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药品是军队供应保障的重要战略物资，在运输、携行和存储过程中，可能受到高温、高压、潮湿等特殊环境因素的影响。在军队药品质量控制工作中，药品的效期管理尤为重要，直接影响到相关药品的供给时间、调配周期以及质量稳定性。然而，仅以药品外包装上标注的保质期来判定药品效期是不准确的。保质期是指包装完好的药品在适当温度下储存可实现的货架寿命，但在药品的运输、存储过程中，外部环境对其质量的影响具有不可预测性，标注的保质期并不能准确显示药品的实际质量。为了保证温度敏感型军队药品的稳定性，监视其从生产、运输、储存、分发到使用全过程的温度变化十分必要。时间-温度指示器（time-temperature indicator，TTI）可以随时间和温度的增加发生不可逆的显色反应，指示外环境的温度变化情况，将时间和温度要素与温度敏感型药品的稳定性联系起来，对药品的储运温度进行全程监控，保障药品使用的安全性和有效性。
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TTI具有时间、温度的累积记忆效应，在药品包装领域具有重要的应用价值。早在20世纪60年代，国外就进行了相关研究并开始商业化应用，到了20世纪70年代，美国政府就将TTI应用于某些特殊药品。目前，国外相关领域已相继开发出较成熟的商业化TTI，如瑞典Vitsab公司的Vitsab Check Point，美国Lifelines公司的Fresh Check，DeltaTRAK公司的WarmMark，3M公司的Monitor Mark和Freshness Check，TEMPTIME的VVM、FREEZEmarker、LIMITmarker I和LIMITmarker F[1-2]。近年来，针对TTI的研究主要集中于扩散型、聚合型、酶型和微生物型4个类别[3-4]。
扩散型TTI的原理较简单，该项技术也较成熟，其基本原理是利用物质的扩散特性，如有色酯质染料，其指示范围和指示效期取决于酯质类型。当环境温度低于指示剂熔点时，TTI无响应；随着环境温度的升高，TTI的热熔性指示剂开始熔化，并沿毛细纤维扩散，且温度越高，扩散速度越快，以此来判断药品的剩余效期。扩散型TTI可在低温环境下长期保存，世界卫生组织（WHO）曾将其用于船运冷冻疫苗的监测，是最早研发的TTI之一。在商业化TTI中，美国3M公司的Monitor Mark和Freshness Check是典型的扩散型TTI[5]，Monitor Mark的扩散剂为酯质染料，可用于药品、疫苗和血液制品的储存温度监测，使用前需存储于低于酯质熔点的环境下；Freshness Check则根据无定型材料沿多孔基质扩散，改变了多孔基质的透光率的原理制成，可用于食品的储存温度检测，可存储于室温环境下。艾志录等[6]研制了一种采用水杨酸甲酯、γ-己内酯和着色剂作为指示剂的扩散型TTI，通过调节水杨酸甲酯和γ-内酯的配比即可改变指示器的临界温度，以适应不同使用需求，但混合指示剂的凝固需要在-80 ℃下进行，制作难度较大。谢新华等[7]在此基础上进行了改进，采用月桂酸乙酯、ε-己内酯和着色剂作为扩散指示剂，有效提高了指示精确度。
聚合型TTI是利用聚合单体发生聚合反应，生成有色固态聚合物，在反应过程中，颜色逐渐加深至可识别，指示时间-温度变化。最常见的是以丁二炔为指示剂的聚合型TTI，当外界环境温度变化时，指示剂激活，开始聚合反应，形成聚合物，指示区随着聚合反应的进行，颜色逐渐变深[8]。美国Lifelines公司的Fresh Check就是一款商业化的聚合型TTI，活性中心的无色双取代丁炔单体，随时间-温度变化发生聚合反应，生成聚合物而逐渐变黑[9]。Lee等[8]把4,4′-双(2-苯并鰁唑基)二苯乙烯引入到乙烯和降冰片烯中形成共聚物，温度升高至共聚物玻璃化转变温度（Tg）时，发生相分离，染料随即聚集变色。王斌等[10]研制的一种聚合型TTI，其反应活化能与军用食品的质变活化能相近，反应速度较慢，可用于指示保质期较长的食品效期。
酶型TTI实质是一种pH值指示器，通过酶促反应产生酸，致使整个体系的pH值变化，致使pH指示剂的颜色改变，且温度越高，体系反应速率越快，通过指示剂颜色变化即可判断产品的剩余效期[5, 11]。瑞典Vitsab公司的Vitsab Check Point就是一种基于酶促水解反应的TTI。冯钦等[12]研制出了以碘为指示剂，基于淀粉酶促反应的TTI。吴秋明[13]研制出了基于脲酶反应的TTI。宁鹏等[14]研制出了基于碱性脂肪酶的TTI。谷雪莲等[15]研制出了用于预测牛乳货架期的TTI。王琳等[16]研究了一种固定化糖化酶TTI，并将其应用于酸奶的质量监测。Kim等[17]还研究了一种基于漆酶的酶型TTI。
