下载:
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炎症泛指机体受到创伤或病原体感染等刺激后所产生的生理反应，主要表现为疼痛、红肿、发热等[1]。通常情况下，机体受到创伤等刺激后，所产生的炎症反应是一种生理性保护反应，有益于机体损伤的修复[2-3]，但当机体内的抗炎系统过于活跃时，会引起自身免疫系统紊乱，对机体正常的细胞及组织进行攻击，如系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等免疫疾病[4]。目前，临床上常用的抗炎药物主要分为甾体类抗炎药（SAIDs）、非甾体类抗炎药（NSAIDs）及免疫调节药，但这几类药物多具有副作用[5-7]，因此，新型抗炎药物的研发具有极高的科研前景和社会价值。豆豉姜是樟科植物山鸡椒Litsea cubeba（Lour.）Pers的根及根茎，被傣医学及中医作为广泛的民间方剂，多用于祛风散寒、息肝风、消肿、治风湿痹痛的治疗。前期课题组提取分离得到新型的二苄基丁烷型木脂素9,9’-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5’-二甲氧基开环异落叶松树脂酚（LCA）化学结构如图1所示，并发现其具有改善类弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型中炎性症状的疗效[8]，因此，课题组推测LCA是豆豉姜中具有抗炎活性的天然化合物，故采用小鼠耳肿胀和棉球肉芽肿模型及RAW264.7细胞实验，对其抗炎作用进行研究。
图 1 LCA化学结构
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二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验模型：5周龄SPF级雄性昆明小鼠，体重：（20±2）g；大鼠棉球肉芽肿实验：4周龄SPF级雄性SD大鼠，体重：（120±10）g。动物由海军军医大学实验动物中心提供，并饲养于海军军医大学药学院动物房，室温控制为24 ℃，12 h光照+12 h黑暗，水及食物充足供应。RAW264.7（海军军医大学药学院生药学教研室）。
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LCA（海军军医大学药学系有机化学教研室合成及鉴定）；吲哚美辛（海军军医大学附属长海医院）；二甲苯、水合氯醛、羧甲基纤维素钠CMC-Na、对氨基苯磺酸、磷酸、N-α-萘乙二胺（中国医药集团）；棉球（中国朝阳公司）；ELISA试剂盒（中国联科公司）；iNOS、COX-2、GAPDH抗体及二抗（CST，USA）。分析天平（MettlerToledo，USA）；CO2恒温细胞培养箱（Sanyo，Japan）；ELx 800酶标仪（Fisher，US）；凝胶成像仪（Tanon-5200 multi，中国上海）。
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小鼠耳廓肿胀模型建立：将60只5周龄健康雄性昆明鼠安置于动物实验中心适应1周，按体重随机分为4组，各10只，组别标记为：模型组；LCA组（20、40 mg/kg）；吲哚美辛组（8 mg/kg）。给药以灌胃的形式每日一次，模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续3 d灌胃，在末次给药1 h后，将二甲苯以0.05 ml/只剂量均匀涂布于小鼠右耳廓的双面，左耳不做处理，连续刺激45 min后处死小鼠，用打孔器分别于左右耳廓同一位置打下圆形耳片[9]，称重，用于计算比较耳肿胀程度及耳肿胀抑制率（%）。
大鼠棉球肉芽肿模型建立：将20只4周龄健康雄性SD大鼠安置于动物实验中心适应1周，按体重随机分为4组：模型组；LCA组（20、40 mg/kg）；吲哚美辛组（5 mg/kg）。用水合氯醛对大鼠进行麻醉，于左右两边腋窝下切开一小口，将2个灭菌棉球（20 mg）分别植入小鼠左右腋窝，缝合后第2天给药。且以灌胃的形式每日一次，模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续7 d[10-11]。第8天处死大鼠，将腋下棉球及附着的肉芽组织剥离，称重，用于计算比较干湿重及抑制率。
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耳肿胀度=右耳片重量－左耳片重量
耳肿胀抑制率（%）=（模型组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度）/模型组平均耳肿胀度×100%
平均棉球肉芽肿重量=（右侧棉球肉芽肿重量+左侧棉球肉芽肿重量）/2
棉球肉芽肿抑制率（%）=（模型组平均棉球肉芽肿重量－给药组平均棉球肉芽肿重量）/模型组平均棉球肉芽肿重量×100%
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RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞）用DMEM高糖完全培养基（10% DMEM+90% FBS+1%双抗）培养于37 ℃恒温细胞培养箱中。
