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防暑清热饮是由广藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等药材配伍而成的中药复方制剂。方中广藿香为君药,白茅根、菊花为臣药,薄荷为佐药,枸杞为使药,诸药合用,具有芳香化湿、清热解毒、解渴生津之功效[1]。课题组前期已采用紫外分光光度法对防暑清热饮中总多糖和总黄酮进行质量控制[2]。为了更为全面地控制防暑清热饮的质量,本实验参考现有文献[3-16],采取RP-HPLC法同时测定方中多个活性成分含量,现报道如下。
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色谱柱ZORBAX-SB-C18 (250 mm ×4.6 mm,5 μm),流动相为0.2%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱0~30 min,88%~82%A;30~45 min,82%~78%A;45~65 min,78%~35%A;65~75 min,35%A;75~78 min,35%~30%A;78~80 min,30%~88%A;80~82 min,88%A;流速为1.0 ml/min,检测波长为327 nm,柱温为30 ℃,进样量20 μl,理论塔板数按3,5-O-二咖啡酰奎宁酸计算应不低于8 000。
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分别精密称定绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量,置于同一10 ml容量瓶中,加甲醇溶解并定量稀释成每1 ml中含绿原酸2.15 mg、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷1.05 mg、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸3.00 mg。分别精密称定蒙花苷和广藿香酮对照品适量置于同一25 ml容量瓶中,加甲醇溶解并定量稀释成每1 ml中含蒙花苷0.21 mg和广藿香酮0.05 mg,作为对照品储备液。精密量取各对照品储备液5 ml,置同一25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得混合对照品母液。
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精密量取防暑清热饮5 ml,置10 ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
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按处方量制备不含广藿香、白茅根、菊花和薄荷的阴性样品,按“2.2.2”项下供试品方法制备阴性对照溶液。
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分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液,按“2.1”项下色谱条件下进样,记录色谱图。结果阴性溶液无干扰,方法专属性良好,见图1。
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分别精密吸取对照品母液按比例稀释,在上述色谱条件下,分别进样20 μl,以质量浓度X(μg/ml)为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程,见表1。
表 1 回归方程及线性范围
化合物名称 回归方程 r 线性范围(μg/ml) 绿原酸 Y=13.496X-63.194 0.999 9 43.00~430.00 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 Y=19.707X-169.310 0.999 7 21.00~210.00 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 Y=4.659X-0.895 0.999 7 60.00~600.00 蒙花苷 Y=6.5862X+6.154 0.999 6 4.20~42.00 广藿香酮 Y=11.788X+2.109 0.999 6 1.02~10.20 -
取混合对照品溶液,连续进样6次,记录色谱峰面积,绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.29%、0.30%、0.32%、0.45%、0.45%,表明仪器精密度良好。
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按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份(批号:20200120),并按“2.1”项下色谱条件进行含量测定。结果显示,防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.56%、0.68%、0.70%、0.94%、1.75%,表明方法重复性良好。
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将供试品溶液在室温下放置,分别于0、2、4、8、12、24 h进样20 μl,记录色谱峰面积,结果显示,防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、广藿香酮峰面积的RSD分别为0.64%、1.16%、0.71%、0.59%、1.36%,结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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精密量取已知含量的防暑清热饮2.5 ml,共6份,置10 ml容量瓶中,再分别精密加入对照品适量,加水稀释至刻度,按“2.1”项下色谱条件操作,进样20 μl,记录峰面积,测定其含量,计算平均加样回收率,结果见表2。
表 2 防暑清热饮加样回收率试验结果(n=6)
成分 样品含量(m/μg) 加入量(m/μg) 测得量(m/μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 绿原酸 369.44 376.00 745.10 99.91 102.03 1.63 369.44 376.00 748.25 100.75 369.44 376.00 756.12 102.84 369.44 376.00 749.80 101.16 369.44 376.00 764.27 105.01 369.44 376.00 754.89 102.51 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 209.79 210.00 425.37 102.65 102.38 1.51 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 425.15 102.55 209.79 210.00 419.79 100.00 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 421.50 100.81 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 452.68 484.00 939.25 100.53 102.39 1.23 452.68 484.00 947.23 102.18 452.68 484.00 956.31 104.06 452.68 484.00 942.56 101.22 452.68 484.00 949.64 102.68 452.68 484.00 954.57 103.70 蒙花苷 42.88 42.00 85.58 101.67 103.14 1.87 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 87.42 106.05 42.88 42.00 87.13 105.37 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 86.21 103.16 广藿香酮 7.91 8.20 16.10 99.86 104.01 2.33 7.91 8.20 16.40 103.52 7.91 8.20 16.56 105.47 7.91 8.20 16.43 103.89 7.91 8.20 16.76 107.91 7.91 8.20 16.39 103.40 -
取3个批号的防暑清热饮样品(批号:20200120,202002101,202002102),各3份,按“2.2.2”项下方法制备防暑清热饮供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件操作,进样20 μl,记录峰面积,计算含量,结果见表3。
