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脓毒症作为机体对感染反应失调的器官功能障碍综合征，常累及肾脏，是危重患者发生急性肾损伤最常见的原因之一。脓毒症引起的急性肾损伤不仅使住院死亡率增加6~8倍，还与远期慢性肾脏病的发展和远期死亡风险增加有关[1-3]。通常认为脓毒症相关急性肾损伤的发病过程与过度炎症反应、血流动力学障碍、凝血功能障碍、小管上皮细胞损害等有关[1]，然而，脓毒症相关急性肾损伤的机制尚未完全阐明。近年来，代谢组学作为反应疾病内环境与内源性代谢物之间关系的一种方法，被广泛应用于各种疾病，因此，利用代谢组学探究脓毒症相关急性肾损伤中内源性代谢物的变化有助于进一步理解其发病机制。黄连作为常见中药，具有抗炎、抗氧化等功能，被广泛用于各种疾病[4]。既往研究发现黄连可以通过减轻炎症改善脓毒症诱导的急性肝损伤[5]，而黄连是否对脓毒症相关急性肾损伤存在保护作用还有待进一步研究。本研究旨在研究黄连对脓毒症相关肾损伤的影响，并利用代谢组学探讨其潜在机制。
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C57BL/6小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）；黄连生药获于安徽亳州；生化指标试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Agilent 7890A /5975C气相色谱-质谱联用仪（美国）；Agilent J&W Scientific HP-5ms（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）毛细管色谱柱。
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黄连生药由海军军医大学药学院孙连娜教授鉴定；根据《中国药典》(2015年版)准备黄连水提取物。
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采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症相关急性肾损伤模型。将18只小鼠随机分为3组，每组6只。具体分组如下，假手术组（Sham组）：仅对小鼠切开缝合，并给予等体积生理盐水灌胃；模型组（CLP组）：小鼠行CLP，并给予等体积生理盐水灌胃；给药组（RCE组）：小鼠行CLP，并给予黄连提取物100 mg/kg灌胃。
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干预完成24 h后，对所有小鼠行内眦静脉取血，4 ℃冰箱静置40 min后，以3000 r/min离心5 min，取血清置于−80 ℃冰箱保存，以行生化指标检测。取血后处死小鼠，行心脏灌流，切取肾脏置于−80 ℃冰箱中保存，以行代谢组学分析。
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利用试剂盒检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。
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取出−80 ℃冰箱中储存的肾组织，取皮髓交界部分，称取50 mg加入内标甲醇1 ml，再加入碾磨珠，4 ℃，70 Hz碾磨120 s，再置入4 ℃离心机中，以12 000 r/min离心10 min，取上清液200 μl置离心管中，温和氮气吹干。加入15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl，涡旋30 s，置于70 ℃的烘箱中反应60 min，再加入N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（含1%的三甲基氯硅烷）50 μl，涡旋1 min，室温反应30 min，再加入100 μl正庚烷，涡旋30 s，4 000 r/min离心5 min，取上清液100 μl上样。余上清液每个取10 μl混合成质量控制样本（QC），涡旋后取100 μl上样。
采用气相色谱-质谱（GC-MS）进行代谢组学分析。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度<99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μl。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，并维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50~550 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动造成的影响。