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将RAW264.7细胞以1×103个/孔接种于96孔板，完全培养基培养24 h，弃上清液，给予不同浓度的LCA培养液（3、1.5、0.75和0.375 μmol/L），并设置空白对照组，每组5个复孔，培养24 h，采用MTT法测定LCA对小鼠单核巨噬细胞的增殖作用。
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将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于24孔板，24 h后弃上清液，脂多糖（LPS）组和LCA组中加入1 ml含2 μg/ml LPS的完全培养基，刺激2 h，于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基，给药组加入各浓度LCA（1.5、0.75和0.375 μmol/L）的完全培养基，作用24 h后，测NO含量：取100 μl上清液与100 μl Griess试剂（A液：对氨基苯磺酸0.1 g，加5%磷酸10ml；B液：N-α-萘乙二胺0.01 g，加10ml蒸馏水，等体积混合）混合避光显色30 min，用酶标仪于540 nm处测各孔吸光度（A）值；测TNF-α：取上清液，根据ELISA试剂盒说明书步骤测量上清液中炎症因子TNF-α的含量。
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将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于6孔板，细胞贴壁后，处理组（LPS组、LCA组）中加入1ml含2 μg/ml LPS的完全培养基，刺激2 h，于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基，给药组加入各浓度LCA（1.5、0.75和0.375 μmol/L）的完全培养基，作用24 h后，细胞裂解提取蛋白并定量，蛋白变性后SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转膜，封闭，依次用iNOS，COX-2及GAPDH于4 ℃孵育过夜，用洗膜液（TBST）清洗3次后，二抗室温孵育1 h，TBST洗涤后，用化学发光试剂盒于凝胶成像仪中显影拍片。
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本实验指标均为定量数据，数据以（
$\bar{x}\pm s$ ）形式表示。多组定量数据的比较，采用单因素方差分析，方差分析检验后两两比较采用Dunnett's t-test法。采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析。结果以P<0.05、P<0.01表示差异具有统计学意义。 -
如表1所示，与模型组对比，吲哚美辛（8 mg/kg）可抑制由二甲苯造成的小鼠耳廓肿胀（P<0.05），抑制率为29.80%；LCA（40 mg/kg）组显著抑制小鼠耳廓肿胀度（P<0.01），抑制率为37.41%，而LCA（20 mg/kg）组对小鼠耳廓肿胀度的抑制无统计学意义（P>0.05）。
表 1 LCA对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n=10，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 肿胀度（m/mg） 抑制率（%） 模型组 3.02±0.63 — LCA组（20 mg/kg） 2.52±0.29 16.56 LCA组（40 mg/kg） 1.89±0.54** 37.41 吲哚美辛组（8 mg/kg） 2.12±0.61* 29.80 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。 -
如图2，模型组大鼠棉球肉芽肿体积较大且颜色鲜红，吲哚美辛组的棉球肉芽肿体积小且颜色浅，而LCA组的棉球肉芽肿在色泽和大小上均有别于模型组。数据分析显示（表2、表3），与模型组相比，阳性药组吲哚美辛明显抑制大鼠的棉球肉芽肿（P<0.001），且干重、湿重的抑制率分别为48.73%和44.19%；LCA高剂量组也可明显减少棉球肉芽肿的干重及湿重（P<0.01），且抑制率达到23.89%和29.90%。
图 2 各组大鼠棉球肉芽肿对比
表 2 LCA对大鼠棉球肉芽肿湿重的影响(n=5，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿湿重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 300.1±53.26 — LCA组（20 mg/kg） 256.0±36.36 14.70 LCA组（40 mg/kg） 228.4±51.16*** 23.89 吲哚美辛组（5 mg/kg） 167.5±15.74*** 44.19 ***P<0.001，与模型组比较。 表 3 LCA对大鼠棉球肉芽肿干重的影响(n=5，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿干重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 48.1±10.05 — LCA组（20 mg/kg） 42.32±10.19 12.05 LCA组（40 mg/kg） 33.73±7.10** 29.90 吲哚美辛组（5 mg/kg） 24.67±7.39*** 48.73 **P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。 -
