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保护血管内皮对维护心血管系统健康有着重要意义[1]。近年的研究证实，血管内皮完整性的维持不仅依赖于现有的内皮细胞，而且与骨髓来源的具有向成熟内皮细胞分化能力的未成熟细胞—内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)的募集有关[2-3]。临床研究证实，外周血中循环EPC的数量与冠心病常见的危险因素（如高血压、糖尿病等）呈负相关关系，EPC可作为治疗缺血、肺动脉高压等血管疾病状态的新靶点[2-3]。本课题组和他人的研究均证实[2, 4-5]，高血压动物和患者的EPC均出现显著的功能受损。因此，如果能够通过药物干预手段逆转其受损的EPC功能，无疑对减轻高血压患者与内皮功能相关的靶器官损伤，以及改善高血压EPC移植治疗效果等具有重要意义。
去氧皮质酮/盐(Deoxycorticosterone acetate-salt, DOCA-salt)高血压模型是一种盐敏感性高血压动物模型，盐敏感性高血压在美国高血压患者中占1/3的比例，是一种重要的高血压类型[4-6]。课题组既往的研究证实，DOCA-salt高血压小鼠EPC功能受损与其内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的脱偶联(uncoupling)有关[5]。在研究中我们也找到了一些对eNOS脱偶联相关的信号通路/分子有一定改善作用的药物，如四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)，超氧化物歧化酶-聚乙二醇(superoxide dismutase-polyethylene glycol, PEG-SOD)，N(G)-硝基-L-精氨酸(N(G)-nitro-L-arginine, L-NNA)等[5-6]。但目前尚不知道这些药物是否可有效逆转DOCA-salt小鼠受损的EPC功能。本研究拟在以往研究的基础上，寻找改善盐敏感性高血压小鼠EPC功能失常的有效药物干预手段，为进一步的EPC移植治疗研究奠定基础。
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野生型(C57BL/6)雄性小鼠，10~12周龄，体重20~25 g（上海斯莱克实验动物中心）。
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BH4、PEG-SOD、L-NNA（美国Sigma公司），EGM-2培养基（Lonza公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），Matrigel胶（美国BD公司）。
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选用10~12周龄，体重20~25 g野生型(C57BL/6)雄性小鼠进行模型制作。小鼠麻醉，侧卧位固定，腹部纵行切口，暴露左肾，小心结扎肾动脉和肾静脉后，进行左肾切除，缝合切口。然后在小鼠两前臂中间的位置开一个大约1 cm的纵行切口，皮下埋置150 mg/kg的DOCA缓释片。DOCA组小鼠给予含1.0% NaCl和0.2% KCl的盐水。假手术组小鼠也进行左肾切除，但不给DOCA缓释片，而且饮用常规自来水。手术后，所有动物被单独饲养于一个干净的塑料笼内。术后第21天用尾动脉测压法测定动物的收缩压水平。
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将玻璃粘连蛋白（vitronectin）加入6孔板预处理后备用。小鼠麻醉后处死。使用无菌器械剥离小鼠双侧后肢股骨、胫骨并剔除肌肉组织，于超净台内用EGM-2培养基冲出骨髓。将骨髓细胞浓度调定至2.5×105 /cm2后，加入预处理的6孔板内培养（37 ℃、5% CO2）。第4天弃去原培养基，更换新鲜培养基，第7天使用。
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本研究采用了以下两种鉴定方法。
（1）流式细胞仪法：EPC培养至第7天后，用0.125%胰酶-0.02% EDTA消化，洗涤后调整细胞密度为2×106 /ml，将细胞与Sca-1的抗体（1 µg/ml）和Flk-1的抗体（1 µg/ml）在冰上共孵育1 h，注意避光。之后用5%BSA/PBS洗涤，再用2%的多聚甲醛固定10 min，用流式细胞仪检测Sca-1、Flk-1双标阳性的细胞，即为EPC。
（2）荧光显微镜法：EPC培养至第7天后，用PBS洗细胞，加入1 mg/ml Dil-acLDL(1:200)，于37 ℃避光孵育4 h，用PBS洗细胞，加2%多聚甲醛固定10 min。加10 µg/ml的Lectin，室温避光孵育1 h，再用PBS洗细胞。加Hoechst 33258(10 µg/ml），室温避光孵育30 min，用PBS洗细胞，加2%多聚甲醛固定10 min后，在荧光显微镜下观察Dil-acLDL(红色荧光）、Lectin（绿色荧光）、Hoechst 33258（蓝色荧光）3种染料染色阳性的细胞，即为EPC。
