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红色诺卡菌(Nocardia rubra,Nr)是一种放线菌,其细胞壁骨架(Nocardia rubra cell wall skeleton,Nr-CWS)具有免疫调节作用[1]。Nr-CWS作为一种治疗药物现已在国内上市并在临床使用。研究表明,Nr-CWS在增强体内巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞活性的同时,还能诱导机体产生LAK细胞,提高机体内T辅助性细胞和杀伤细胞活力、增强巨噬细胞和天然杀伤细胞免疫活性,抑制肿瘤和增强免疫能力的功效[2-4]。但Nr-CWS在发挥作用的同时,往往还伴随一些副作用的发生。究其主要原因是由于红色诺卡菌细胞壁是个细胞粗提物[5],其中的成分复杂,具体哪种成分起相应的药理作用还不清楚,这极大地影响了其临床使用及后续药理作用机制的研究。本研究拟采用UHPLC-Q-TOF/MS分析方法首先对Nr-CWS提取物中化学成分进行分离分析,鉴别其中的化学成分;并对其中的多糖成分进行水解,然后对水解后的单糖进行衍生化处理,与其他分析方法相比, UHPLC-MS/MS具有较大的优越性[6-8], 其灵敏度高、专属性强、可以快速准确地测定单糖的含量。所以本研究采用UHPLC-MS/MS方法对单糖衍生化产物进行定量分析测定,这将为后期开展Nr-CWS活性成分筛选及药理作用机制的研究奠定基础。
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UHPLC-Q-TOF/MS分析在安捷伦1290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦6538四极杆-高分辨飞行时间串联质谱仪(Agilent,USA)上进行,色谱分离在Amide色谱柱上进行(3.0 mm×100 mm,3.5 µm,Waters,USA),柱温40 ℃,流动相A为0.1 %甲酸水溶液,流动相B为乙腈溶液,流速0.4 ml/min,流动相采用梯度洗脱,洗脱条件为:0~1 min,5 % A;1~5 min,5 %~20 % A;5~20 min,20%~45 % A;20~30 min,45 % A,进样量为5 µl,自动进样器温度保持在25 ℃。电喷雾离子源(ESI)采用正、负离子模型。Q-TOF/MS质谱参数如下:毛细管电压,正离子模式下4 kV,负离子模式下3.5 kV;干燥器流速11 L/min;气体温度350 ℃;雾化器压力45 psig;碎片电压120 eV;Skimmer电压60 eV。质谱的采集范围m/z 50~1100,分析碰撞能量10~40 eV。
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取Nr-CWS提取物溶于1 ml纯水中,充分涡旋溶解后制成Nr-CWS提取物母液,取100 µl于1.5 ml EP管中,加入3倍量的乙醇进行蛋白沉淀。然后4 ℃下13 000 r/min离心15 min,吸取200 µl上清液,于进样瓶中用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。
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采用UHPLC-Q-TOF/MS分析方法对Nr-CWS提取物样品溶液进行快速地分离与分析,获得正、负离子模式下的总离子流图,通过与Metlin数据库中代谢物信息比对分析,可对Nr-CWS提取物中化学成分进行快速分析与鉴别,结果如图1和表1所示。
表 1 Nr-CWS中化学分析的UHPLC-Q-TOF/MS数据信息
序号 化合物名称 [M+X] 分子式 m/z 保留时间(t/min) 1 2-(S-glutathionyl)acetyl glutathione M-H C22H34N6O13S2 654.162 5 0.91 2 2-(S-glutathionyl)acetyl glutathione M+H C22H34N6O13S2 654.668 0 0.91 3 estradiol-17alpha 3-D-glucuronoside M-H C24H32O8 448.209 7 1.12 4 tyrosine M+H C9H11NO3 181.190 0 1.13 5 cer(d18∶0/23∶0) M+H C41H83NO3 637.637 3 1.30 6 palmitic acid M-H C16H32O2 256.424 1 1.31 7 stearic acid M-H C18H36O2 284.271 5 1.31 8 L-threonine M+H C4H9NO3 119.120 0 1.33 9 D-xylose M-H C5H10O5 150.130 0 1.34 10 N-acetyl-D-glucosamine M-H C8H15NO6 221.210 0 1.39 11 meso-2,6-diaminopimelic acid M+H C7H14N2O4 190.197 1 1.39 12 leinoleic acid M+H C18H32O2 280.445 5 1.41 13 choline M+H C5H15NO 104.170 8 1.56 14 L-rhamnose monohydrate M-H C6H12O5 164.160 0 1.64 15 docosapentaenoic acid M-H C22H34O2 330.255 9 1.67 16 proline M-H C5H9NO2 115.130 0 1.93 17 fructose 1,6-bisphosphate M+H C6H14O12P2 339.996 0 2.22 18 glucose 6-phosphate M+H C6H13O9P 260.135 8 2.28 19 fucose M-H C6H12O5 164.150 0 2.34 20 L-proline M-H C5H9NO2 