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在R软件平台下采用自写的程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别和积分，然后在TagFinder软件下进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属等分析，最后在Excel软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择等，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（保留时间及质荷比）、观察量（样本）和积分面积。本项目共得到1 234个物质（每组样本至少存在80%以上的物质）。将中心化和归一化后的数据导入SIMCA-P V11.0进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别式分析（PLS-DA）进行排列测试以评估模型的质量，生成变量重要性投影（VIP），表示对每种代谢物离子的群间区分的贡献。选择VIP 值>1.0的代谢物用于进一步分析。
所有数据以（
$\bar x$ +s）形式表示，使用one-way ANOVA 和 post hoc Tukey’s 检验，通过 SPSS 17.0 软件计算P值，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
假手术组、模型组及给药组Scr水平分别为（9.83±1.95）、（50.83±13.53）、（29.67±4.96）μmol/L；BUN水平分别为（8.08±0.84）、（27.67±5.22）、（16.33±2.69）mmol/L。模型组较假手术组Scr水平、BUN水平均上调；而给药组较模型组均下调，差异均有统计学意义（P<0.05，表1），表明黄连提取物在脓毒症相关急性肾损伤中可改善肾功能。
表 1 黄连提取物对小鼠外周血生化指标的影响
组别 Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) 假手术组 9.83±1.95 8.08±0.84 模型组 50.83±13.53* 27.67±5.22* 给药组 29.67±4.96# 16.33±2.69# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与给药组比较。 -
按照上述色谱-质谱条件，分别对各组样品进样分析，得到典型的总离子流图（图1）。
图 1 小鼠肾组织典型的GC-MS总离子流图
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采用PCA方法对各组样本进行整体分析，并通过质量控制样本的聚集程度对系统的稳定性进行考察。根据整体PCA得分图（图2）所示，质量控制样本均聚集良好，其离散度明显低于待分析样本的离散度，表明系统稳定性良好。
图 2 正离子模式下所有样本PCA得分图
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采用PLS-DA方法对假手术组、模型组、给药组样本进行分析。首先对假手术组和模型组单独进行分析，两组在正/负离子模式下的得分图显示，假手术组与模型组区分明显（图3）。进一步对3组样本进行分析，3组在正/负离子模式下的得分图显示，假手术组与模型组有较明显的区分趋势，同时，给药组较模型组有一定程度的回调（图4）。提示脓毒症相关急性肾损伤中，经黄连提取物干预后，代谢物变化发生回调。
图 3 假手术组与模型组的PLS-DA得分图
图 4 假手术组、模型组和给药组的PLS-DA得分图
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S-plot可以很好地反映各个离子对组间差异的贡献程度，离原点越远的点表明其对组间差异的贡献度越大，其VIP值也越大。正离子模式下对照组和模型组的S-plot显示两组间存在差异代谢物（图5）。
图 5 正离子模式下假手术组与模型组S-plot图
在VIP值>1，且3组ANOVA分析以及Turkey两两分析P值均<0.05的条件下，共筛选并鉴别出16个差异代谢物，包括天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、磷酸、苹果酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、松二糖、肌醇，主要参与氨基酸代谢和糖代谢（表2）。在这16个代谢物中，其中8个代谢物水平在黄连提取物干预下发生回调，它们是天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、柠檬酸、葡萄糖、肌醇。提示黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用。
表 2 脓毒症相关肾损伤差异代谢物及代谢途径
