 75 90 105 95 95 100 85 110
Cisatracurium assay in human plasma by LC-MS
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摘要:
目的 建立高效液相色谱串联质谱方法( LC-MS )测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度,并应用于 临床治疗药物监测。 方法 采用盐酸普罗帕酮同位素内标,样品经2%甲酸水和含内标的乙腈溶液沉淀蛋白处理。HPLC色谱柱为Agilent SB-C18,柱温35 ℃,流速0.3 ml/min,流动相为0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱。质谱检测方式为ESI正离子模式,MRM扫描,监测阿曲库铵m/z 464.6~358.4,盐酸普罗帕酮(内标)m/z 342.2~116.2。 结果 人血浆中顺式阿曲库铵在该条件下分离良好,在2~500 ng/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.996 5),定量下限为2 ng/ml。方法日内精密度RSD<16.0%;日间精密度RSD<6.0%。平均回收率为97.63%~111.93%;血浆样品室温放置4 h,-80 ℃放置14 d,处理后室温放置24 h,稳定性良好。 结论 本方法简便、准确、快速、稳定,适用于顺式阿曲库铵的血药浓度测定。 -
关键词:
- 顺式阿曲库铵 /
- 高效液相色谱串联质谱 /
- 人血浆 /
- 治疗药物监测
Abstract:Objective To establish a LC-MS method of cisatracurium assay in human plasma for clinical therapeutic drug monitoring. Method Propafenone Hydrochloride was used as the internal standard. The plasma samples were treated with 2% formic acid aqueous solution and acetonitrile containing the internal standard to precipitate protein. Agilent SB-C18 column was used for gradient elution with the mobile phase of 0.1% formic acid-water and 0.1% formic acid-acetonitrile solution at 35 ℃ and 0.3 ml/min flow rate. The degradation products of cisatracurium m/z 464.6-358.4 and propafenone hydrochloride m/z 342.2-116.2 were identified by ESI positive-ion detection. Results There was a linear rage of cisatracurium in 2-500 ng/ml (r=0.996 5) with a detection limit of 2 ng/ml. The intra-day coefficients of variation (CVs) were less than 16.00%, and the inter-day CVs were less than 6.00%. The mean recoveries were in the range of 97.63%-111.93%. The plasma samples were stable for 4 hours at room temperature, 14 days at -80 ℃ and 24 hours after pretreated. Conclusion This method was simple, accurate, fast and repeatable for the cisatracurium assay in human plasma. -
Key words:
- cisatracurium /
- LC-MS /
- human plasma /
- therapeutic drug monitoring
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表 1 质谱条件
成分 母离子 子离子 驻留时间(t/ms) 碰撞电压(U/V) 电子倍增电压( U/V) 碰撞能量(U/V) CA 464.4 358.4 20 110 200 20 PPF 342.2 166.2 200 130 200 17 表 2 CA人血浆样品的系统精密度与准确度(回收率)
CA理论浓度(ng/ml) 日内 日间 测得浓度(ng/ml) 精密度RSD(%) 准确度REC(%) 测得浓度(ng/ml) 精密度RSD(%) 准确度REC(%) 8 8.53 2.39 106.67 8.52 2.00 106.46 80 89.54 1.77 111.93 88.16 3.48 110.19 400 390.53 15.9 97.63 398.59 5.19 99.65 表 3 CA人血浆样品不同条件下的稳定性
时间 样品浓度(ng/ml) REC(%) RSD(%) 室温4 h 低 103.50 9.28 中 98.27 5.26 高 101.33 3.73 处理后室温24 h 低 77.22 5.37 中 112.95 10.83 高 110.46 6.80 –80 ℃ 14 d 低 75.40 7.95 中 113.67 23.61 高 98.22 1.69 表 4 6例受试者血浆中CA血药浓度测定结果
TOF (%) 浓度(ng/ml) 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 0 445.02 525.30 253.83 165.29 150.57 309.22 50 76.58 125.65 68.71 68.99 53.18 58.46 90 44.10 71.80 60.72 71.74 41.12 45.07 表 5 6例受试者临床资料
基本信息 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 性别 女 女 女 男 女 男 年龄(岁) 50 49 53 70 36 40 体重(m/kg) 70 75 60 50 53 80 身高(l/cm) 165 165 164 161 165 173 表 6 6例受试者达到各TOF值的时间
TOF(%) 时间(t/min) 0 10 15 15 20 20 20 50 70 70 65 65 65 75 90 105 95 95 100 85 110 -
[1] SZAKMANY T, WOODHOUSE T. Use of cisatracurium in critical care: a review of the literature[J]. Minerva Anestesiol,2015,81(4):450-460. [2] DEAR G J, HARRELSON J C, JONES A E, et al. Identification of urinary and biliary conjugated metabolites of the neuromuscular blocker 51W89 by liquid chromatography/mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom,1995,9(14):1457-1464. doi: 10.1002/rcm.1290091425 [3] ZHANG H, WANG P, BARTLETT M G, et al. HPLC determination of cisatracurium besylate and propofol mixtures with LC-MS identification of degradation products[J]. J Pharm Biomed Anal,1998,16(7):1241-1249. doi: 10.1016/S0731-7085(97)00262-8 [4] SAYER H, QUINTELA O, MARQUET P, et al. Identification and quantitation of six non-depolarizing neuromuscular blocking agents by LC-MS in biological fluids[J]. J Anal Toxicol,2004,28(2):105-110. doi: 10.1093/jat/28.2.105 [5] GAO J Y, YANG T, YE M, et al. High-performance liquid chromatography assay with programmed flow elution for cisatracurium in human plasma: application to pharmacokinetics in infants and children[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2014,955-956:58-63. doi: 10.1016/j.jchromb.2014.02.023 [6] GUO J R, YUAN X H, ZHOU X F, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cisatracurium in patients undergoing surgery with two hemodilution methods[J]. J Clin Anesth,2017,38:75-80. doi: 10.1016/j.jclinane.2017.01.013 [7] KISOR D F, SCHMITH V D, WARGIN W A, et al. Importance of the organ-independent elimination of cisatracurium[J]. Anesth Analg,1996,83(5):1065-1071. doi: 10.1213/00000539-199611000-00029 [8] BŁAZEWICZ A, FIJAŁEK Z, WAROWNA-GRZEŚKIEWICZ M, et al. Determination of atracurium, cisatracurium and mivacurium with their impurities in pharmaceutical preparations by liquid chromatography with charged aerosol detection[J]. J Chromatogr A,2010,1217(8):1266-1272. doi: 10.1016/j.chroma.2009.12.025 [9] 吴祝峰. 顺苯磺阿曲库铵在先天性心脏病患者中的药动学与药效学研究[D]. 广州: 暨南大学, 2016.