微生物型TTI的产酸原理则是基于无害细菌的新陈代谢，亦是由pH值的降低发生指示剂颜色变化。由于食品腐败主要由微生物的新陈代谢引起，因此，微生物型TTI就是模仿食物的变质过程，常用于指示食品效期，能够更加真实地反映食品的质量[18]。法国Cryolog公司的eO和TRACEO是典型的微生物型TTI，主要用于食品质量监测[12]，eO是一种比色标签，利用乳酸菌分解培养基中的碳源，产生乳酸致使pH值下降，致使指示剂变色的原理制成；TRACEO则是一种条形码标签，随时间-温度变化标签透明处逐渐变色至条形码被遮住，指示食品过期。常用于该类型TTI的微生物包括乳酸菌、弧菌、芽孢杆菌和清酒乳酸杆菌等[19]，闫文杰等[20]采用大肠杆菌、美蓝指示剂和液体培养基研制了一种微生物型TTI，用于食品在冷链流通过程中的质量监测。卢立新等[21]采用乳酸菌、甲基红和溴甲酚绿研制了一种低温TTI。张小栓等[22]采用副干酪乳杆菌、溴甲酚绿和肉汤培养基研制了一种用于指示鲜食葡萄品质的微生物型TTI。
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一些温度敏感型军队药品如疫苗、血清、注射液等，在运输和存储过程中对环境温度有着更加严格的要求。以疫苗类药品为例，其主要成分为灭活病毒、蛋白类或多糖类物质，从疫苗生产企业到疫苗接种现场之间的每一环节，都有可能因温度过高致使疫苗失效。为了保证疫苗在运输、储存过程中的安全，确保接种疫苗的有效性，可在疫苗标签上印刷或粘贴时间-温度指示标签，全程监控其质量稳定性[23]。
2007年，在日内瓦联合会议上，WHO和联合国儿童基金会（UNICEF）推荐所有成员国将时间-温度指示标签最大程度地用于疫苗管理。TTI技术现已得到各国政府大力支持，如印度明确要求政府采购的疫苗必须使用时间-温度指示标签，我国成都生产的乙脑疫苗也使用了时间-温度指示标签[24]。在卫生部和国家食品药品监督管理局印发的《疫苗储存和运输管理规范（2017年版）》中明确要求，对招标的疫苗制品加贴温度控制标签[25]。目前，美国TEMPTIME公司是唯一能符合WHO严格规程标准的时间-温度指示标签生产商，其研制的疫苗热标签 (vaccine vial monitor，VVM)广泛运用于各国疫苗的包装运输中。2010年，WHO发表了白皮书草案，即“对WHO资格预认证候选疫苗的计划适应性评估”，其中VVM被作为资格预认证的关键特性。
VVM是一款典型的聚合性时间-温度指示标签，利用经取代的丁二炔单体固态聚合反应，发生不可逆的颜色变化来指示时间-温度变化，颜色随聚合反应的进行由浅变深。如图1所示，指示器中间的方框是含有热敏性物质的活性部分，未激活前颜色很浅，随时间-温度的变化颜色不可逆的逐渐变深（从左至右），且温度越高颜色变得越快。当方框内颜色与圆环参照颜色一致时到达终点，指示药品至效期，疫苗不可用[26]。该过程可根据阿列纽斯聚合化学反应方程式（arrhenius equation）来实现。
图 1 疫苗瓶温度指示标签
$$ k = {A_0}{e^{ - \left( {\frac{{Ea}}{{RT}}} \right)}} $$ 式中，k: 变化数值；A0: 频率因子；e: 自然常数；Ea: 活化力(J/mol)；R: 通用气体常数(8.314 × 10−3 kJ/mol·K)；T: 绝对温度(K)
VVM系列包括VVM2、VVM7、VVM14和VVM30共4种类型，后缀数字代表了在37 ℃时指示效期终点所需的最高天数，几乎涵盖了不同热稳定性疫苗，如VVM2适用于热稳定性最敏感的口服脊髓灰质炎病毒活疫苗（OPV）[27]，而VVM30则适用于热稳定性最强的乙肝疫苗和破伤风疫苗[28]，具体参数详见表1。
表 1 不同温度条件下不同种类VVM的性能参数
种类 性能 到达指示终点所需时间 37 ℃（t/d） 25 ℃（t/d） 5 ℃（t/y） VVM30 高稳定性 30 193 >4 VVM14 中等稳定性 14 90 >3 VVM7 一般稳定性 7 45 >2 VVM2 最小稳定性 2 — 45/73 注：“—”表示未获得。 -
美国DeltaTRAK公司的WarmMark时间温度标签是一种扩散型时间-温度指示标签，用于指示药品所处环境温度是否高于适宜保存温度，并显示出高温存放情况持续的时间。如图2所示，当标签暴露于指示温度以上的环境时，垫片内的红色化学剂开始融化，并沿内管下流；当环境温度低于指示温度时，指示剂停止移动。
图 2 WarmMark时间温度标签
WarmMark根据指示温度的不同分为−18、0、5、8、10、20、25、30和37 ℃共9种类型，指示精确度在（标识温度±1）℃内，且温度记录不可逆。每张标签设计有3个显示窗口，用于指示响应暴露时间，具体参数详见表2。
表 2 不同种类WarmMark的性能参数
种类 指示温度 不同窗口变色时间 窗口1 窗口2 窗口3 51034 –18 ℃/0℉ 1 h±5 min （2.5±0.4）h (12±0.75) h 51013 0 ℃/32℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51014 5 ℃/41℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51022 8 ℃/46℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51017 10 ℃/50℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51018 20 ℃/68℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51035 25 ℃/77℉ (30±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51020 30 ℃/86℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51021 37 ℃/99℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 注：变色时间是指当标签暴露于指示温度2°以上环境时，标签各窗口完全变色所需时间。 