序号 保留时间（t/min） VIP 代谢途径 代谢物 分子式 倍数变化 模型组/假手术组 给药组/模型组 1 7.37 1.37 氨基酸代谢 L-天冬氨酸（L-aspartic acid） C4H7NO4 0.63 1.56 2 10.99 1.36 L-甘氨酸（glycine） C2H5NO2 1.25 0.78 3 12.65 1.49 L-苏氨酸（L-threonine） C4H9NO3 1.18 0.64 4 14.96 2.71 L-脯氨酸（L-proline） C5H9NO2 0.79 0.38 5 15.64 1.48 L-苯丙氨酸（L-phenylalanine） C9H11NO2 1.45 0.18 6 20.52 1.68 L-缬氨酸（L-valine） C5H11NO2 0.84 0.13 7 21.11 1.07 L-酪氨酸（L-tyrosine） C9H11NO3 1.28 0.12 8 25.58 1.93 色氨酸（tryptophan） C11H12N2O2 0.71 0.61 9 10.63 1.69 糖代谢 磷酸（phosphoric acid） H3PO4 0.7 0.99 10 14.13 1.08 L-苹果酸（L-malic acid） C4H6O5 0.9 0.64 11 17.03 1.56 L-苏糖酸（L-threonic acid） C4H8O5 0.81 0.37 12 20.1 1.63 柠檬酸（citric acid） C6H8O7 0.77 1.99 13 20.91 4.44 D-果糖（D-fructose） C7H15NO6 0.82 0.68 14 21.38 1.34 D-葡萄糖（D-glucose） C6H12O6 1.33 0.68 15 22.3 1.91 松二糖（turanose） C12H22O11 0.81 0.66 16 24.27 2.26 肌醇（inositol） C6H12O6 1.34 0.59 -
脓毒症是由机体对感染反应失调所引起的威胁生命的多器官系统功能障碍，而急性肾损伤是最常见的情况，多发生在脓毒症早期。约51%的脓毒症患者会发生急性肾损伤，导致病死率增高41%[6]。与非脓毒症性急性肾损伤比较，脓毒症相关急性肾损伤起病更急、肾功能损害程度更严重、系统性炎症反应更重、器官功能衰竭评分也更高[7]。目前，我们对急性肾损伤发病机制的了解有限，肾血管收缩和肾血流减少导致肾缺血，促炎和抗炎反应的早期激活，以及肾小管细胞的凋亡均可导致肾损伤[8]。由于肾脏是排泄代谢终产物的主要器官，故其损伤必然会引起肾脏代谢状况的改变。
近年来，中草药在世界范围内得到越来越多的认可，而黄连以其泻火解毒、清热燥湿的功效被广泛使用。黄连的主要成分包括小檗碱、巴马汀、药根碱等生物碱类[9]。大量研究表明，黄连具有抗菌、消炎、抗高血压、抗氧化、降糖和降胆固醇的作用，具有很强的临床使用意义[10]。Huang等[11]研究发现黄连解毒汤能通过抑制炎症反应延长脓毒症大鼠的生存时间，有效保护心肌细胞。Zhang等[12]证实黄连对慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能有一定的改善作用。代谢组学通过考察生物体受刺激后代谢产物的变化，以研究生物体代谢途径，研究对象包括代谢中间产物或终产物等体内小分子代谢物[13]。黄连对脓毒症相关的急性肾损伤有何影响，是否具有保护作用，本研究利用基于GC-MS的代谢组学对此进一步探讨。
本研究通过代谢组学研究，发现共有16个代谢物与脓毒症相关急性肾损伤有关，主要参与氨基酸代谢和糖代谢。在这些代谢物中，有8个代谢物在黄连提取物干预后发生回调。
在氨基酸代谢中，天冬氨酸水平在脓毒症相关急性肾损伤中降低，甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平升高，这些代谢物在黄连提取物干预后都发生了回调。既往研究提示，脓毒症相关急性肾损伤的肾组织中，天冬氨酸和苏氨酸水平均降低[8]，可能是由于防御和修复过程中的蛋白质合成增加了氨基酸的消耗，这与本课题组的结果存在部分差异，可能需要进一步通过血液及尿液样本进行研究及探讨。甘氨酸作为一种抗炎、抗氧化的保护剂，有研究提示甘氨酸衍生物可以通过减轻脂质过氧化从而改善肾缺血/再灌注损伤[14]。有趣的是，另有研究显示甘氨酸通过激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体加重氧化应激以及肾缺血/再灌注损伤[15]。因此，课题组推测脓毒症相关急性肾损伤中，甘氨酸水平升高一方面可能起到自我保护作用，而另一方面可能加重肾损伤；黄连提取物可能通过减少甘氨酸从而抑制NMDA受体的激活，减轻脓毒症相关急性肾损伤。苯丙氨酸通过苯丙氨酸羟化酶生成酪氨酸，在慢性肾脏病患者中，苯丙氨酸水平升高，酪氨酸水平降低，这可能与苯丙氨酸羟化酶活性降低相关[16]。而在脓毒症相关急性肾损伤中，苯丙氨酸及酪氨酸水平均升高，提示该过程中苯丙氨酸羟化酶活性可能未发生明显变化，而可能与其他代谢途径相关。对甲酚硫酸盐作为一种尿毒症毒素，为肠道细菌代谢酪氨酸、苯丙氨酸的产物。在脓毒症情况下，肠道微环境收到干扰[17]，我们推测苯丙氨酸及酪氨酸水平的升高可能进一步引起对甲酚硫酸盐水平的升高，加重肾损伤。既往有研究提示，黄连可以调节肠道菌群[18]，我们推测黄连可能通过联合改善内源代谢变化和调节肠道环境对脓毒症相关急性肾损伤起到保护作用。
