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类风湿关节炎（RA）以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现，具有异质性、系统性，呈慢性、进行性、侵袭性，如无恰当治疗，则病情逐渐加重而形成永久性骨质破坏并最终出现残疾，甚至累及脏器和神经系统而危及生命。通过早诊断、早治疗，阻止关节炎症病变发展成不可逆的骨破坏至关重要。目前常用的治疗RA药物如非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情的抗风湿药、免疫抑制剂及生物制剂等，可在较短的时间改善患者的临床症状，但长期使用存在不良反应增多、费用较高、单一靶向作用疗效受限等问题，因此寻找有效、低毒、价廉及适合长期服用的RA药物，成为研究热点。
RA属于中医学“历节风”、“顽痹”、“骨痹”、“鹤膝风”等范畴。《素问•痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，治疗以祛风散寒除湿，通络止痛为主。青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.和毛青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils. var. cinereum Rehd. et Wils.的干燥藤茎（《中国药典》2020年版)，其性味苦、辛、平，归肝、脾经，能有效祛风除湿，通络止痛。《本草汇言》载“青风藤，散风寒湿痹之药，能舒筋活血，正骨利髓。”《本草纲目》认为有“治风湿流注，历节鹤膝”之功。现代研究显示以青风藤为主要药物的汤剂，可有效延缓疾病发展，改善患者临床症状[1-2]；青风藤的有效成分青藤碱也具有较好的抗炎镇痛和抑制自身抗体产生的作用，在治疗RA方面，具有较好的临床疗效和较低的副作用[3]。本文旨在通过对青风藤进行网络药理学分析，以期探索其物质基础及可能的作用机制，为进一步研究青风藤治疗RA提供理论依据。
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中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP）是国内相对完善的中药成分靶点数据库，收录了中药502味，相关靶点3 339个，同时对每个成分的药动学参数进行了详细的描述。通过TCMSP获取青风藤的化学成分。再根据化合物口服生物利用度（OB）与类药性指数（DL）筛选活性成分，其中OB阈值设为OB≥30%，DL阈值设为DL≥0.18[4-5]。下载活性成分的结构，将活性成分的结构保存为mol2格式。
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DRAR-CPI（https://cpi.bio-x.cn/drar/）是基于DOCK分子对接程序开发的反向分子对接服务器，可对接药物分子和蛋白的三维结构和特征，并通过蛋白-配体相互作用能的亲和性以函数打分并排序。对接分数（Z-score）代表药物分子与蛋白的相互作用强度。服务器研发者认为，Z-score <−1的蛋白质是良好的潜在靶点。通过DRAR-CPI服务器筛选出青风藤有效成分的蛋白靶点后，利用UniProt数据库对靶点处理，得到标准名称，获取基因靶点。
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通过对Geencards数据库、OMIM数据库进行检索，得到RA的相关靶点。
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为明确青风藤与RA潜在靶点间的相互作用，利用Venn在线软件将药物与疾病靶点取交集，通过Venn图的形式展现药物靶点与疾病靶点间存在的交集靶点，运用Cytoscape软件进行可视化分析。
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将筛选得到的药物-疾病共同靶点上传至String在线平台数据库，构建蛋白质相互作用网络模型，获得PPI网络。
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利用clusterProfiler程序包（3.6版）对药物-疾病共同靶点进行GO分析和KEGG通路分析，设定阈值P<0.05，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选GO富集分析中分子功能、细胞组成和生物过程的前10个条目以及KEGG富集的前10个信号通路，进一步筛选与RA相关的信号通路，探讨青风藤抗RA的生物学过程及信号通路。
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从TCMSP共获得青风藤16个化学成分，以OB>30%，DL>0.18为筛选条件，共筛选出有效活性成分6个（表1）。
表 1 青风藤有效成分
成分代码 化合物名称 OB (%) DL MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000621 拉兹马宁碱（16-epi-Isositsirikine） 49.52 0.59 MOL000627 千金藤啶碱（stepholidine） 33.11 0.54 MOL000625 青藤碱（sinomenine） 46.09 0.53 MOL000623 乌心石环氧内酯（michelenolide） 47.54 0.25 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 -