WarmMark的可指示温度范围较广，显示的反应时间也更明确，适用于大部分对储运温度有明确要求的药品包装，如需阴凉条件下（不超过20 ℃）储存的注射液等，为不同军队温敏型药品的质量监控提供了更多选择。
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相对于长期暴露于高温环境中造成的药品效期缩短问题，短期暴露于极端温度环境中的药品质量安全同样不容忽视。美国TEMPTIME公司针对此类问题相继开发了一系列临界温度指示器，用于显示药品短期暴露于极端温度环境情况，包括FREEZEmarker冷冻指示器、LIMITmarker I过热立即反应指示器和LIMITmarker F延时高温指示器。
FREEZEmarker冷冻指示器用于显示药品是否曾暴露于冷冻环境中，以识别低温导致的药品变质、失效问题。如图3所示，当指示器所在环境温度高于指示温度时，可以看见绿色圆圈中的白色勾号；当暴露在低于指示温度的环境时，绿色圆圈将呈现白色不透明状。FREEZEmarker根据指示温度分为0、−1和−6 ℃ 3种类型，反应时间均在30 min内。
图 3 FREEZEmarker冷冻指示器
LIMITmarker I过热立即反应指示器（图4）和LIMITmarker F延时高温指示器（图5），均用于显示药品是否曾暴露于超高温环境中，以识别超高温导致的药品质量安全问题。两种指示器都是基于热熔性材料在指定温度下融化，产生颜色变化的原理。当暴露于高于指示温度的环境时，LIMITmarker I颜色从灰色变为黑色；LIMITmarker F颜色从无色变为红色。其中，LIMITmarker I根据指示温度分为40、44和50 ℃ 3种类型，反应立即发生，时间在15 s内；LIMITmarker F根据指示温度分为9、17.5、25和31 ℃共4种类型，反应时间均为2 h。
图 4 LIMITmarkerI过热立即反应指示器
图 5 LIMITmarker F延时高温指示器
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目前，酶型和微生物型TTI因反应时间较短，多用于指示食品效期，扩散型和聚合型TTI指示时间与药品效期较为接近，在药品效期判定方面更有优势，适用于不同种类温敏型军队药品的效期控制。军队药材保障是卫生勤务的重要组成部分，应符合卫生勤务保障规律。在温敏型军队药品外包装上加贴时间-温度指示标签，可通过标签上承载的效期信息，对温敏型军队药品在生产、流通、储存过程中各关键环节进行监控和管理，通过了解药品的温度暴露情况，区分失效药品与有效药品，掌握相应药品的保障情况，减少药品报废数量，及时进行调配和补给，实现温敏型军队药品的精准保障及质量安全问题的预警溯源。
Application of TTI in quality control of the military thermo-sensitive drugs
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摘要: 为保证温度敏感型军队药品的安全性和有效性，监控其从生产、运输、储存、分发到使用全过程的温度变化十分必要。通过对各类商业化时间-温度指示器（TTI）原理特性进行剖析，浅谈TTI技术在温敏型军队药品质控工作中的应用，为实现温敏型军队药品的精准保障及质量安全问题的预警溯源提供切实举措。Abstract: To ensure the safety and efficacy of the military thermo-sensitive drugs, it is necessary to monitor the temperature changes through the whole process of production, transportation, storage, distribution and application. The characteristics of various commercial TTI were analyzed. The applications of TTI technology in the quality control for military thermo-sensitive drugs were reviewed in order to provide accurate quality assurance for those drugs.