在糖代谢中，柠檬酸水平在脓毒症相关急性肾损伤中降低，葡萄糖和肌醇水平升高，这些代谢物在黄连提取物干预后都发生了回调。曾有研究表明，柠檬酸循环是脓毒症中受影响最大的代谢途径[19]。在脓毒症相关急性肾损伤模型中，三羧酸循环/氧化磷酸化过程减弱，糖酵解过程增强，这一代谢重编程现象称为瓦博格效应[20]。柠檬酸水平的降低也验证了这一现象。葡萄糖水平升高的可能原因是糖异生维持内源性葡萄糖生成，以防止低血糖的发展，从而建立脓毒症耐受性[21]。脓毒症时，体内迅速升高的升糖激素和前炎性因子加重了这一现象。但是，糖异生过程增强可能进一步减弱氧化磷酸化过程，我们推测黄连提取物可能通过抑制糖酵解、增强氧化磷酸化，从而增强机体抗炎能力，减轻脓毒症相关急性肾损伤。
本研究尚有一些不足之处，主要在于分析黄连提取物功效时局限于脓毒症的某一时间点，而不能获知脓毒症相关性急性肾损伤全病程中肾损伤的情况，以及黄连提取物对肾脏的保护作用。其次，收集样本的手段比较简单，难以消除潜在的影响因素。总之，黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用，但其中的机制还有待进一步研究。这一研究结果表明，黄连具有成为脓毒症相关急性肾损伤新的治疗手段的潜质，尽管可行性需要更多验证，但为治疗脓毒症相关急性肾损伤提供了新的思路。
The protective effect of Rhizoma Coptidis extracts against the sepsis associated with acute kidney injury based on metabolic analysis
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摘要:
目的 探讨黄连提取物（Rhizoma Coptidis extracts，RCE）对脓毒症相关急性肾损伤的影响及潜在机制。 方法 将C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组以及治疗组3组；采用试剂盒检测血清肌酐（serum creatinine，Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；采用气相色谱-质谱进行代谢组学分析。 结果 模型组较假手术组Scr、BUN水平均上调；而治疗组较模型组均下调，差异均有统计学意义（P<0.05）。代谢组学分析共获得16个代谢物可能与脓毒症相关急性肾损伤过程有关，主要参与氨基酸代谢和糖代谢。在这16个代谢物中，8个代谢物水平在黄连提取物干预下发生回调。 结论 黄连提取物可能通过改善脓毒症相关急性肾损伤的代谢物变化从而起到治疗作用。 Abstract:Objective To investigate the potential mechanism of Rhizoma Coptidis extracts (RCE) against sepsis associated with acute kidney injury. Methods C57BL/6 mice were divided into sham group, model group and RCE treatment group. The levels of Scr and BUN were measured by test kits. Gas chromatography-mass spectrometry was used to analyze metabolic changes in kidneys. Results The levels of Scr and BUN were increased in the model group than sham, which were reversed by RCE. 16 metabolites related to the progress of sepsis associated with acute kidney injury were detected, which were involved in amino acid metabolism and carbohydrate metabolism. Among these metabolites, the level of 8 metabolites can be reversed with RCE treatment. Conclusion RCE might exert therapeutic effects in sepsis associated with acute kidney injury by altering multiple metabolic pathways. -
Key words:
- sepsis /
- acute kidney injury /
- Rhizoma Coptidis /
- metabonomics
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金沸草（Inulae Herba）为菊科（Asteraceae）植物条叶旋覆花（Inula linariifolia Turcz.）或旋覆花（Inula japonica Thunb.）的干燥地上部分，被列入2015年版《中国药典》，具有降气、消痰、行水的功效，临床上应用广泛 [1]。金沸草的不同基源中，已有多篇文献报道过旋覆花的含量测定，而条叶旋覆花的含量测定目前尚未见报道[2-6]。
