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烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

汪东昇 郑斯莉 程明和 缪朝玉

宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
引用本文: 汪东昇, 郑斯莉, 程明和, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006

烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
基金项目: 上海市科委生物医药领域科技支撑项目(16431901400);国家自然科学基金重点项目(81730098)
详细信息
    作者简介:

    汪东昇,硕士研究生,Email:wangdongsheng126@126.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R965

Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock

  • 摘要:   目的  探究烟酰胺单核苷酸(NMN)对脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克小鼠死亡率的影响。  方法  将10周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分组,均腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模。NMN腹腔注射给药,分为3种方式:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg。观察记录每组小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线。  结果  与溶剂对照组相比,造模后0.5 h或造模前0.5 h给予不同剂量NMN,均不能改善小鼠死亡率或延缓死亡时间;造模后0.5 h和12 h两次给予NMN会加速小鼠死亡,增加小鼠死亡率。两个厂家的NMN产品效果类似。  结论  NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠不具有治疗作用,小鼠内毒素休克发生后进行NMN多次给药会增加死亡率。
  • 肾衰宁颗粒由太子参、黄连、制半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等十味中药制成;具有补气健脾,活血化痰,祛浊的功效[1]。有文献表明,肾衰宁在治疗慢性肾脏疾病中疗效较为显著[2];在尿毒症腹膜透析患者的治疗过程中能够降低血清硫酸吲哚酯浓度[3];对于慢性肾脏病的Ⅳ期患者,在西医基础治疗的同时服用肾衰宁颗粒,可以明显改善肾功能,同时提升患者的治愈率,具有较高的临床使用价值[4]。由于中药成分复杂[5],使得如何控制中药的质量成为十分重要的问题。指纹图谱是在了解中药物质整体作用的基础上,通过光谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图,以鉴别中药的真伪,评价质量的一致性和产品的稳定性,其具有信息量大、特征性强、完整性和模糊性等特点[6]。指纹图谱中的质量控制技术既能保证中药的功效,又在实现中药现代化过程中起关键性作用[7]。因此,本实验以10个批次的肾衰宁颗粒为研究对象,拟建立肾衰宁颗粒的指纹图谱,对肾衰宁颗粒进行质量评价。

    肾衰宁颗粒是由十味中药组成的复方制剂,其化学成分十分复杂,且许多复方治疗疾病的药物基础并不明显,因此检测成分必须是发挥药效的有效成分[8],本实验针对大黄中的大黄酚(chrysophanol)[9-10]、丹参中的丹酚酸B(salvianolic acid B)[11]、陈皮中的橙皮苷(hesperidin)[9, 12]3种指标性成分,进行HPLC法含量测定。在多成分的质量控制检测成本高而对照品紧缺的情况下,能较大程度地节约检验成本,又可较全面地控制该制剂的质量,保证临床用药的有效性和安全性,同时为肾衰宁颗粒的质量控制提供参考。

    Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司),包含G1311C四元泵,G1329B自动进样器,G1316A柱温箱,G4212B-DAD二极管阵列检测器,Chemstation色谱工作站;光电分析天平(德国Sartorius公司,CPA 225D型),最大载荷220 g,分度值0.01 mg;冷冻真空浓缩仪(丹麦Labogene公司,ScanVac ScanSpeed 40型);超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司,SK7200H型);涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司,Vortex QL-901型)。

    肾衰宁颗粒(德元堂制药集团,批号:51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、51103105、51103018 486、41103033 563、51103110、61103102、61103101)。蜕皮激素(ecdysterone,批号:P11N6F5706)、甘草苷(liquiritin,批号:2O1027BA14)、甘草酸(glycyrrhizic acid,批号:230A6B1)、大黄酚(chrysophanol,批号:T31O6F5345)、丹酚酸B(salvianolic acid B,批号:Y14M7H14804)、橙皮苷(hesperidin,批号:K02M3C1)对照品,均由上海源叶有限公司提供。大黄素(modin,批号:110756-200110)、盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,批号:09030522)对照品,由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸,均为德国Merck公司生产,色谱纯。二氯甲烷,色谱纯。水为纯净水,娃哈哈公司生产。

    色谱柱:Waters SunFire™ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相A:乙腈;流动相B:0.1%甲酸溶液,梯度洗脱。流速:1 ml/min。柱温:25 ℃。进样量:10 μl。检测波长:254 nm。梯度洗脱条件见表1

    表  1  梯度洗脱条件
    时间(t/min)乙腈(%)0.1%甲酸溶液(%)
    0595
    12377
    182575
    193070
    317525
    608515
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    精密依次称取丹酚酸B、橙皮苷、大黄素标准品10.25、10.35、10.05 mg,分别置于10 ml容量瓶中,以纯甲醇定容至刻度,摇匀,得储备液并将其分装后储存于−20 ℃的冰箱中。精密称取10.10 mg大黄酚,置于10 ml容量瓶中,加入少量二氯甲烷溶解,超声处理3 min,然后用纯甲醇稀释至刻度,摇匀,得到对照品的储备液,置于−20 ℃冰箱保存。