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水合氯醛，又称水合三氯乙醛，具有镇静、催眠、抗惊厥等作用，临床上以溶液口服或灌肠方式给药。但水合氯醛稳定性较差，临床使用制成溶液制剂有效期很短，其主要的杂质有三氯甲烷、甲酸、氯乙酸等，其中三氯甲烷是原料生产与储存过程中比较重要的降解杂质[1]。国内较多数的文献对水合氯醛及其制剂的稳定性研究采用滴定法或紫外法[2-3]，此方法准确度差，专属性不足，不能准确评估水合氯醛及其制剂的质量状况。目前，《中国药典》以及国外各国药典收载的水合氯醛及其制剂的质量标准中有关的检查方法专属性均较低[4-7]。
各国药典中鉴别、酸度、炽灼残渣与溶液澄清度是水合氯醛药物的基本理化分析项，醇合三氯乙醛则为控制本品合成过程中产生的一种杂质。水合氯醛在生产、运输过程中可能产生的降解杂质有甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等，现有的法定标准对此部分降解产物未进行控制，有关物质项存在缺失。本文旨在对主要降解产物进行定量检测，如甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸进行检测方法开发，其中，水合氯醛通过碳碳键断裂降解成等比例甲酸、三氯甲烷，检测甲酸或检测三氯甲烷均可。
三氯甲烷主要采用气相、气质色谱法[8-10]进行检查，氯乙酸等卤代羧酸可采用液相色谱法和离子色谱法[11-13]分析，水合氯醛专属性较强的检测方法为气相色谱法[10-14]。因卤代羧酸具有沸点高、强极性特点，不易气化，无法直接进样进行气相色谱分析，需进行衍生化处理，故本文将卤代羧酸检测方法与三氯甲烷检测方法分别开发建立。
1. 实验部分
1.1 仪器与试剂
Thermo trace 1300 GC（赛默飞气相色谱仪）；电子天平 ME-204E（梅特勒科技）；三氯甲烷 （北京通广试剂公司）；氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸（标准品，CATO）；正庚烷（fisher）；甲醇、硫酸、硫酸钠；水合氯醛（青岛宇龙海藻药业，批号20190403）。
1.2 色谱条件
色谱柱温：40 ℃保持3 min；以5 ℃/min的速度升至80 ℃，以20 ℃/min升至160 ℃，再以30 ℃/min升至250 ℃；进样口温度：150 ℃；检测器：ECD，温度280 ℃；色谱柱：DB-5.625 30 m×0.25 mm，0.25 μm；进样体积1 μl。
1.3 供试品与对照品溶液配制
分别确定水合氯醛检测三氯甲烷和卤代羧酸的样品处理方法，详见表1。
表 1 三氯甲烷与卤代羧酸检测样品前处理方法溶液名称 前处理1 前处理2 供试品溶液（测定卤代羧酸） / 称取水合氯醛约10 mg，置50 ml具塞试管中，精密加入甲醇2 ml，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入
20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得。卤代羧酸对照品溶液 / 分别称取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸适量，分别用甲醇配制成浓度为100 μg/ml的储备液，取1 ml置10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度即得；取上述溶液各1 ml，置50 ml具塞试管中，精密加入1 ml甲醇，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热
40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得各对照品溶液。供试品溶液（测定三氯甲烷） 称取水合氯醛约10 mg，置10 ml具塞试管中，加甲醇溶液完全，定容后过滤取续滤液即得。 称取水合氯醛约100 mg，置10 ml具塞试管中，加入饱和氯化钠溶液
0.35 ml，氯化钠0.5 g，正己烷5 ml，密塞，振摇提取，静置20 min，取正己烷层，取续滤液即得。三氯甲烷对照品溶液 称取三氯甲烷适量，甲醇溶解至
60 μg/ml即得。称取三氯甲烷适量，用正己烷配置成浓度为20 μg/ml的储备液；取1 ml置10 ml量瓶中，用正己烷定容至刻度即得。 2. 结果与讨论
2.1 卤代羧酸检测分析方法验证
2.1.1 系统适用性试验
按照图1方法，配制用于氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸检测的对照品溶液，并按照“1.2色谱条件”进样检测，结果如下。