前期研究发现线叶旋覆花内酯A（britanin）是从条叶旋覆花中分离得到的含量较高且抗炎活性显著的一个倍半萜内酯，其结构式如图1所示。据文献报道，线叶旋覆花内酯A可应用于慢性阻塞性肺疾病[7]及心肌炎[8]的预防和治疗，具有神经保护[9]功能，能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路降低脂多糖（LPS）诱导的一氧化氮（NO）、前列腺素和炎性细胞因子的分泌水平[10]。这些功能与金沸草治疗“外感风寒，痰饮蓄结，胸膈脾满”相对应，因此可将其作为条叶旋覆花的重要质量标志物[1]。本研究优化了线叶旋覆花内酯A的提取方法和色谱条件，并开展系统适应性试验，建立了HPLC-UV法测定条叶旋覆花的干燥地上部位和头状花序中线叶旋覆花内酯A的含量测定方法，确定了含量较高的部位，有助于药材的合理应用。该方法操作简单，方便快捷，可为金沸草的基源药材条叶旋覆花的质量标准制定提供数据支持和科学依据。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
HP-1100系列高效液相色谱仪（惠普，美国）；G1311A 四元泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1314A VWD可变波长检测器、G1315B DAD二极管阵列检测器（安捷伦，美国）；Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm；安捷伦，美国）；BP211D 型电子天平（Sartotius，德国）。
1.2 药材与试剂
7批条叶旋覆花的干燥地上部分购自不同地区，获得的头状花序部位经由海军军医大学药学院生药学教研室张汉明教授鉴定；线叶旋覆花内酯A对照品（britanin）为实验室自制，化学分子式为C19H26O7，相对分子质量为366。经紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）和质谱（MS）分析，纯度≥98%，符合中药化学对照品的含量测定要求；乙腈为J.T Baker 色谱纯，水为Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 提取条件
超声法提取，超声时间为40 min。溶剂：100%甲醇。溶剂体积倍数：40倍。
2.2 色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm；安捷伦，美国）；初始流动相为乙腈-水（30:70），在20 min内升至乙腈-水（40:60）进行梯度洗脱，流速始终为1.2 ml/min；柱温为恒温30 ℃；检测波长212 nm。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取1.21 mg线叶旋覆花内酯A对照品，置于10 ml容量瓶中，用100%甲醇溶解后定容，摇匀，获得1 ml中含有线叶旋覆花内酯A 0.121 mg的对照品溶液（浓度为0.121 mg/ml），冷藏备用。
2.4 供试品溶液的制备
精密称定条叶旋覆花（头状花序）粉末(过3号筛) 和条叶旋覆花（干燥地上部分）粉末(过3号筛) 各1.0 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入40 ml 100%甲醇，密塞，称重，超声提取60 min后，静置放冷，再称重，加100%甲醇溶液补足失重，摇匀，过滤，取续滤液，在5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，即得条叶旋覆花头状花序和干燥地上部分的供试品溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 专属性试验
取“2.3”项下制备的对照品溶液（0.121 mg/ml）和“2.4”项下制备的两种供试品溶液，分别按“2.2”项下的色谱条件进样测定，采用二极管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描，记录并查看保留时间为12.2 min处峰上5点的紫外吸收图。如图2所示，两种供试品溶液的最大吸收波长与对照品溶液的最大吸收波长一致，峰形均为单一峰，分离度达到规定的要求，该方法的专属性良好。
图 2 对照品溶液和两种供试品溶液（批号000 3）的HPLC图A.对照品溶液；B.条叶旋覆花（头状花序）供试品溶液；C.条叶旋覆花（干燥地上部分）供试品溶液；1. 线叶旋覆花内酯A2.5.2 标准曲线的绘制
精密吸取“2.3”项下制备的浓度为0.121 mg/ml的线叶旋覆花内酯A对照品溶液各0.5、1、2、4、10、16、20、24 µl，根据“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录峰面积积分值。以线叶旋覆花内酯A的进样量为横坐标（X，相当于µg数），峰面积积分值为纵坐标（Y），计算并绘制标准曲线。计算得线叶旋覆花内酯A含量测定的回归方程为Y = 1 040.5X+1.379（r = 1.000 0），理论板数平均为25 554。结果显示线叶旋覆花内酯A在0.060～2.904 µg范围内呈现良好的线性关系。
2.5.3 精密度试验