登陆DRAR-CPI服务器并上传青风藤有效活性成分结构的mol2格式文件，筛选Z-score <−1的蛋白靶点的PDB ID导入Uniprot数据库，获取6个有效活性成分的潜在基因靶点合计383个。其中，存在多个有效成分对应同一基因靶点的情况，经去重处理后，共获得青风藤潜在基因靶点176个。
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通过Geencards数据库得到RA相关靶点4329个，通过筛选设置relevance score≥15，最终获得305个相关靶点，OMIM数据库得到与RA相关靶点13个，筛重后获得疾病相关靶点305个。
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利用Venn 2.1软件将“青风藤”活性成分对应的176个靶点与RA对应的305个靶点进行交集，获得15个共有靶点（图1）。将15个共有靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“青风藤-化合物-靶点-RA”的网络图并进行可视化分析（图1）。该网络包含了23个节点，100条边，其中，三角形代表药物；燕尾形代表疾病；菱形代表活性成分；椭圆形代表靶点；连接化合物与靶点的边表示它们之间有作用关系。依据网络拓扑学性质可知，靶点度值(degree)是拓扑结构中的重要参数，其表示网络中和节点相连的路线的条数，度值高的节点很可能在整个网络中起到桥梁作用，有较多节点的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用。本研究筛选度值较大的节点进行分析，排名前3位的化合物分别为青藤碱（sinomenine）、拉兹马宁碱（16-epi-isositsirikine）及乌心石环氧内酯（michelenolide），其分别能与8、6及6个靶点蛋白发生作用。从靶点的角度看，排名前4位的是IL-10、B2M、NR3C1及S100A9，分别能与4、4、3及3个化合物发生相互作用，体现了中药多靶点的特性。
图 1 “青风藤-化合物-靶点-RA”可视化网络图
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将Venn图获得的15个药物-疾病共同靶点上传至String在线数据库平台得到PPI网络（图2），同时得到网络中相关节点的度值。在此网络中包含节点15个，边55条，度值均值7.33。根据“度值>均值”筛选出关键靶点7个，包括：IL-10、IL-4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1、MAPK14。度值最高的是IL-10，为14；其次为IL-4，度值为13；INS度值为12。度值大的靶点提示在网络调控中起着关键作用，度值大的靶点很可能是青风藤治疗RA的关键靶点。
图 2 靶蛋白PPI网络图
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GO是Gene Ontology的简称，主要包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）及分子功能（MF）3个部分。本研究GO功能富集分析显示500个生物过程（BP）、18个细胞组成（CC）、28个分子功能（MF），分别对BP、CC及MF前10个条目进行可视化分析，得到图3，其中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数。图4显示共同作用靶点在BP中，主要富集条目为对细菌起源分子的反应、细胞对生物刺激的反应，调节DNA结合转录因子活性、积极调节细胞因子的产生、调节炎症反应，以及对中性粒细胞活化的调节、对脂多糖的反应等；共同作用靶点在CC中主要富集条目为分泌颗粒内腔、细胞质囊泡腔、内体腔、液泡腔等；共同作用靶点在MF中主要富集条目为MAP激酶活性、Toll样受体结合、细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、磷酸酶结合、细胞因子活性等。
图 3 靶点的GO分析（含BP、CC及MF）柱状图
图 4 靶点KEGG通路富集分析图
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KEGG通路富集分析显示77条通路，对前10条通路进行可视化分析，得到图4，其中纵坐标表示富集通路的名称，横坐标表示富集基因个数。前10条通路显示，靶点主要富集于FcεRI信号通路、百日咳、利什曼病、结核、IL-17信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、弓形虫病、FoxO信号通路等，多为感染、炎症和免疫相关通路。其中涉及到的靶点基因，出现频次较高的是MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL-10及IL-4。
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痹病，是人体正气不足或脏腑功能失调，风寒湿热等邪为患，痰浊瘀血滞留，引起经脉气血不通，出现肢体关节疼痛肿胀及活动不利等为特征的疾病。中药青风藤功能祛风除湿，通络止痛，在痹病治疗中应用较多，疗效可靠。由于中药是一个多成分多靶标并且可以调节机体内多个生物学途径的复杂混合物系统，中药中的化学成分可以作用于机体内多个靶标从而发挥协同作用来治疗疾病，给中药作用机制的研究带来了一定的挑战。近年来，网络药理学发展十分迅速，已成为在药理学研究中一个很有价值的工具，现今也逐渐应用到中医药研究领域，对单位中药及中药复方中活性药物成分的预测和分析、阐述复方的分子作用机制有重要意义[6-9]。