对照品溶液浓度分别为氯乙酸 9.95 μg/ml，二氯乙酸 13.49 μg/ml，三氯乙酸9.45 μg/ml，连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的保留时间分别为4.33、5.89和7.38 min，各峰面积RSD分别为0.75%、1.00%、1.00%，满足系统适用性要求。衍生化转化目标物更容易被气化，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸经衍生化后分别以氯乙酸乙酯、二氯乙酸乙酯、三氯乙酸乙酯形式被检测。
2.1.2 线性关系考察
分别取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸对照品适量，加甲醇溶解稀释制成浓度为10 μg/ml的储备液，分别取储备液适量置具塞试管中，按照表1衍生化处理后，取正庚烷层，即得各自的工作曲线样品溶液，按照“1.2色谱条件”进样检测，以峰面积为纵坐标，相应卤代羧酸浓度为横坐标，进行线性回归。结果见表2，并按照信噪比大于3和大于10分别规定检测限和定量限。
表 2 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸线性试验结果样品名称 线性方程 回归系数 r 线性范围(μg/ml) 检测限(μg/ml) 定量限(μg/ml) 氯乙酸 Y=0.0042X+0.0002 0.9997 0.25~5 0.025 0.05 二氯乙酸 Y=0.1106X+0.005 0.9998 0.125~2.5 0.05 0.125 三氯乙酸 Y=0.32X+0.0164 0.9998 0.0625~2.5 0.01 0.0625 将上述信噪比满足定量限的各对照品溶液连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD为别为5.27%、1.94%、1.15%，显示各目标物的定量限浓度下检测精密度满足要求（RSD<15%）。
2.1.3 重复性试验
按表1前处理方法进行配制供试品溶液和对照品溶液，平行取6份供试品溶液，连续采集，记录并计算各供试品溶液中氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的含量，氯乙酸均未检出，二氯乙酸含量RSD为4.43%，三氯乙酸含量结果RSD为4.56%，按照本方法进行卤代羧酸含量检测，含量结果RSD均小于6%。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求[15]，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）重复性要求RSD小于6%。本方法重复性满足要求。
2.1.4 准确度试验
采用加样回收率进行方法准确度考察，精密称取10 mg水合氯醛原料药10份，分别置10个50 ml锥形瓶中，编号1~3加入混合对照品溶液1.2 ml，编号4~6加入混合对照品溶液1 ml，编号7~9加入混合对照品溶液0.8 ml，上述混合对照品溶液中，氯乙酸浓度为 9.95 μg/ml，二氯乙酸 浓度为13.49 μg/ml，三氯乙酸浓度为9.45 μg/ml，第10份不加混合对照品溶液，同步取样混合对照品1 ml置50 ml锥形瓶中，得到11份样品，按照表2衍生化处理，取正庚烷层进样检测，结果如表3。
表 3 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸准确度试验结果编号 原有量（m/mg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 1 10.23 3.00 3.00 3.00 3.14 2.88 3.11 104.5 95.45 95.82 2 10.17 3.00 3.00 3.00 2.72 2.85 2.99 90.64 94.35 91.75 3 9.97 3.00 3.00 3.00 2.61 2.70 3.35 86.99 89.44 103.7 4 10.00 2.50 2.50 2.50 2.46 2.38 2.51 98.25 94.44 91.13 5 9.95 2.50 2.50 2.50 2.13 2.44 2.50 85.09 96.70 90.44 6 10.08 2.50 2.50 2.50 2.52 2.35 2.48 100.9 93.22 89.86 7 10.11 2.00 2.00 2.00 1.71 1.89 2.03 85.53 93.40 89.49 8 9.88 2.00 2.00 2.00 1.82 1.86 2.05 91.01 91.88 90.83 9 10.01 2.00 2.00 2.00 1.78 1.88 2.09 88.82 92.87 92.85 按照本方法进行卤代羧酸含量检测准确度试验，回收率结果符合相关要求。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）回收率限度要求为80%~115%。本方法准确度满足要求。
2.1.5 稳定性试验