    取肾衰宁颗粒适量,研磨成细粉,混合均匀,精密称取0.10 g,加适量70%甲醇溶液使其溶解,超声45 min,再用70%甲醇溶液定容至2 ml,冷却,过0.45 μm微孔滤膜后,取续滤液进样分析。

    2.4.1   精密度试验

    取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),按照“2.3”项制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下连续进样5次,通过大黄素(7号色谱峰)作为参照峰,确定相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD在1.0%以内,相对峰面积的RSD在2.0%以内,表明进样仪器的精密度良好。

    2.4.2   重复性试验

    取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),按照“2.3”项平行制备5份供试品溶液,测定在“2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内,相对保留面积RSD在2.0%以内。表明该实验方法的重复性良好。

    2.4.3   稳定性试验

    取肾衰宁颗粒(批号:41103033 563),并根据“2.3”项下平行制备5份供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下,分别记录0、4、8、24、36 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内,相对保留面积RSD在2.0%以内。表明供试样品溶液在36 h内稳定性好。

    分别称取10个批次的肾衰宁粉末,按照“2.3”项制备供试品溶液,每个批次平行制备3份供试品溶液,记录图谱,见图1。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008A版”的软件,将10批次肾衰宁颗粒的图谱导入,将批号为61103102的样品溶液用作针对相似性计算校正的参考图。结果显示,1~9批制剂间指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90,见表2,表明相似度良好。对保留时间0~60 min内的色谱峰进行分析,均有22个稳定的特征峰,确定其为肾衰宁的共有指纹峰,经过标准品比对,其中,6号峰为橙皮苷,14号峰为丹酚酸B,21号峰为大黄酚。

    图  1  10批肾衰宁颗粒的色谱图
    表  2  10批肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱相似度
    样品号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照指纹图谱
    S11.0000.9800.9100.9410.9340.9480.9160.9410.9500.8740.965
    S20.9801.0000.9340.9340.9320.9450.9510.9460.9780.8670.973
    S30.9100.9341.0000.9520.9470.9370.9720.9400.9450.9140.973
    S40.9410.9340.9521.0000.9900.9840.9510.9710.9230.9400.986
    S50.9340.9320.9470.9901.0000.9780.9380.9760.9100.9100.979
    S60.9480.9450.9370.9840.9781.0000.9540.9870.9310.9230.986
    S70.9160.9510.9720.9510.9380.9541.0000.9490.9660.9130.979
    S80.9410.9460.9400.9710.9760.9870.9491.0000.9280.8900.980
    S90.9500.9780.9450.9230.9100.9310.9660.9281.0000.8920.969
    S100.8740.8670.9140.9400.9100.9230.9130.8900.8921.0000.937
    对照指纹图谱0.9650.9730.9730.9860.9790.9860.9790.9800.9690.9371.000
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    2.6.1   线性结果考察

    按照“2.2”项下制备标准品溶液,得到混合对照品色谱图见图2。将标准品储备液用纯甲醇稀释,丹酚酸B浓度梯度为:10、20、40、80和100 μg/ml;橙皮苷浓度梯度为:40、80、160、320和400 μg/ml;大黄酚浓度梯度为:8、16、40、100和350 μg/ml。在“2.1”项色谱条件下,分别记录3种成分的峰面积,以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,结果见表3

    图  2  混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图
    1.橙皮苷;2.丹酚酸B;3.大黄酚
    表  3  各成分线性关系
    对照品回归方程r线性范围(μg/ml)
    橙皮苷Y=2.391 8X–2.798 30.999 740~400
    丹酚酸BY=10.689X–5.578 30.999 810~100
    大黄酚Y=58.983X+121.990.999 97~350
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    2.6.2   精密度试验

    取同一对照品溶液,根据“2.1”项下色谱条件进行测定,重复进样5次,并记录峰面积。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚峰面积的RSD分别为0.17%、0.20%、0.15%,表明仪器精密度良好。

    2.6.3   检测限和定量限

    精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚对照品溶液适量,使用甲醇逐步稀释,至色谱图中上述3种成分的峰高分别为噪音的3倍和10倍,测得橙皮苷的检测限和定量限分别为0.18和1 μg/ml;丹酚酸B的检测限和定量限分别为0.3和1.2 μg/ml;大黄酚的检测限和定量限分别为1和5 μg/ml。

    2.6.4   稳定性试验

    取同一供试品溶液(批号:41103033 563),并根据“2.1”项色谱条件在0、2、4、8、24、36 h测定。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为2.01%、2.22%、2.05%,结果表明:供试品在36 h内稳定。