如图3所示，LCA的安全剂量不高于3 μmol/ml，且在0.75和1.5 μmol/ml浓度下显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α浓度，差异均具有统计学意义（P<0.01）。
图 3 LCA对LPS刺激RAW264.7细胞增殖、NO和TNF-α分泌量的影响(n=5，
$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ ) -
如图4所示，LCA在1.5 μmol/ml浓度下显著抑制了炎症相关蛋白iNOS、COX-2蛋白的表达（P<0.001）。
图 4 LCA对炎症相关蛋白表达的作用(n=3，
$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ ) -
据报道[12]，许多从中药中提取的活性天然化合物可以达到抗炎效果，包括黄芩苷、青藤碱和大黄素等，多为甘草次酸酰胺类衍生物。LCA不同于这些抗炎药物，它具有新颖的二苄基丁烷型结构，本研究从体内、体外两方面对它进行较为系统的抗炎药效评价。
二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型是评价药物体内抗炎活性的急性炎症模型之一[13]，本实验模型组中二甲苯作为致炎剂刺激小鼠耳廓皮肤，促进血管舒张、增加血管通透性致使炎性物质渗出，耳片重量明显高于未经处理的耳片重量，LCA组能明显改善小鼠耳部的炎性渗出及肿胀程度，且高浓度组的抑制率高于阳性药吲哚美辛组（由于吲哚美辛高浓度有强烈的胃肠道反应，故根据临床用药剂量换算出实验动物的剂量，并参考相关文献确定用药量[13]，即8 mg/kg），表明LCA对急性炎症有显著作用。在慢性炎症期，由于巨噬细胞和纤维母细胞等增生而形成肉芽组织，棉球肉芽肿实验可模拟炎症病理过程中炎性细胞浸润和肉芽组织的增生[14]。结果显示LCA降低棉球肉芽肿的湿重与干重，表明LCA可以控制慢性炎症过程中炎性渗出物的转移，同时抑制棉球外侧小血管和结缔组织的增生，证明LCA可以减少慢性炎症进程中肉芽组织的形成。结合上述两个动物实验可知LCA对急性炎症以及慢性炎症都具有一定的抑制作用。
炎症的普遍特征是病灶区域有大量炎症细胞的浸润，并释放大量炎症因子和介质，如IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素（PG）、组织胺和NO等。其中，NO可激活NF-κB信号通路，诱导促炎因子（IL-6、TNF-α等）的分泌，引起机体组织损伤以及血管扩张；TNF-α可刺激细胞免疫中T细胞产生炎症因子，进而诱导炎症的加重和扩大。iNOS可介导产生的大量NO并参与炎症反应；COX-2介导产生的前列腺素与慢性炎症的发展和持续有关，致使白细胞聚集和浸润，引起微血管内皮细胞的损伤。在本研究中，LPS刺激后，RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α含量，以及细胞内iNOS和COX-2蛋白水平明显增高，LCA浓度为1.5 μmol/ml时显著抑制激活状态下NO和TNF-α炎症介质的分泌，同时下调iNOS及COX-2蛋白的表达水平。由此进一步证实LCA具有抗炎作用。然而，LCA抗炎的具体作用机制尚不明确，有待今后进行更深层次的研究探讨。
豆豉姜活性成分9,9’-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5’-二甲氧基开环异落叶松树脂酚（LCA）抗炎作用研究
doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912159
Anti-inflammatory study on 9,9'-O-di-(E）-feruloyl-meso-5,5'-dimethoxysecoisolariciresinol (LCA), an active ingredient in Litsea cubeba (Lour.) Pers
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摘要:
目的 对傣药豆豉姜活性成分LCA在动物及细胞水平上的抗炎作用进行评价。 方法 采用耳肿胀和棉球肉芽肿模型进行LCA抗炎的体内药效学评价。采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），通过检测其一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）蛋白的表达水平，以评价LCA的体外抗炎活性。 结果 在小鼠耳肿胀的实验中，LCA组的耳肿胀度明显低于模型组，且高浓度组对小鼠耳肿胀的抑制率高于阳性药组；在大鼠棉球肉芽肿实验中，LCA高剂量组显著减轻了棉球肉芽肿的湿重与干重。此外，LCA显著减少LPS诱导的RAW264.7细胞中NO、TNF-α的分泌，降低iNOS、COX-2蛋白的表达。 结论 LCA具有显著的体内外抗炎作用，值得进一步深入研究。 -