取“2.1.1”项下的各对照品溶液，分别于24 h内不同时间进样检测，结果显示氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD分别为4.0%、2.1%、1.6%，表明本方法样品溶液24 h内稳定性良好。
2.2 三氯甲烷检测方法学验证
2.2.1 专属性考察
分别按照表1中两种前处理方式配制对照品溶液、供试品溶液。前处理1测定色谱图见图2，前处理2测定色谱图见图3。在上述色谱条件下，两种前处理使用的正己烷和甲醇均不干扰三氯甲烷的测定，三氯甲烷保留时间约为2.5 min。
2.2.2 重复性与系统适用性试验
分别按照前处理1和前处理2方法制备6份供试品；另取三氯甲烷对照品适量，分别用甲醇溶解稀释至60 μg/ml；用正己烷溶解稀释至2 μg/ml。将以上供试品与对照品，按照“1.2 色谱条件”进样检测，结果见表4。
表 4 三氯甲烷检测方法重复性试验样品名称 前处理方法1 前处理方法2 峰面积 含量（%） 峰面积 含量（%） 对照品溶液 1.5129 / 0.2863 / 供试品1 0.7824 3.19 0.0608 0.00212 供试品2 1.4486 5.91 0.0616 0.00215 供试品3 1.6091 6.56 0.0596 0.00208 供试品4 0.6147 2.51 0.0582 0.00203 供试品5 0.8345 3.40 0.0653 0.00228 供试品6 1.0321 4.21 0.0679 0.00237 RSD（%） 37.46 5.89 因水合氯醛对热不稳定，熔点低57 ℃，在高温条件下碳碳键断裂产生三氯甲烷和甲酸，直接进样或顶空进样均可导致水合氯醛降解而使检测结果偏高，不能反映其实际三氯甲烷含量。而且依据ICH Q3C（R6）残留溶剂指导原则，三氯甲烷属于药品生产中应限制使用的溶剂（二类溶剂），其限度要求是60 ppm（即残留上限0.006%），结合本品原料药检测结果与重复性结果，前处理方法2检测结果准确真实。
连续进样5针正己烷配制的三氯甲烷对照品溶液，峰面积RSD为2.45%，表明本法的系统适用性试验结果良好。
2.2.3 线性与范围
精密称取三氯甲烷对照品，用正己烷溶解稀释至20 μg/ml，分别取其中0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 ml置10 ml量瓶，用正己烷稀释至刻度即得工作曲线样品，按照“1.2 色谱条件”进样，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程Y=0.1094X+0.0222, r =0.9998，表明三氯甲烷在浓度0.2408~3.011 μg/ml范围内线性良好。将三氯甲烷对照品溶液逐级稀释，得0.02、0.001 μg/ml进样分析，信噪比分别为14和4，分别为定量限和检测限。
2.2.4 三氯甲烷检测准确度试验
取水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2配制，平行9份，编号1~3加入0.6 ml对照品溶液，编号4~6加入对照品储备液0.5 ml，编号7~9加入对照品储备液0.6 ml，分别置10 ml离心管中，加入饱和氯化钠0.5 ml，氯化钠0.5 g，4.4 ml正己烷，振摇溶解，静置30 min，分别取正己烷层进样检测，结果见表5。
表 5 三氯甲烷检测准确度试验样品编号 加入量（m/μg） 检测值（m/μg） 本底值（m/μg） 回收率（%） 供试品1 1.2042 2.30 1.19 91.53 供试品2 1.2042 2.18 1.19 81.70 供试品3 1.2042 2.39 1.19 99.71 供试品4 10.79 11.77 1.81 92.32 供试品5 10.79 11.60 1.81 90.71 供试品6 10.79 11.79 1.81 92.46 供试品7 12.948 13.25 1.81 88.29 供试品8 12.948 12.81 1.81 84.94 供试品9 12.948 14.04 1.81 94.41 按照本方法进行三氯甲烷含量检测的准确度试验，回收率符合《中国药典》相关要求。
2.2.5 三氯甲烷检测溶液稳定性
取三氯甲烷对照品、水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2进行配制对照品溶液、供试品溶液，按“1.2色谱条件”进样检测，考察24 h内不同时间样品的稳定性，结果显示供试品与对照品稳定性均小于5.0%，稳定性良好。
2.3 水合氯醛稳定性试验
水合氯醛具有较强的挥发性与引湿性，在高温条件下挥发与降解性能均增强，结合《中国药典》2020年版药品稳定性试验技术要求，对本品进行影响因素试验与加速试验考察。将水合氯醛置样品瓶（封口）中，分别置温度25 ℃/湿度75%，温度40 ℃/湿度75%，温度60 ℃/湿度60%以及温度25 ℃/湿度60%、光照强度4500 lx条件下考察，并于不同时间点检测杂质含量变化，结果见表6。