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小鼠骨髓来源EPC培养至第6天后换液，分别用BH4 (10 µmol/L), PEG-SOD (100 U/L)和L-NNA (0.8 mmol/L)3种药物孵育24 h后，测定其小管形成功能和黏附功能。
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培养7 d的EPC用0.125%胰酶−0.02% EDTA消化，将1×104细胞接种于vitronectin包被好的96孔板中，每个样本设4复孔。37 ℃、5% CO2孵育24 h后，去除培养基，PBS洗涤3次，然后用Hoechst 33258 (5 µg/ml)染细胞核，再用PBS洗涤3次。在荧光显微镜下，随机选取3个视野（100×）计算黏附细胞数并取平均值。
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在冰上预冷的96孔板中加入60 µl的matrigel，于37 ℃孵育30 min。培养7 d的EPC用0.125%胰酶−0.02% EDTA消化，将5×104细胞接种于matrigel上，在37 ℃，5% CO2孵箱中孵育6 h后，于显微镜下随机选取4个视野（40×）计算形成小管的数目并取平均值。
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所得实验数据均通过Prism统计软件进行分析，分别选取配对t-检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA)作为2组数据和3组以上数据之间比较的统计学分析方法；选用Newman Keuls法进行均数之间的多重比较。数据书写格式为(均数±标准误)。以P<0.05表示差异有统计学意义。
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手术后分别测量高血压模型组和假手术组动物的血压水平，发现与假手术组相比，高血压模型组动物的收缩压水平显著上升（P<0.01，图1）。
图 1 假手术小鼠与DOCA-salt高血压小鼠收缩压水平的比较(n=5)
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将培养至第7天的骨髓来源的EPC通过荧光显微镜法鉴定，显示Dil-acLDL/Lectin/Hoechst 33258三染阳性的细胞的比例为87.18%；通过流式细胞仪法鉴定，显示Sca-1和Flk-1双标阳性的细胞比例为（11.2±1.5）:1，见图2。以上结果与文献报道中使用同类鉴定方法的结果相近[7-10]。
图 2 小鼠内皮祖细胞的鉴定
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与对照组相比，DOCA-salt高血压小鼠EPC的黏附功能受损，而分别用BH4 (10 µmol/L), PEG-SOD (100 U/L)，L-NNA (0.8 mmol/L)3种药物孵育24 h后，其黏附功能得到显著改善（图3）。
图 3 BH4, PEG-SOD, L-NNA孵育改善DOCA-salt高血压小鼠EPC的黏附功能
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与对照组相比，DOCA-salt高血压小鼠EPC的小管形成功能受损，而分别用BH4 (10 µmol/L), PEG-SOD (100 U/L)，L-NNA (0.8 mmol/L)3种药物孵育24 h后，其小管形成功能得到显著改善（图4）。
图 4 BH4, PEG-SOD, L-NNA孵育改善DOCA-salt小鼠EPC的小管形成功能
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本研究发现，BH4、PEG-SOD和L-NNA均可有效改善DOCA-salt高血压小鼠EPC受损的功能。但此3种药物改善DOCA-salt小鼠EPC功能的具体机制尚有待进一步探究。
近年来研究发现，eNOS除了合成一氧化氮（nitric oxide, NO）外，在某些病理情况下，还是超氧阴离子（O2-）的重要来源。BH4是eNOS的必要辅助因子，影响NO和O2-的生成。BH4充足时eNOS催化底物L-精氨酸和O2-生成L-胍氨酸和NO；BH4缺乏时，eNOS则发生脱偶联，主要催化O2-产生[5-6, 11]。BH4缺乏是高血压、糖尿病等疾病中内皮功能异常的重要原因[11]。
本课题组和他人曾利用DOCA-salt高血压动物进行过大量血管生物学研究[4-6, 12]，发现该动物血管功能异常与血管组织eNOS脱偶联有关。另外首次发现，DOCA-salt高血压小鼠EPC中BH4水平显著下降，出现eNOS脱偶联，而且eNOS脱偶联所引起的O2-水平升高是导致EPC功能异常的重要机制之一[5]。接着，我们还尝试采用一些药物手段对eNOS脱偶联相关的信号通路/分子进行了干预：①通过外源性补充BH4促进EPC的eNOS复偶联；②用L-NNA抑制脱偶联的eNOS活性，使其产生的O2-水平降低；③补充PEG-SOD直接清除EPC中升高的O2-[5]。我们发现，这些药物干预手段都能显著降低DOCA-salt高血压小鼠EPC的O2-水平[5]。本研究在这些发现的基础上进一步证实，这3种药物干预手段也能显著改善DOCA-salt高血压小鼠EPC的黏附功能和小管形成功能。这些结果也反过来验证了DOCA-salt小鼠EPC功能异常与eNOS脱偶联的关系。