精密吸取等量 “2.3”项下制备的线叶旋覆花内酯A对照品溶液（0.121 mg/ml），根据“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录线叶旋覆花内酯A的峰面积，连续测定6次。计算结果显示6份线叶旋覆花内酯A对照品溶液的峰面积RSD值为0.59%。表明仪器和方法具有较高的精密度，符合要求。
2.5.4 稳定性试验
取 “2.4”项下制备的同一供试品，分别于提取后0、1、2、4、6、8、10、12 h按“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录各谱图中线叶旋覆花内酯A的峰面积。结果显示，12 h内线叶旋覆花内酯A的峰面积的RSD为0.97%，具备良好的稳定性。
2.5.5 重现性试验
取样品批号为000 3的条叶旋覆花5份，分别精密称重，按照“2.2”项下的色谱条件，测定并计算线叶旋覆花内酯A的峰面积。根据结果计算得到其平均峰面积积分值为399.9，平均峰面积积分值的RSD值为1.04%，表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的含量重现性良好。
2.5.6 检测限和定量限
在“2.2”项下的色谱条件下，以100%的甲醇为溶剂对线叶旋覆花内酯A对照品溶液（0.121 mg/ml）进行倍比稀释，按信噪比为3测定最低检测限。结果表明，当线叶旋覆花内酯A对照品的浓度为1.51 µg/ml、进样量为1 µl时，峰信号约为噪声的2 ~ 3倍，即最低检测限为1.51 ng。将线叶旋覆花内酯A对照品溶液稀释至浓度为0.453 µg/ml且信噪比约为10时，重复进样6次，计算得峰面积的RSD为1.96%，表明线叶旋覆花内酯A对照品的定量限为0.453 µg/ml，即4.53 ng。
2.5.7 回收率试验
取同一批号的样品6份（批号为000 3），分别精密加入与样品中线叶旋覆花内酯A含量相等的对照品，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算线叶旋覆花内酯A的含量、回收率和RSD值。结果如表1所示，线叶旋覆花内酯A的平均回收率为95.77%，RSD为1.80%，表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的加样回收率良好。
表 1 回收率试验结果取样量（m/g） 样品中的含量（m/mg） 对照品加入量（m/mg） 测定量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%) 0.505 0 0.803 0.770 1.555 97.8 95.77 1.80 0.524 2 0.834 0.770 1.557 94.3 0.502 8 0.799 0.770 1.519 93.7 0.509 1 0.809 0.770 1.562 97.8 0.504 9 0.803 0.770 1.534 95.2 0.509 6 0.810 0.770 1.546 95.8 2.6 样品的含量测定
分别精密称取对照品与7个批次样品的头状花序和干燥地上部分，按“2.3”项下与“2.4”项下分别制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.2”项下的条件进行色谱测定分析，每批样品平行3次，记录峰面积。根据上述标准曲线计算7批样品中线叶旋覆花内酯A的平均含量。结果如表2所示，条叶旋覆花的头状花序中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.732%，干燥地上部分中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.125%，仅为头状花序的1/7。
表 2 条叶旋覆花的头状花序及地上干燥部分的含量测定结果部位 编号 采集点 含量（%） 平均含量（%） 头状花序 0001 江苏省南京市玄武区 0.733 0.732 0002 江苏省南京市溧水区 0.693 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.936 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.509 0005 安徽省滁州市明光市 0.709 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.564 0007 安徽省六安市霍邱县 0.983 干燥地上部分 0001 江苏省南京市玄武区 0.202 0.125 0002 江苏省南京市溧水区 0.141 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.158 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.123 0005 安徽省滁州市明光市 0.059 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.068 0007 安徽省六安市霍邱县 0.122 3. 讨论