表 6 水合氯醛稳定性试验结果放置条件 时间（t/d） 检测结果（%） 三氯乙酸 二氯乙酸 三氯甲烷 氯乙酸 温度25 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.004 未检出 30 0.001 0.003 0.004 未检出 温度40 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.152 未检出 30 0.001 0.003 0.323 未检出 温度60 ℃/湿度60% 10 0.001 0.004 0.546 未检出 30 0.001 0.004 0.871 未检出 温度25 ℃/湿度60%、
光照强度4500 lx10 0.001 0.003 0.045 未检出 30 0.001 0.003 0.151 未检出 以上数据显示，水合氯醛原料受温度和光照影响较大，主要的降解产物为碳碳键断裂的水解产物三氯甲烷，卤代羧酸未有明显的改变。三氯甲烷是主要的降解产物，其中三氯甲烷为二类毒性溶剂，但目前水合氯醛的国内外法定标准中均无三氯甲烷的含量检测和限度要求，且水合氯醛本身具有较大的毒性，则其降解产物的限度仍需结合长期稳定性结果和临床使用的安全性、有效性进行综合评估。另本次试验采用称量瓶封口存放，密封性不佳，会加速水合氯醛的挥发水解，本品应室温避光密封保存；在制剂研发和存储运输过程中，应严格控制温度与光照影响。
3. 结论
本文建立了气相色谱法测定水合氯醛原料药中杂质三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。利用检测目标物的理化性质，采用不同前处理方法进行三氯甲烷、卤代羧酸的检测，色谱峰形良好，方法简单、准确度高、重复性良好，可避免水合氯醛检测过程中的自身降解，准确高效的检测药物中杂质含量，满足目前市售原料及其制剂的检测需求。
本法中，三氯甲烷检测限浓度为供试品浓度的万分之0.005（0.5 ppm）；氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.1（10 ppm）；二氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.2（20 ppm）；三氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.04（4 ppm）。本品多次检测以及稳定性试验中均未出现氯乙酸，说明本品中确无高于检出限的残留，也不易降解产生。
通过水合氯醛的稳定性实验发现，本品在温度、光照条件下均会发生降解，三氯甲烷为主要的降解产物，故进行本品相关制剂的研发、检测、生产和运输过程中需要严格控制生产工艺与储存条件，保证产品的质量稳定，保障用药安全性。
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表 1 不同温度条件下不同种类VVM的性能参数
种类 性能 到达指示终点所需时间 37 ℃（t/d） 25 ℃（t/d） 5 ℃（t/y） VVM30 高稳定性 30 193 >4 VVM14 中等稳定性 14 90 >3 VVM7 一般稳定性 7 45 >2 VVM2 最小稳定性 2 — 45/73 注：“—”表示未获得。 
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表 2 不同种类WarmMark的性能参数
种类 指示温度 不同窗口变色时间 窗口1 窗口2 窗口3 51034 –18 ℃/0℉ 1 h±5 min （2.5±0.4）h (12±0.75) h 51013 0 ℃/32℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51014 5 ℃/41℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51022 8 ℃/46℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51017 10 ℃/50℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51018 20 ℃/68℉ (2±0.4) h (12±1) h (48±2) h 51035 25 ℃/77℉ (30±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51020 30 ℃/86℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 51021 37 ℃/99℉ (20±5) min (2±0.4) h (8±0.75) h 注：变色时间是指当标签暴露于指示温度2°以上环境时，标签各窗口完全变色所需时间。
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