115.063 3 2.34 21 PG(18∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)) M-H C44H81O10P 800.556 7 5.96 22 tetracosanoic acid M-H C24H48O2 368.636 7 7.07 23 orotidylic acid M-H C10H13N2O11P 368.190 8 7.65 24 sphinganine M+H C18H39NO2 301.507 8 7.72 25 valine M-H C5H11NO2 117.150 0 7.74 26 cervonoyl ethanolamide M-H C24H36O3 372.540 8 7.94 27 phytosphingosine M+H C18H39NO3 317.507 2 7.94 28 tryptophan M+H C11H12N2O2 204.230 0 7.97 29 trihexosylceramide (d18∶1/12∶0) M-H C48H89NO18 967.608 0 8.10 30 histidine M+H C6H9N3O2 155.160 0 8.45 31 L-asparagine M-H C4H8N2O3 132.120 0 9.65 32 galactinol dihydrate M-H C12H26O13 378.327 0 9.66 33 3-hydroxydodecanoyl carnitine M+H C19H37NO5 359.500 8 9.70 34 L-cysteine M+H C3H7NO2S 121.120 0 9.84 35 cysteinyl-threonine M-H C7H14N2O4S 222.067 4 9.98 36 D-mannose M-H C6H12O6 180.160 0 10.10 37 MG (0∶0/24∶1(15Z)/0∶0) M-H C27H52O4 440.386 6 10.11 38 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol glucuronide M-H C16H23N3O8 385.369 1 11.32 39 D-glucose M-H C6H12O6 180.160 0 11.34 40 desmosine M+H C24H40N5O8 526.603 1 11.38 41 L-methionine M+H C5H11O2NS 149.210 0 11.59 42 glycogen M-H C24H42O21 666.577 7 11.90 43 levan M-H C18H32O16 504.437 1 11.90 44 D-galactose M-H C6H12O6 180.160 0 11.92 45 L-beta-aspartyl-L-aspartic acid M+H C8H12N2O7 248.190 1 12.00 46 muramic acid M-H C9H17NO7 251.233 8 12.16 47 1-pyrroline-2-carboxylic acid M-H C5H7NO2 113.114 6 12.25 48 ADP-glucose M-H C16H25N5O15P2 589.341 7 12.25 49 DG(42∶10) M+H C45H68O5 688.506 7 12.27 50 isoleucine M-H C6H13NO2 131.170 0 12.55 51 leucine M-H C6H13NO2 131.170 0 12.79 52 PGP(16∶1(9Z)/18∶0) M-H C40H78O13P2 828.491 8 12.99 53 PGP(16∶0/20∶4) M+H C42H76O13P2 850.992 6 13.01 54 TG(62∶6) M-H C65H114O6 990.861 5 13.60 55 ganglioside GM3 (d18∶1/16∶0) M-H C57H104N2O21 1152.713 2 14.15 56 valyl-methionine M+H C10H20N2O3S 248.342 0 14.18 57 DG(18∶2n6/0∶0/22∶6n3) M-H C44H70O5 678.522 3 15.27 58 PS(16∶0/18∶2) M-H C40H74NO10P 759.990 0 15.90 59 PGP(18∶1/22∶6) M-H C46H78O13P2 900.491 8 16.62 60 CDP-DG(16∶0/18∶0) M-H C46H85N3O15P2 981.545 6 17.41 61 TG(22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24∶0/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)) M-H C71H114O6 1 062.861 5 18.28 62 TG(24∶0/24∶0/24∶0) M-H C75H146O6 1 143.111 9 19.25 63 serine M-H C3H7NO3 105.090 0 27.23 64 alanine M-H C3H7NO2 89.090 0 27.28 -
准确称取D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖各10 mg,分别置10 ml 容量瓶,各加水定容,即得1 mg/ml浓度的各单糖标准品溶液。分别精密取上述单糖标准品溶液,混合后加重蒸水稀释,制成100 μg/ml的单糖混合标准溶液。
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精密称取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)1.0 g,置10 ml量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,制得0.5 mol/L的PMP 甲醇溶液。