通过本研究证实，BH4、PEG-SOD、L-NNA均可有效改善DOCA-salt高血压小鼠EPC受损的功能。这些研究结果可为高血压血管并发症的治疗提供参考，也可为改善高血压EPC移植治疗效果提供实验基础。
Improvement of impaired endothelial progenitor cell functions by in vitro drug interference in DOCA-salt hypertensive mice
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摘要:
目的 探索改善去氧皮质酮/盐（DOCA-salt）高血压小鼠内皮祖细胞（EPC）功能的药物干预手段。 方法 健康的成年C57BL/6小鼠，随机分为模型组和假手术对照组，模型组制备DOCA-salt高血压小鼠模型，用尾动脉测压法测定小鼠血压，提取其EPC并分别用流式细胞仪和荧光显微镜进行鉴定，模型组小鼠EPC分别用四氢生物蝶呤（BH4）、超氧化物歧化酶-聚乙二醇（PEG-SOD）、N(G)-硝基-L-精氨酸（L-NNA）孵育24 h，检测其功能。 结果 与对照组比较，DOCA-salt高血压小鼠的收缩压明显升高（P<0.01），其EPC的黏附功能和小管形成功能明显受损（P<0.01），而经BH4、PEG-SOD、L-NNA孵育24 h后，EPC的黏附功能（P<0.01)和小管形成功能（P<0.05）均显著改善。 结论 BH4、PEG-SOD、L-NNA可有效改善DOCA-salt高血压小鼠EPC受损的功能。 -
关键词:
- 内皮祖细胞 /
- 高血压 /
- 四氢生物蝶呤 /
- 超氧化物歧化酶 /
- N(G)-硝基-L-精氨酸
Abstract:Objective To investigate the effect of tetrahydrobiopterin (BH4), superoxide dismutase-polyethylene glycol (PEG-SOD) and N(G)-nitro-L-arginine (L-NNA) on impaired endothelial progenitor cell (EPC) functions in DOCA-salt hypertensive mice. Methods DOCA-salt hypertension was created and systolic blood pressure was measured by tail-cuff methods. EPC was isolated from bone marrow of mice and characterized by flow cytometry and fluorescence microscopy. EPC of DOCA-salt mice was incubated with BH4, PEG-SOD, and L-NNA for 24 h, then in vitro EPC function assays were performed. Results Compared with control group, systolic blood pressure was significantly increased in DOCA-salt mice. Both EPC adhesion and angiogenesis functions were impaired in DOCA-salt mice compared to control animals, which were reversed by incubation with BH4, PEG-SOD and L-NNA. Conclusion BH4, PEG-SOD and L-NNA rescued the impairments from EPC functions in DOCA-salt hypertensive mice. -
图 2 小鼠内皮祖细胞的鉴定
A.荧光显微镜法：Dil-acLDL/Lectin/Hoechst 33258三染阳性的细胞即为EPC，Merge，Dil-acLDL/Lectin/Hoechst 33258三种荧光叠加；B.流式细胞仪法：用Sca-1、Flk-1两种抗体标记，双标阳性的细胞即为EPC（n=5）
图 3 BH4, PEG-SOD, L-NNA孵育改善DOCA-salt高血压小鼠EPC的黏附功能
对照：假手术对照组小鼠EPC；DOCA：DOCA-salt小鼠EPC；BH4、PEG-SOD、L-NNA：分别用BH4、PEG-SOD、L-NNA体外孵育的DOCA-salt小鼠EPC（n=8～15） **P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与DOCA组比较。
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