关键词:
- LCA /
- 抗炎 /
- 耳肿胀 /
- 肉芽肿 /
- RAW264.7细胞
Abstract:Objective To evaluate the anti-inflammatory effects of LCA, which is the active component from Litsea cubeba (Lour.) Pers. Methods Pharmacodynamic evaluations of ear swelling and cotton ball granuloma models were used in animal experiments. In vitro experiment, lipopolysaccharide (LPS) stimulated monocyte macrophage RAW264.7 cells were used to evaluate the anti-inflammatory activity of LCA by detecting the secretions of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α), the expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) protein. Results In ear swelling experiment, the extent of ear swelling was significantly lower in the LCA treated group than the model group. The inhibition rate was greater in the high LCA concentration group than the positive drug group. In addition, LCA reduced the weight of cotton ball granuloma markedly. At the cell level, LCA significantly inhibited the secretions of NO, TNF-α and reduced the expressions of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Conclusion LCA has significant anti-inflammatory effects in vitro and in vivo. The further studies are warranted for the development of anti-inflammatory drugs. -
Key words:
- LCA /
- anti-inflammatory /
- ear swelling /
- granuloma of cotton ball /
- RAW264.7 cell
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侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis）是院内血液感染的第四大原因[1]。由于各类疾病导致的免疫力低下病人增多，光滑念珠菌（Candida glabrata）的感染率逐年递增，引起败血症的数量也随之增加。除白念珠菌外，光滑念珠菌已成为部分国家和地区侵袭性感染中第二常见的念珠菌种类[2]。光滑念珠菌是一种条件致病菌，它广泛存在于自然界，也在人体皮肤黏膜、消化道寄生。当人体免疫功能降低或皮肤黏膜环境发生改变时，光滑念珠菌即可大量繁殖，引起深部脏器感染。与其他念珠菌相比，光滑念珠菌对于抗真菌药物显著耐受[3]，它可以在抗真菌治疗过程中迅速产生耐药性，最终导致治疗失败[4-5]。我国侵袭性真菌耐药监测网（CHIF-NET）2020年统计结果显示，临床常用抗真菌药物氟康唑和伏立康唑对光滑念珠菌的最低抑菌浓度（MIC90）分别32 μg/ml和1 μg/ml。目前治疗光滑念珠菌的药物主要包括广谱三唑类、棘白菌素类以及多烯类抗真菌药。本文对光滑念珠菌的耐药机制进行综述。
1. 对唑类药物的耐药机制
1.1 麦角甾醇合成通路中基因改变
针对念珠菌属使用最广泛的药物当属唑类抗真菌药物。唑类药物通过作用14ɑ-去甲基化酶系统中的细胞色素P450，使环上氮原子与P450的血红素铁结合，阻碍麦角甾醇生物合成，同时致使其合成前体24-甲烯二氢羊毛甾醇累积，从而使念珠菌细胞膜损伤。麦角甾醇是保证念珠菌细胞膜稳定和流动性的重要成分，而ERG11编码的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶作为关键酶，催化羊毛甾醇生成麦角甾醇。唑类药物通过结合14ɑ-去甲基化酶，阻碍催化过程，而麦角甾醇不足最终导致细胞膜结构改变，念珠菌增殖减少。
1.1.1 ERG11基因突变