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精密吸取单糖及混合标准品溶液100 μl置2 ml EP管中,添加100 μl氨水,再加入100 μl 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,涡旋30~45 s,于70 ℃烘箱中加热30 min,取出放冷至室温。加入100 μl乙酸,涡旋30 s中和,加重蒸水至1 ml,再加500 μl氯仿,涡旋30 s,混匀,弃去下层溶液,重复3 次,12 000 r/min离心10 min,水层经0.22 μm微孔滤膜滤过,取次滤液用于UHPLC-MS/MS分析,见表2。
表 2 UHPLC-MS/MS分析测定的质谱条件
序号 化合物名称 保留时间(t/min) 分子式 单糖分子量 衍生物分子量 母离子 子离子 碰撞电压(eV) 1 D-甘露糖 2.012 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 2 D-核糖 2.216 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 3 L-鼠李糖 2.423 C6H14O6 164.1 496.1 495.1 175.0, 217.1 31 4 D-果糖 2.504 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 5 D-葡萄糖 3.725 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 6 D-木糖 3.917 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 7 D-半乳糖 3.918 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 8 D-阿拉伯糖 4.086 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 -
UHPLC-MS/MS分析采用安捷伦1290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦6460三重四极杆串联质谱仪(Agilent,USA)。色谱分离在Waters Xbridge C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱温40 ℃,流动相A为20 mmol/L的乙酸铵水溶液(氨水调pH 8.0),流动相B为乙腈溶液,流速0.4 ml/min,流动相采用梯度洗脱,洗脱条件为:0~2 min,15%~20% B;2~4 min,20%~25% B;4~5 min,25%~95 % B,5~6 min,15 % B,样品分析时间5 min,柱后平衡时间1 min。进样量为2 µl,自动进样器温度保持25 ℃。三重四级杆质谱条件为:电喷雾离子源(ESI)采用负离子,多级反应选择离子监测模式:毛细管电压3.5 kV;干燥器流速11 L/min;气体温度350 ℃;雾化器压力40 psig;碎片电压80 eV;Skimmer电压60 eV。
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精密吸取Nr-CWS提取物溶液1 ml,加入2 mol/L的TFA 2.0 ml,放入110 ℃的真空干燥箱中,酸性条件下水解6 h,冷却至室温,4 ℃条件下离心干燥,挥发三氟乙酸,加重蒸水1 ml复溶,用于衍生化处理。
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精密吸取Nr-CWS提取物的水解液100 μl,按照前述单糖衍生化方法进行前处理后,精密吸取前处理后的样品溶液2 μl进UHPLC-MS/MS分析,混合标准品和Nr-CWS样品衍生化后的UHPLC-MS/MS色谱图见图2。
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精密吸取单糖混合标准品溶液,按前述单糖衍生化方法进行前处理后,精密吸取前处理后的样品溶液2 μl用UHPLC-MS/MS法分析,以各单糖峰面积与相应浓度进行线性回归分析,计算回归方程和相关系数,逐步稀释后,按照信噪比S/N=10和3,分别计算其定量限和检测限,结果见表3。
表 3 单糖衍生物的标准曲线及定量限和检测限
序号 化合物 回归方程 r 浓度范围(μg/ml) 定量限(ng/ml) 检测限(ng/ml) 1 D-甘露糖 Y = 383.2 X − 92.4 0.996 0.05~10 20 5 2 D-核糖 Y = 656.8 X − 109.5 0.994 0.10~20 50 20 3 L-鼠李糖 Y = 1025.3 X − 386.4 0.992 0.50~100 20 5 4 D-果糖 Y = 902.3 X − 133.1 0.994 0.10~20 100 50 5 D-葡萄糖 Y = 2875.3 X − 342.9 0.993 0.50~100 100 50 6 D-木糖 Y = 2391.1 X − 1004.6 0.995 0.05~10 50 20 7 D-半乳糖 Y =3482.4 X − 1093.5 0.998 1.00~200 100 50 8 D-阿拉伯糖 Y = 5436.8 X − 2102.3 0.992 5.00~1000 50 20 -
取经水解和衍生化反应后的单糖混合标准溶液,按照前述UHPLC-MS/MS分析测定条件,连续进样6次,计算其测定结果的RSD为3.13%,结果表明该方法的精密度良好,符合分析测定的要求。