本研究通过TCMSP筛选青风藤有效活性成分6个，分别是β-谷固醇、拉兹马宁碱、千金藤啶碱、青藤碱、乌心石环氧内酯、甘露聚糖。通过DRAR-CPI服务器筛选出青风藤靶点176个。使用GeenCards及OMIM数据库得到与RA相关靶点305个。药物靶点与疾病靶点进行Venn图绘制，获得共同相关的15个靶点。将这15个共同靶点上传至String在线数据库平台得到PPI网络，根据“度值>均值”筛选出关键靶点7个，包括：IL-10、IL-4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1、MAPK14。GO功能富集分析显示500个BP、18个CC、28个MF。KEGG通路富集分析显示77条通路，排名前10的信号通路集中在感染、炎症和免疫等相关通路。
已有的研究提示，β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，具有抗炎、调节人体甾体激素、抗氧化及抗肿瘤等作用[10]。Kripa等研究发现，含有β-谷甾醇的白术醇提物可明显降低佐剂型关节炎大鼠血清和组织中的TNF-α、C-反应蛋白和IL-2的含量，证明含有β-谷甾醇的白术具有显著的抗炎作用[11]。拉兹马宁碱可调节COX-2表达[12]。千金藤啶碱不仅具有镇痛及对多巴胺D1激动、D2拮抗、D3拮抗等多重作用，对心脏也具有较强的生物活性[13]。青藤碱具有免疫抑制、抗炎、镇痛、抗心律失常、降血压等多种药理作用，已经被证明在治疗多种疾病中有药理学活性[12]。
本研究中药物与疾病共同的15个靶点，主要参与对细菌起源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、调节DNA结合转录因子活性、调节细胞因子的产生、调节炎症反应、对中性粒细胞活化的调节、对脂多糖的反应等生物学过程。主要参与FcεRI信号通路、百日咳、利什曼病、结核、IL-17信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、弓形虫病、FoxO信号通路等感染、炎症和免疫相关通路。这些通路中涉及次数较多的靶基因依次为MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL-10及IL-4。总之，提示青风藤具有多成分、多靶点、多通路、多途径的作用特点，通过不同靶点和通路发挥药效以治疗RA。
RA特征性的病理改变包括关节滑膜组织炎性细胞浸润、血管翳形成及对关节骨和软骨以及周围组织造成破坏与侵蚀，在免疫介导的RA的炎症、增生和骨破坏三大病理过程中，MAPK都起着重要的调节作用。IL-10、IL-4作为抑炎和抗炎因子，参与了RA的炎症过程，高水平的细胞因子不断刺激T细胞、破骨细胞、滑膜细胞，导致细胞内的蛋白激酶异常激活和过度的信号传导，从而调控相关基因的过量表达。研究表明，对胶原诱导的关节炎大鼠给予MAPK信号转导通路抑制剂后，在抑制滑膜炎症、骨质破坏和关节软骨的破坏方面，与未给信号通路抑制剂组相比有显著性差异[14]。以MAPK信号通路作为治疗靶点，然后针对其信号传递中的各个阶段抑制其活化，已经成为治疗RA的一个热点。研究显示，用青藤碱与针刺联合治疗大鼠胶原性关节炎，关节炎评分降低，症状好转。同时，核因子κB和磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表达被抑制，提示可能通过核因子κB和MAPK信号通路发挥作用[15]。
本研究通过中药活性成分的筛选、靶点预测、网络构建与分析，从“药物-化合物-靶点-疾病”的关联性对青风藤治疗RA的相关作用机制进行分析，找出了关键靶点和通路，MAPK信号通路也可作为后续研究的参考。为中药青风藤治疗RA的临床和实验研究提供了部分依据和理论支持。同时，本研究尚存在一些局限性，如数据库中数据可能不完全，获取小分子化合物及作用靶标数量有限，不能完全揭示中药药理作用；依托网络构建的数据来源中存在对某些研究热点倾向性，可能对本研究结果产生影响，但仍需进一步做验证实验，以准确揭示中药抗RA有效成分及作用机制。
Mechanism of Sinomenii caulis in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology
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摘要:
目的 应用网络药理学研究方法，探讨青风藤治疗类风湿关节炎（RA）的可能作用机制。 方法 使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选青风藤的化学成分，并依据TCMSP数据库的口服生物利用度（OB）和类药性指数（DL）筛选出主要有效活性成分。借助DRAR-CPI分子对接服务器得到有效活性成分的潜在作用靶点。通过Genecards、OMIM数据库筛选出RA的靶点，利用Venn软件获取药物与疾病的共同靶点，运用Cytoscape软件构建“化合物-靶点-疾病”网络图。使用String数据库绘制靶蛋白相互作用（PPI）网络，利用clusterProfiler程序包对有效作用靶点进行GO功能、KEGG通路富集分析。 结果 该研究共筛选出青风藤有效活性成分6个，作用靶点176个；RA靶点305个；青风藤治疗RA的靶点15个。GO功能富集分析显示500个生物过程（BP）、18个细胞组成（CC）、28个分子功能（MF）。KEGG通路富集分析显示77条通路。 结论 该研究初步揭示了青风藤中以青藤碱为主的6种有效活性成分发挥了抗RA的作用，治疗的关键靶点与IL-10、IL-4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1、MAPK14有关，涉及的生物学过程及信号通路主要与感染、炎症及免疫相关，为进一步的分子生物学实验研究奠定了基础。 