表 3 3批防暑清热饮含量测定结果(n=3, μg/ml)
批号 绿原酸 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 蒙花苷 广藿香酮 20200120 147.97±0.73 83.61±0.53 181.99±0.15 17.26±0.48 3.16±0.30 202002101 142.35±0.15 75.19±1.07 162.42±0.16 14.16±0.86 1.74±0.54 202002102 163.00±0.06 80.24±0.88 215.19±0.04 17.63±0.78 2.09±2.38
Simultaneous determination of five active components in Fangshu Qingre mixture by RP-HPLC
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摘要:
目的 建立RP-HPLC法同时测定防暑清热饮中绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷和广藿香酮含量的方法。 方法 采用ZORBAX-SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,流速为1.0 ml/min,检测波长为327 nm,柱温为30 ℃。 结果 绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷和广藿香酮线性关系良好(r≥0.999 6),平均加样回收率(RSD)分别为102.03%(1.63%)、102.38%(1.51%)、102.39%(1.23%)、103.14%(1.87%)和104.01%(2.33%)。 结论 本实验建立的测定方法简单、准确、重复性好,能够有效控制该制剂的质量。 -
关键词:
- 防暑清热饮 /
- 绿原酸 /
- 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 /
- 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 /
- 蒙花苷 /
- 广藿香酮 /
- 高效液相色谱法
Abstract:Objective To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid, luteolin-7-O-β-D-glucoside,3,5-dicaffeoylquinic acid, linarin and pogostone in Fangshu Qingre mixture by RP-HPLC. Methods ZORBAX-SB-C18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used as the chromatographic column.The mobile phase was 0.2% formic acid water solution(A) and acetonitrile solution (B)with a gradient elution mode. The flow rate was 1.0 ml/min.The detective wavelength was 327 nm. The column temperature was 30 ℃. Results There were good linear relationships in the determination of chlorogenic acid, luteolin-7-O-β-D-glucoside, 3,5-dicaffeoylquinic acid, linarin and pogostone (r≥0.999 6), with the average recovery rate of 102.03%(1.63%), 102.38%(1.51%), 102.39%(1.23%), 103.14%(1.87%) and 104.01%(2.33%). Conclusion The method was simple and stable with a good reproducibility, which could be used as a quality control method for active compotents in Fangshu Qingre mixture. -
Key words:
- Fangshu Qingre mixture /
- chlorogenic acid /
- luteolin-7-O-β-D-glucoside /
- 3,5-dicaffeoylquinic acid /
- linarin /
- pogostone /
- HPLC
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表 1 回归方程及线性范围
化合物名称 回归方程 r 线性范围(μg/ml) 绿原酸 Y=13.496X-63.194 0.999 9 43.00~430.00 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 Y=19.707X-169.310 0.999 7 21.00~210.00 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 Y=4.659X-0.895 0.999 7 60.00~600.00 蒙花苷 Y=6.5862X+6.154 0.999 6 4.20~42.00 广藿香酮 Y=11.788X+2.109 0.999 6 1.02~10.20 表 2 防暑清热饮加样回收率试验结果(n=6)
成分 样品含量(m/μg) 加入量(m/μg) 测得量(m/μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 绿原酸 369.44 376.00 745.10 99.91 102.03 1.63 369.44 376.00 748.25 100.75 369.44 376.00 756.12 102.84 369.44 376.00 749.80 101.16 369.44 376.00 764.27 105.01 369.44 376.00 754.89 102.51 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 209.79 210.00 425.37 102.65 102.38 1.51 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 425.15 102.55 209.79 210.00 419.79 100.00 209.79 210.00 428.48 104.14 209.79 210.00 421.50 100.81 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 452.68 484.00 939.25 100.53 102.39 1.23 452.68 484.00 947.23 102.18 452.68 484.00 956.31 104.06 452.68 484.00 942.56 101.22 452.68 484.00 949.64 102.68 452.68 484.00 954.57 103.70 蒙花苷 42.88 42.00 85.58 101.67 103.14 1.87 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 87.42 106.05 42.88 42.00 87.13 105.37 42.88 42.00 85.42 101.30 42.88 42.00 86.21 103.16 广藿香酮 7.91 8.20 16.10 99.86 104.01 2.33 7.91 8.20 16.40 103.52 7.91 8.20 16.56 105.47 7.91 8.20 16.43 103.89 7.91 8.20 16.76 107.91 7.91 8.20 16.39 103.40 表 3 3批防暑清热饮含量测定结果(n=3, μg/ml)
批号 绿原酸 木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸 蒙花苷 广藿香酮 20200120 147.97±0.73 83.61±0.53 181.99±0.15 17.26±0.48 3.16±0.30 202002101 142.35±0.15 75.19±1.07 162.42±0.16 14.16±0.86 1.74±0.54 202002102 163.00±0.06 80.24±0.88 215.19±0.04 17.63±0.78 2.09±2.38 -
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