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Nr-CWS提取物溶液经水解和衍生化反应后,室温下放置,分别于0、5、l5、30、60、120 min进样,进行UHPLC-MS/MS分析,测定其浓度,对样品的稳定性进行评价,结果6次测定结果的RSD为7.63%,表明样品在2 h内稳定性良好,符合分析测定的要求。
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取同一批样品,重复测定6次,计算其测定结果RSD为4.67%,表明该方法的重复性良好,符合分析测定的要求。
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精密吸取已知含量的Nr-CWS提取物加入接近等量的单糖混合标准品溶液,经水解和衍生化反应后,进行UHPLC-MS/MS分析,计算其平均回收率为86.93%,RSD为9.15%,符合分析测定的要求。
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精密吸取Nr-CWS提取物样品溶液6份,经水解衍生化后,按照前述UHPLC-MS/MS分析条件对衍生化后的样品进行分离分析,测定其中单糖的含量,结果见表4,可以看出8种单糖成分都能被检出,其中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高。
表 4 Nr-CWS提取物(1~6)中8种单糖成分的含量测定结果
提取物编号 单糖成分(μg/ml) D-甘露糖 D-核糖 D-鼠李糖 D-果糖 D-葡萄糖 D-木糖 D-半乳糖 D-阿拉伯糖 1 0.9 5.3 12.2 18.9 55.1 20.9 320.8 456.1 2 2.1 4.6 21.4 12.4 48.3 19.2 205.6 504.8 3 3.2 3.5 30.5 9.8 61.9 23.1 223.0 327.3 4 5.5 6.6 19.8 15.4 45.8 27.8 305.4 462.8 5 1.5 4.9 23.4 14.7 39.1 12.1 311.7 489.1 6 4.7 7.6 25.1 22.5 52.7 27.2 289.2 510.8 平均值 3.0 5.4 22.1 15.6 50.5 21.7 276.0 458.5
Identification of chemical components and monosaccharide assay in Nocardia rubra cell wall skeleton
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摘要:
目的 分析鉴别红色诺卡菌细胞壁骨架(Nr-CWS)中的化学成分,并对其中的单糖成分进行分析测定。 方法 首先,采用UHPLC-Q-TOF/MS方法对Nr-CWS提取物中的化学成分进行分离与分析,通过与Metlin数据库中代谢物成分信息比对,快速鉴别其中化学成分。然后,对Nr-CWS提取物中多糖水解后衍生化,采用UHPLC-MS/MS法对单糖衍生物进行定量分析,测定单糖的含量。 结果 共鉴别出Nr-CWS提取物中的64个化学成分,主要包括氨基酸、单糖、脂肪酸等成分。此外,建立了8种单糖柱前衍生化的UHPLC-MS/MS含量测定方法,含量测定结果表明,Nr-CWS中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高,说明阿拉伯糖、半乳糖是组成Nr-CWS中多糖的主要组成成分。 结论 通过对Nr-CWS中的主要化学成分进行了分离与分析,对多糖水解后的单糖成分进行含量测定,为今后开展Nr-CWS活性成分的筛选及药理作用机制的研究奠定基础。 -
关键词:
- 红色诺卡菌细胞壁骨架 /
- 化学成分 /
- 鉴别 /
- 单糖 /
- 含量测定
Abstract:Objective To analyze and identify the chemical components in the Nocardia rubra cell wall skeleton (Nr-CWS), and to determine the contents of monosaccharides accurately. Methods The extract of Nr-CWS was separated and analyzed by UHPLC-Q-TOF/MS method. The chemical components were quickly identified by matching the data with the information in the Metlin database. The monosaccharide contents in the Nr-CWS extract were determined by UHPLC-MS/MS method after derivatization. Results A total of 64 chemical components were identified in the extract of Nr-CWS, including amino acids, monosaccharides and so on. A assay method for 8 monosaccharides by UHPLC-MS/MS was successfully established. The content of arabinose in Nr-CWS was the highest, followed by galactose, which indicated that the main polysaccharide components in Nr-CWS may be composed of these monosaccharides. Conclusion In this study, we analyzed the main chemical components of Nr-CWS, which are amino acids, fatty acids and so on. The content of monosaccharide after polysaccharide hydrolysis was determined by UHPLC-MS/MS. This will lay a foundation for the screening of the active components of Nr-CWS and the study of its pharmacological mechanism. -