Abstract:Objective To explore the molecular targets and associated potential pathways of Sinomenii caulis in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) based on network pharmacology. Methods The constituents of Sinomenii caulis were searched by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The potential active ingredients were screened based on oral bioavailability (OB) and drug like index (DL) in TCMSP database. The potential targets of active ingrediens were explored based on DRAR-CPI docking server. RA related gene targets were retrieved through GeneCards and OMIM database. Venn online software was used to obtain the common target of drugs and diseases. The "herbs-compound-target-disease" network diagram was constructed by using Cytoscape software. String database was used to draw the protein interaction (PPI) network. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of the intersection network were conducted by Bioconductor Database. Results 6 active ingredients and 176 targets were identified. 305 target genes directly related to RA were obtained from the GeneCards and OMIM databases. 15 genes were obtained from the intersection of component-target and disease-target. The GO function analysis found 500 items on biological process (BP), 18 items on cellular component (CC), and 28 items on molecular function (MF). KEGG pathway enrichment analysis revealed 77 pathways. Conclusion This study identified six active ingredients from Sinomenii caulis and revealed the key targets of the anti-RA treatment with Sinomenii caulis being IL10、IL4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1 and MAPK14. The important biological processes and signaling pathways including infection, inflammation and immunity were explored. It has laid the foundation for further molecular biology experiments. -
Key words:
- Sinomenii caulis /
- rheumatoid arthritis /
- network pharmacology /
- signaling pathways
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表 1 青风藤有效成分
成分代码 化合物名称 OB (%) DL MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000621 拉兹马宁碱（16-epi-Isositsirikine） 49.52 0.59 MOL000627 千金藤啶碱（stepholidine） 33.11 0.54 MOL000625 青藤碱（sinomenine） 46.09 0.53 MOL000623 乌心石环氧内酯（michelenolide） 47.54 0.25 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 
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图(4) / 表(1)
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