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便秘是临床中常见的胃肠道疾病,随着生活节奏的加快、饮食结构的改变、精神心理因素的影响,便秘患病率不断上升,全球便秘的患病率约为14%,严重影响人们生活质量[1, 2]。目前,主要采用西药治疗便秘,虽然其在短期内可取得较好的疗效,然而西药不良反应多,停药后易复发,整体疗效欠佳。中医治疗主张治病求本,临床上对便秘的治疗具有丰富的经验,在安全性及长期疗效上更具优势[3, 4]。
通便灵胶囊是北部战区总医院自主研发的医院制剂,由番泻叶、肉苁蓉和当归三味药组成[5]。番泻叶清热导滞,泻下通便,用治热结便秘;当归补血润肠,用治血虚肠燥便秘;肉苁蓉补肾助阳,润肠通便,长于治疗肠燥津枯便秘。三者相合,共奏泻热导滞、滑肠通便之效。番泻叶具有良好的润肠通便的功效[6, 7],奚肇庆等[8]提出在治疗便秘时可用当归、肉苁蓉润下焦。因此,本文通过药效学、网络药理学以及分子生物学的方法,探讨通便灵胶囊对小鼠便秘的治疗作用及初步的分子机制。
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与空白对照组相比较,通便灵胶囊各给药组均可明显缩短排便时间,增加排便粒数详见见表1和图1。
表 1 通便灵胶囊对正常小鼠肠道功能的影响(
$ \bar{x} $ ±s)组别 个数 给药剂量(g/kg) 排便时间(t/min) 排便粒数(粒) 空白对照组 10 − 30.21±2.31 10.30±2.65 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 20.35±2.67* 16.42±3.10* 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 16.62±3.14** 19.64±2.43** 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 13.55±1.29** 24.43±2.37** 阳性对照组 10 0.8 14.98±2.23** 20.55±3.22** *P<0.05,**P<0.01,与正常对照组比较。 -
与空白对照组相比较,模型对照组小鼠小肠推进率明显抑制;与模型对照组相比较,通便灵胶囊各给药组可明显提高小鼠小肠推进率且呈剂量依赖性;具体见表2和图2。
表 2 通便灵胶囊对小鼠碳末推进的影响(
$ \bar{x} $ ±s)组别 个数 给药剂量(g/kg) 推进率(%) 空白对照组 10 − 70.21±2.31 模型对照组 10 − 48.64±3.58*** 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 78.35±2.67### 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 86.62±3.14### 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 93.55±1.29### 阳性对照组 10 0.8 92.98±2.23### ***P<0.001,与模型组比较;### P<0.001,与正常对照组比较。 -
通过TCMSP数据库共搜集到通便灵胶囊的活性成分253个,其中番泻叶53个、肉苁蓉75个、当归125个。以OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选去重得到16个活性成分,活性成分的基本信息表见表3。利用Swiss target prediction数据库预测活性成分的靶点,借助UniProt数据库标准化并去重后共得到366个潜在靶点。
表 3 通便灵胶囊活性成分信息表
序号 ID号 活性成分 OB DL 中药 1 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 当归、肉苁蓉 2 MOL000449 豆甾醇 43.83 0.76 当归、番泻叶 3 MOL002259 大黄素甲醚葡萄糖苷 41.65 0.63 番泻叶 4 MOL002268 大黄酸 47.07 0.28 番泻叶 5 MOL002276 番泻苷E 50.69 0.61 番泻叶 6 MOL002288 大黄素-1-O-β-D-
吡喃葡葡糖苷44.81 0.8 番泻叶 7 MOL002293 番泻苷D 61.06 0.61 番泻叶 8 MOL002369 番泻苷元A 74.55 0.57 番泻叶 9 MOL002372 角鲨烯 33.55 0.42 番泻叶 10 MOL000359 谷甾醇 36.91 0.75 番泻叶 11 MOL000422 山奈酚 41.88 0.24 番泻叶 12 MOL005320 花生四烯酸 45.57 0.2 肉苁蓉 13 MOL005384 苏齐内酯 57.52 0.56 肉苁蓉 14 MOL007563 鹅掌楸树脂酚B二甲醚 57.53 0.81 肉苁蓉 15 MOL000098 槲皮素 46.43 0.28 肉苁蓉 16 MOL008871 枫马京 37.05 0.69 肉苁蓉 -
使用GeneCards、Disgenet、OMIM数据库检索收集便秘靶点,经筛选、剔除重复靶点和标准化后共获得1 505个便秘相关靶点。应用Draw Venn Diagram 在线工具,绘制韦恩图,活性成分的潜在靶点与便秘靶点取交集,得到潜在作用靶点108个(图3)。
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在String数据库中导入108个潜在靶点,聚类分析得到6类靶点,通过Cytoscape3.9.1软件中利用“Network Analyze”构建PPI相互作用的PPI网络图(图4),其中节点表示蛋白,边表示蛋白之间相互作用关系,颜色越深、节点越大则度值越大,表明该靶点关联的靶点越多、作用越关键。
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通过Metascape数据库,对通便灵胶囊治疗便秘的28个潜在作用靶点进行GO富集分析,共得到生物学过程(BP)
1421 个条目、分子功能(MF) 101个条目和(CC) 116个条目。BP主要包括蛋白质磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化等,CC主要分布在膜筏、膜微区、神经元细胞体等,MF涉及蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。根据参数计数进行排序,对 BP、MF、CC 排名前10位的条目用簇状条形图表示(图5)。 -
KEGG通路富集分析得到168条信号通路,根据P值将KEGG富集分析结果排序,将排在前20条的信号通路进行可视化处理,分类并绘制气泡图(图6),横坐标表示靶点数,纵坐标表示通路名称,通路上靶点数越多颜色越红,靶点数越少颜色越蓝。通便灵胶囊治疗便秘主要与磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用等信号通路密切相关。
通便灵胶囊对便秘小鼠结肠组织 PI3K、AKT、CASP3蛋白表达水平的影响Western Blot结果显示,与空白组比较,模型组小鼠结肠组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达均显著升高。与模型组比较,通便灵胶囊各给药组均能显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达。结果见图7。
Study on the efficacy and mechanism of Tongbianling capsule in the treatment of constipation
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摘要:
目的 研究通便灵胶囊治疗便秘的药效以及潜在的作用机制。 方法 观察通便灵胶囊给药后,药物对正常小鼠肠道运动功能和便秘模型小鼠小肠碳末推进率的影响。利用网络药理学找到通便灵胶囊治疗便秘的潜在靶点以及关键通路,取小鼠结肠组织,通过检测p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达情况验证其作用机制。 结果 通便灵胶囊使正常小鼠排第一粒黑便时间缩短,粪粒增多;通便灵胶囊便秘模型小鼠碳末推进率增高;网络药理学结果显示通便灵胶囊治疗便秘可能与PI3K-Akt信号通路和5-HT等信号通路有关;Western blot显示各给药组均能显著下调小鼠结肠组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、CASP3的蛋白表达。 结论 通便灵胶囊能有效促进小鼠肠道蠕动,增加排便次数,从而有效治疗便秘;其作用机制可能与PI3K-Akt信号通路直接或间接调节肠道运动功能有关。 Abstract:Object To study the efficacy and potential mechanism of Tongbianling capsule in constipation. Methods To observe the effects of Tongbianling capsule on intestinal motility in normal mice and carbon powder propulsion rate in small intestine of constipation model mice after administration. The potential targets and key pathways of Tongbianling capsule in treating constipation were identified through network pharmacology. To verify the mechanism, the expression of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT and CASP3 proteins in mouse colon tissue was detected by the western blot. Results The time for mice to excrete the first black stool was shortened and the number of fecal particles was increased in Tongbianling capsule administration group, and the carbon powder propulsion rate of mice in each Tongbianling capsule administration group was increased. The results of network pharmacology showed that treatment of constipation by Tongbianling capsule may be related to signaling pathways such as PI3K-Akt signaling pathway and 5-HT. The protein expression of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, and CASP3 in mouse colon tissue could be significantly downregulated in administration group. Conclusion Tongbianling capsule could effectively promote intestinal peristalsis in mice, increase the frequency of defecation, and effectively treat constipation. The mechanism of its action may be related to the direct or indirect regulation of intestinal motility by the PI3K-Akt signaling pathway. -
Key words:
- Tongbianling capsule /
- constipation /
- mechanism
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表 1 通便灵胶囊对正常小鼠肠道功能的影响(
$ \bar{x} $ ±s)组别 个数 给药剂量(g/kg) 排便时间(t/min) 排便粒数(粒) 空白对照组 10 − 30.21±2.31 10.30±2.65 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 20.35±2.67* 16.42±3.10* 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 16.62±3.14** 19.64±2.43** 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 13.55±1.29** 24.43±2.37** 阳性对照组 10 0.8 14.98±2.23** 20.55±3.22** *P<0.05,**P<0.01,与正常对照组比较。 表 2 通便灵胶囊对小鼠碳末推进的影响(
$ \bar{x} $ ±s)组别 个数 给药剂量(g/kg) 推进率(%) 空白对照组 10 − 70.21±2.31 模型对照组 10 − 48.64±3.58*** 通便灵胶囊低剂量组 10 0.2 78.35±2.67### 通便灵胶囊中剂量组 10 0.6 86.62±3.14### 通便灵胶囊高剂量组 10 1.8 93.55±1.29### 阳性对照组 10 0.8 92.98±2.23### ***P<0.001,与模型组比较;### P<0.001,与正常对照组比较。 表 3 通便灵胶囊活性成分信息表
序号 ID号 活性成分 OB DL 中药 1 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 当归、肉苁蓉 2 MOL000449 豆甾醇 43.83 0.76 当归、番泻叶 3 MOL002259 大黄素甲醚葡萄糖苷 41.65 0.63 番泻叶 4 MOL002268 大黄酸 47.07 0.28 番泻叶 5 MOL002276 番泻苷E 50.69 0.61 番泻叶 6 MOL002288 大黄素-1-O-β-D-
吡喃葡葡糖苷44.81 0.8 番泻叶 7 MOL002293 番泻苷D 61.06 0.61 番泻叶 8 MOL002369 番泻苷元A 74.55 0.57 番泻叶 9 MOL002372 角鲨烯 33.55 0.42 番泻叶 10 MOL000359 谷甾醇 36.91 0.75 番泻叶 11 MOL000422 山奈酚 41.88 0.24 番泻叶 12 MOL005320 花生四烯酸 45.57 0.2 肉苁蓉 13 MOL005384 苏齐内酯 57.52 0.56 肉苁蓉 14 MOL007563 鹅掌楸树脂酚B二甲醚 57.53 0.81 肉苁蓉 15 MOL000098 槲皮素 46.43 0.28 肉苁蓉 16 MOL008871 枫马京 37.05 0.69 肉苁蓉 -
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