Key words:
- Nocardia rubra cell wall skeleton /
- chemical component /
- identification /
- monosaccharide /
- determination
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表 1 Nr-CWS中化学分析的UHPLC-Q-TOF/MS数据信息
序号 化合物名称 [M+X] 分子式 m/z 保留时间(t/min) 1 2-(S-glutathionyl)acetyl glutathione M-H C22H34N6O13S2 654.162 5 0.91 2 2-(S-glutathionyl)acetyl glutathione M+H C22H34N6O13S2 654.668 0 0.91 3 estradiol-17alpha 3-D-glucuronoside M-H C24H32O8 448.209 7 1.12 4 tyrosine M+H C9H11NO3 181.190 0 1.13 5 cer(d18∶0/23∶0) M+H C41H83NO3 637.637 3 1.30 6 palmitic acid M-H C16H32O2 256.424 1 1.31 7 stearic acid M-H C18H36O2 284.271 5 1.31 8 L-threonine M+H C4H9NO3 119.120 0 1.33 9 D-xylose M-H C5H10O5 150.130 0 1.34 10 N-acetyl-D-glucosamine M-H C8H15NO6 221.210 0 1.39 11 meso-2,6-diaminopimelic acid M+H C7H14N2O4 190.197 1 1.39 12 leinoleic acid M+H C18H32O2 280.445 5 1.41 13 choline M+H C5H15NO 104.170 8 1.56 14 L-rhamnose monohydrate M-H C6H12O5 164.160 0 1.64 15 docosapentaenoic acid M-H C22H34O2 330.255 9 1.67 16 proline M-H C5H9NO2 115.130 0 1.93 17 fructose 1,6-bisphosphate M+H C6H14O12P2 339.996 0 2.22 18 glucose 6-phosphate M+H C6H13O9P 260.135 8 2.28 19 fucose M-H C6H12O5 164.150 0 2.34 20 L-proline M-H C5H9NO2 115.063 3 2.34 21 PG(18∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)) M-H C44H81O10P 800.556 7 5.96 22 tetracosanoic acid M-H C24H48O2 368.636 7 7.07 23 orotidylic acid M-H C10H13N2O11P 368.190 8 7.65 24 sphinganine M+H C18H39NO2 301.507 8 7.72 25 valine M-H C5H11NO2 117.150 0 7.74 26 cervonoyl ethanolamide M-H C24H36O3 372.540 8 7.94 27 phytosphingosine M+H C18H39NO3 317.507 2 7.94 28 tryptophan M+H C11H12N2O2 204.230 0 7.97 29 trihexosylceramide (d18∶1/12∶0) M-H C48H89NO18 967.608 0 8.10 30 histidine M+H C6H9N3O2 155.160 0 8.45 31 L-asparagine M-H C4H8N2O3 132.120 0 9.65 32 galactinol dihydrate M-H C12H26O13 378.327 0 9.66 33 3-hydroxydodecanoyl carnitine M+H C19H37NO5 359.500 8 9.70 34 L-cysteine M+H C3H7NO2S 121.120 0 9.84 35 cysteinyl-threonine M-H C7H14N2O4S 222.067 4 9.98 36 D-mannose M-H C6H12O6 180.160 0 10.10 37 MG (0∶0/24∶1(15Z)/0∶0) M-H C27H52O4 440.386 6 10.11 38 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol glucuronide M-H C16H23N3O8 385.369 1 11.32 39 D-glucose M-H C6H12O6 180.160 0 11.34 40 desmosine M+H C24H40N5O8 526.603 1 11.38 41 L-methionine M+H C5H11O2NS 149.210 0 11.59 42 glycogen M-H C24H42O21 666.577 7 11.90 43 levan M-H C18H32O16 504.437 1 11.90 