ERG11基因突变导致唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的结构发生变化，其与唑类药物的结合位点消失，无法结合，从而产生耐药性。Hull等[6]在临床耐药分离株中发现ERG11基因G315D突变位点，这导致菌株对唑类药物敏感性降低。Zhang等[7]在念珠菌血流分离株中发现6株光滑念珠菌耐药株，并在其中2株中检测到ERG11基因I166S突变位点，其他4株耐药株并未出现ERG11基因的突变，但仍能产生耐药。由此推测，ERG11基因突变或许不能作为光滑念珠菌耐药的主要原因。
1.1.2 ERG11基因高表达
ERG11基因高表达导致唑类药物的靶酶生成增加，药物无法完全抑制靶酶活性。Upc2A和Rpn4是光滑念珠菌ERG11表达的关键调节因子，RPN4与UPC2A的基因突变是ERG11高表达的主要原因[8-9]。Wang等[10]研究2株耐药分离株，其中1株的CDR1和ERG11高表达，而另1株只有CDR1高表达，尽管验证ERG11高表达确实会导致光滑念珠菌产生耐药，但由于耐药株均存在CDR1高表达，因而ERG11高表达不能作为光滑念珠菌耐药的唯一原因。
1.1.3 AUS1基因高表达
当麦角甾醇生物合成在缺氧或由于甾醇合成缺陷而受到抑制时，甾醇流入转运蛋白基因（AUS1和TIR3）和麦角甾醇生物合成通路中相关基因（ERG2、ERG3、ERG6等）在真菌细胞中表达明显上调。在低氧条件或唑类作用下，细胞中的AUS1表达增加，通过输入外源性胆固醇和麦角甾醇，可使光滑念珠菌得以存活[11]。
1.2 药物外排增强
与其他念珠菌不同，光滑念珠菌细胞膜上与耐药性相关的外排泵主要是ABC转运蛋白家族（由念珠菌耐药性CDR1、CDR2、SNQ2基因编码），这类外排泵通过水解ATP获得能量，并通过细胞膜主动外排药物。
1.2.1 ABC转运蛋白家族表达增加
CDR1、CDR2及SNQ2基因高表达导致光滑念珠菌内药物被快速排出，从而对唑类药物产生耐药性。Zhang等[6]在念珠菌血流分离株中发现，光滑念珠菌耐药分离株的CDR1、CDR2基因表达显著增加。Wang等[10]研究两株耐药分离株，发现CDR1基因均高表达。有研究发现[12]，CDR1、CDR2在16种耐药分离株中分别有12及8株高表达，且其中有4株耐药株CDR1、CDR2同时高表达；而有8株耐药株SNQ2表达仅相对升高，这可能说明SNQ2没有单独表达或并非主要外排泵，表明这些ABC转运蛋白之间可能存在相互作用。
1.2.2 PDR1基因突变
PDR1是ABC转运蛋白家族的上游调节基因。研究发现，Pdr1和Pdr3是酿酒酵母中两种密切相关的蛋白同系物，作用与光滑念珠菌中的Pdr1相似。Yao[13]等在耐药菌株中发现PDR1中的新错义突变位点A848V。Khakhina [14]等发现光滑念珠菌PDR1的作用是酿酒酵母PDR1和PDR3自调节转录作用的结合，PDR1自调节在光滑念珠菌耐药性产生中起重要作用。PDR1基因的功能获得性突变（GOF），会导致CDR1表达上调。Hou[15]等对PDR1多态性进行研究，发现唑类耐药分离株的PDR1多态性比率（14个中的13个，92.9%）明显高于唑类敏感分离株（144个中的28个，19.4%）。
1.3 DNA错配修复系统缺陷
真菌耐药性产生大多缘于基因突变。DNA错配修复（MMR）系统纠正DNA聚合酶在DNA复制过程中产生的错误，以及修复由环境因素或内源性因素引起的DNA损伤。MSH2为该修复系统的关键基因之一。
Healey[16]等发现有55%携带MSH2功能丧失的突变（LOF），导致体外和体内抗真菌药物耐药性的加速出现，这些突变在氟康唑处理后更为常见。但也有研究表明MSH2序列与氟康唑耐药性或基因型增加之间无明确关联，在这些研究中MSH2被认为是光滑念珠菌的管家基因，即该基因的多态性可能与遗传复合物的差异有关，而与抗真菌药物耐药性不直接相关[15,17]。尽管如此，不能否认MSH2功能丧失的突变引起错误的不匹配修复，进而参与真菌耐药性的发展，其相关性仍有待进一步研究。
2. 对棘白菌素类药物的耐药机制
β-葡聚糖是念珠菌细胞壁的基本成分，棘白菌素类药物通过抑制β-1,3-葡聚糖的合成，对念珠菌属发挥杀真菌活性。
多项研究表明，FKS基因突变导致其结合位点改变是棘白菌素耐药性产生的主要原因。Wang[10]等研究2株耐药分离株，对FKS测序显示，2种分离株在FKS2中都含有S663P突变且存在4个单核苷酸多态性（SNP），而FKS1则无突变。同时，FKS1和FKS2的表达均上调。Al-Baqsami[18]等在5种耐米卡芬净的分离株中，发现4株分离株FKS2含有非同义（S663P）突变，1株分离株含有FKS2热点-1（HS1）中的三核苷酸缺失（对应于F659；ΔF659）。Pham[19]等在1037株耐棘白菌素光滑念珠菌中进行FKS测序，检测出47株具有FKS突变。其中，检测出12种独特的突变：FKS1中的5种（15株）和FKS2中的7种（35株）。所有突变都发生在HS1中，没有检测到HS2突变。通过以上研究结果，可推测影响光滑念珠菌对棘白菌素易感性的大多数突变位于FKS1 HS1和FKS2 HS1区域，且FKS2的突变多于FKS1。
3. 对多烯类药物的耐药机制
多烯类药物是广泛运用于临床的抗真菌感染的广谱抗菌药。两性霉素B是多烯类的代表药物，通过结合念珠菌细胞膜上的麦角甾醇，形成孔道，以改变念珠菌细胞膜通透性从而使念珠菌死亡。