提取方法和色谱条件是经过优化后选用的。本研究考察了超声、回流、浸渍3种提取方法，其中冷浸法提取出的线叶旋覆花内酯A含量最高，尽管提出率高，但提取的杂质最多，影响测定，热回流法提出的含量最低。考虑提取方法的提出率及操作的可行性和便捷性，选用超声法提取条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A。随后本研究考察了选择不同溶剂（水、不同浓度的乙醇或甲醇等）、不同溶剂倍数的溶剂体积（10、20、40、60倍）及不同超声时间（10、20、40、60 min）等条件对线叶旋覆花内酯A的提取效果。结果显示，当溶剂为100%甲醇、体积倍数为样品质量的40倍、超声时间为40 min时，可以将条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A充分提出。
通过比较 Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；岛津，日本）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；瑞典）和 Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；安捷伦，美国）3种色谱柱，发现Agilent Zorbax SB C18 柱能更好地分离条叶旋覆花药材的化学成分，而且线叶旋覆花内酯A峰峰形较好，理论板数较高，故选用该色谱柱分析。另外，本研究考察了不同柱温（20、25、30 ℃）、不同流动相系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-甲酸等系统）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）等条件对分离效果的影响，结果表明柱温在30 ℃，以乙腈-水为流动相在1.2 ml/min的流速下梯度洗脱时，线叶旋覆花内酯A峰能较好地与其他峰达到基线分离。通过上述优化实验最终确定了方法部分所用的提取条件和色谱条件。
本文建立的以线叶旋覆花内酯A为标志物的金沸草的质量控制方法，能够帮助研究人员在对金沸草的研究开发过程中，对线叶旋覆花内酯A的含量进行质量控制，区分伪劣及混淆药材，选择质量合格的金沸草药材。另外，本研究发现相对于条叶旋覆花的干燥地上部分，线叶旋覆花内酯A在条叶旋覆花的头状花序中含量更高，是更有效的用药部位，为临床医师用药提供了参考。
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表 1 黄连提取物对小鼠外周血生化指标的影响
组别 Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) 假手术组 9.83±1.95 8.08±0.84 模型组 50.83±13.53* 27.67±5.22* 给药组 29.67±4.96# 16.33±2.69# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与给药组比较。 
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表 2 脓毒症相关肾损伤差异代谢物及代谢途径
序号 保留时间（t/min） VIP 代谢途径 代谢物 分子式 倍数变化 模型组/假手术组 给药组/模型组 1 7.37 1.37 氨基酸代谢 L-天冬氨酸（L-aspartic acid） C4H7NO4 0.63 1.56 2 10.99 1.36 L-甘氨酸（glycine） C2H5NO2 1.25 0.78 3 12.65 1.49 L-苏氨酸（L-threonine） C4H9NO3 1.18 0.64 4 14.96 2.71 L-脯氨酸（L-proline） C5H9NO2 0.79 0.38 5 15.64 1.48 L-苯丙氨酸（L-phenylalanine） C9H11NO2 1.45 0.18 6 20.52 1.68 L-缬氨酸（L-valine） C5H11NO2 0.84 0.13 7 21.11 1.07 L-酪氨酸（L-tyrosine） C9H11NO3 1.28 0.12 8 25.58 1.93 色氨酸（tryptophan） C11H12N2O2 0.71 0.61 9 10.63 1.69 糖代谢 磷酸（phosphoric acid） H3PO4 0.7 0.99 10 14.13 1.08 L-苹果酸（L-malic acid） C4H6O5 0.9 0.64 11 17.03 1.56 L-苏糖酸（L-threonic acid） C4H8O5 0.81 0.37 12 20.1 1.63 柠檬酸（citric acid） C6H8O7 0.77 1.99 13 20.91 4.44 D-果糖（D-fructose） C7H15NO6 0.82 0.68 14 21.38 1.34 D-葡萄糖（D-glucose） C6H12O6 1.33 0.68 15 22.3 1.91 松二糖（turanose） C12H22O11 0.81 0.66 16 24.27 2.26 肌醇（inositol） C6H12O6 1.34 0.59
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