44 D-galactose M-H C6H12O6 180.160 0 11.92 45 L-beta-aspartyl-L-aspartic acid M+H C8H12N2O7 248.190 1 12.00 46 muramic acid M-H C9H17NO7 251.233 8 12.16 47 1-pyrroline-2-carboxylic acid M-H C5H7NO2 113.114 6 12.25 48 ADP-glucose M-H C16H25N5O15P2 589.341 7 12.25 49 DG(42∶10) M+H C45H68O5 688.506 7 12.27 50 isoleucine M-H C6H13NO2 131.170 0 12.55 51 leucine M-H C6H13NO2 131.170 0 12.79 52 PGP(16∶1(9Z)/18∶0) M-H C40H78O13P2 828.491 8 12.99 53 PGP(16∶0/20∶4) M+H C42H76O13P2 850.992 6 13.01 54 TG(62∶6) M-H C65H114O6 990.861 5 13.60 55 ganglioside GM3 (d18∶1/16∶0) M-H C57H104N2O21 1152.713 2 14.15 56 valyl-methionine M+H C10H20N2O3S 248.342 0 14.18 57 DG(18∶2n6/0∶0/22∶6n3) M-H C44H70O5 678.522 3 15.27 58 PS(16∶0/18∶2) M-H C40H74NO10P 759.990 0 15.90 59 PGP(18∶1/22∶6) M-H C46H78O13P2 900.491 8 16.62 60 CDP-DG(16∶0/18∶0) M-H C46H85N3O15P2 981.545 6 17.41 61 TG(22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24∶0/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)) M-H C71H114O6 1 062.861 5 18.28 62 TG(24∶0/24∶0/24∶0) M-H C75H146O6 1 143.111 9 19.25 63 serine M-H C3H7NO3 105.090 0 27.23 64 alanine M-H C3H7NO2 89.090 0 27.28 表 2 UHPLC-MS/MS分析测定的质谱条件
序号 化合物名称 保留时间(t/min) 分子式 单糖分子量 衍生物分子量 母离子 子离子 碰撞电压(eV) 1 D-甘露糖 2.012 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 2 D-核糖 2.216 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 3 L-鼠李糖 2.423 C6H14O6 164.1 496.1 495.1 175.0, 217.1 31 4 D-果糖 2.504 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 5 D-葡萄糖 3.725 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 6 D-木糖 3.917 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 7 D-半乳糖 3.918 C6H12O6 180.1 512.1 511.1 175.0, 217.1 34 8 D-阿拉伯糖 4.086 C5H10O5 150.1 482.1 481.1 175.0, 217.1 31 表 3 单糖衍生物的标准曲线及定量限和检测限
序号 化合物 回归方程 r 浓度范围(μg/ml) 定量限(ng/ml) 检测限(ng/ml) 1 D-甘露糖 Y = 383.2 X − 92.4 0.996 0.05~10 20 5 2 D-核糖 Y = 656.8 X − 109.5 0.994 0.10~20 50 20 3 L-鼠李糖 Y = 1025.3 X − 386.4 0.992 0.50~100 20 5 4 D-果糖 Y = 902.3 X − 133.1 0.994 0.10~20 100 50 5 D-葡萄糖 Y = 2875.3 X − 342.9 0.993 0.50~100 100 50 6 D-木糖 Y = 2391.1 X − 1004.6 0.995 0.05~10 50 20 7 D-半乳糖 Y =3482.4 X − 1093.5 0.998 1.00~200 100 50 8 D-阿拉伯糖 Y = 5436.8 X − 2102.3 0.992 5.00~1000 50 20 表 4 Nr-CWS提取物(1~6)中8种单糖成分的含量测定结果
提取物编号 单糖成分(μg/ml) D-甘露糖 D-核糖 D-鼠李糖 D-果糖 D-葡萄糖 D-木糖 D-半乳糖 D-阿拉伯糖 1 0.9 5.3 12.2 18.9 55.1 20.9 320.8 456.1 2 2.1 4.6 21.4 12.4 48.3 19.2 205.6 504.8 3 3.2 3.5 30.5 9.8 61.9 23.1 223.0 327.3 4 5.5 6.6 19.8 15.4 45.8 27.8 305.4 462.8 5 1.5 4.9 23.4 14.7 39.1 12.1 311.7 489.1 6 4.7 7.6 25.1 22.5 52.7 27.2 289.2 510.8 平均值 3.0 5.4 22.1 15.6 50.5 21.7 276.0 458.5 -
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