3.1 自身合成替代甾醇
真菌能够自身合成甾醇中间体完成代谢，但麦角甾醇缺乏，导致两性霉素B无作用靶点。Hull等[6]在多种临床耐药分离株中发现CG156分离株内仅可检测到14α-甲基化甾醇中间体这一种甾醇，即这种分离株内缺乏麦角甾醇，但该耐药株仍可以在没有外源性供应甾醇的情况下，用14α-甲基化甾醇中间体合成细胞所需的甾醇。
3.2 麦角甾醇生物合成基因突变
由ERG6中密码子Tyr192、Trp286或Leu341无义突变导致Erg6蛋白的过早终止；由ERG2中含有的G122S和G119S无义突变导致Erg2蛋白功能受损，最终均导致突变株细胞膜缺乏麦角甾醇，进而破坏细胞膜通透性和流动性[20-23]。
4. 小结
综上所述，光滑念珠菌作为临床上较为重要的致病菌之一，由于抗真菌药物种类有限，临床应用重复率高，导致的耐药问题日益严重。因此，一方面需要临床合理用药、联合用药，尽量避免耐药性的产生；另一方面，需要研发新型抗真菌药物。有研究表明[24-28]，阿魏酸与卡泊芬净，薄荷醇、百里酚、替加环素、绒毛钩藤不溶性成分与唑类药物的协同作用，通过损伤念珠菌生物被膜等方式，可以有效降低唑类耐药菌的MIC。也有研究开辟新的思路，寻找新的药物靶点：合成的铋纳米颗粒可以潜在地用于改善氧化应激和各种微生物感染，对念珠菌病病例有强大抗真菌能力[29]；4种双鸟胍衍生物（BG1-BG4）对光滑念珠菌和白念珠菌的MIC在2~15.6 μg/ml之间，其中BG3作用于DNA，扰乱复制转录过程，导致在细胞质膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露，半胱氨酸蛋白酶活化，促进真菌细胞凋亡[30]。药物研发和探索是漫长的过程，需要一代代人的验证和实践，但可以预见，在不久的将来，这些药物最终会有一部分应用于临床实践中，为缓解临床耐药问题提供新的选择。
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图 3 LCA对LPS刺激RAW264.7细胞增殖、NO和TNF-α分泌量的影响(n=5，
$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ )A. 细胞增殖率；B.NO浓度；C. TNF-α浓度；** P <0.01，*** P <0.001，与LPS组比较；## P <0.01，### P <0.001，与空白组比较。
图 4 LCA对炎症相关蛋白表达的作用(n=3，
$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ )A. Western blotting检测iNOS、COX-2蛋白的表达水平；B. iNOS/GAPDH比值；COX-2/GAPDH比值；*P<0.05，***P<0.001，与LPS组比较；##P<0.01，###P<0.001，与空白组比较。
表 1 LCA对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n=10，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 肿胀度（m/mg） 抑制率（%） 模型组 3.02±0.63 — LCA组（20 mg/kg） 2.52±0.29 16.56 LCA组（40 mg/kg） 1.89±0.54** 37.41 吲哚美辛组（8 mg/kg） 2.12±0.61* 29.80 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。 
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表 2 LCA对大鼠棉球肉芽肿湿重的影响(n=5，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿湿重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 300.1±53.26 — LCA组（20 mg/kg） 256.0±36.36 14.70 LCA组（40 mg/kg） 228.4±51.16*** 23.89 吲哚美辛组（5 mg/kg） 167.5±15.74*** 44.19 ***P<0.001，与模型组比较。
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表 3 LCA对大鼠棉球肉芽肿干重的影响(n=5，
$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿干重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 48.1±10.05 — LCA组（20 mg/kg） 42.32±10.19 12.05 LCA组（40 mg/kg） 33.73±7.10** 29.90 吲哚美辛组（5 mg/kg） 24.67±7.39*** 48.73 **P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。
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