    2.6.5   重复性试验

    取同一供试品溶液(批号:41103033 563),平行制备6份,并根据“2.1”项色谱条件进行测定,橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为0.67%、2.00%、2.02%,表明系统重复性良好。

    2.6.6   加样回收率试验

    精密量取肾衰宁溶液1 ml,分别加入100%含量橙皮苷对照品(理论值为192.02 μg),100%含量丹酚酸B对照品(理论值为62.66 μg),100%含量大黄酚对照品(理论值35.22 μg),按照“2.2”项平行制备6份,并根据“2.1”的色谱条件进行测量,按照下述公式计算加样回收率,平均加样回收分别为119.20%、84.69%、84.58%。结果见表4

    表  4  加样回收率试验结果
    成分取样量(V/ml)样品含量(m/μg)加入量(m/μg)测得量(m/μg)回收率(%)平均回收率(%)
    橙皮苷1.00383.0295.88773.46101.80100.27
    1.00380.3995.88764.91100.26
    1.00380.3195.88763.64 99.95
    1.00384.4695.88771.17100.83
    1.00385.8195.88772.95100.94
    1.00389.2095.88764.32 97.81
    丹酚酸B1.00120.7931.80250.42101.91 98.82
    1.00122.5031.80251.14101.12
    1.00125.5631.80248.78 96.87
    1.00127.5731.80254.87100.07
    1.00127.7431.80251.44 97.25
    1.00127.7531.80249.44 95.66
    大黄酚1.00 72.6717.79138.19 92.06 97.36
    1.00 69.6217.79135.41 92.44
    1.00 68.4617.79140.83101.69
    1.00 71.0317.79141.25 98.66
    1.00 68.9817.79141.57102.00
    1.00 71.9217.79141.17 97.30
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    回收率=(实测量-样品含量)/加入量×100%。

    2.6.7   样品含量测定

    取10批肾衰宁颗粒,按“2.2”项制备试液,按“2.1”项色谱条件测定,结果见表5

    表  5  10批肾衰宁样品中3种成分的测定结果
    药品批号橙皮苷(μg/ml)丹酚酸B(μg/ml)大黄酚(μg/ml)
    6110310266.9942.2944.65
    5110311083.4139.3442.89
    5110311194.7541.3644.51
    51103009 34680.5743.2143.44
    51103011 59383.5142.0442.58
    51103018 48679.9441.9442.96
    51103010 47190.0341.8844.03
    41103033 56383.4843.0143.94
    6110310185,9242.9343.85
    5110310588.0441.7642.94
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    在190~400 nm处全波长扫描,盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚、丹酚酸B、蜕皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分别在345、254、254、286、250、237、237、283 nm处有最大吸收,通过对比分析,在波长254 nm处,上述8种成分具有良好的响应,样品中相邻色谱峰的基线分离可以满足含量检测的要求。因此,选择波长254 nm作为检测波长。

    将肾衰宁粉末直接用水溶解后进样,发现样品出峰很少,所测成分在色谱条件下没有吸收。后用50%、70%、80%的甲醇溶解样品,发现用70%甲醇溶解出峰数最多,且所测成分在此条件下均有吸收,故选择70%甲醇进行样品的前处理。

    有文献报道,肾衰宁含量测定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]进行90 min的大梯度洗脱,发现色谱峰分不开,且特征峰较少。经过反复实验,确定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脱的流动相,分离出样品中测得的特征峰,特征峰很多,峰形良好。

  • 图  1  LPS造模后300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    图  2  LPS造模后不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    图  3  LPS造模前300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响

    图  4  LPS造模前不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    图  5  LPS造模后两次NMN给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    *P<0.05、**P<0.01,与生理盐水组比较。

    图  6  不同厂家NMN两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    *P<0.05,与生理盐水组比较。

    图  7  不同厂家NMN预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-02-05
  • 修回日期:  2021-03-10
  • 网络出版日期:  2021-03-31
  • 刊出日期:  2021-03-25

烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
    基金项目:  上海市科委生物医药领域科技支撑项目(16431901400);国家自然科学基金重点项目(81730098)
    作者简介:

    汪东昇,硕士研究生,Email:wangdongsheng126@126.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R965

摘要:   目的  探究烟酰胺单核苷酸(NMN)对脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克小鼠死亡率的影响。  方法  将10周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分组,均腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模。NMN腹腔注射给药,分为3种方式:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg。观察记录每组小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线。  结果  与溶剂对照组相比,造模后0.5 h或造模前0.5 h给予不同剂量NMN,均不能改善小鼠死亡率或延缓死亡时间;造模后0.5 h和12 h两次给予NMN会加速小鼠死亡,增加小鼠死亡率。两个厂家的NMN产品效果类似。  结论  NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠不具有治疗作用,小鼠内毒素休克发生后进行NMN多次给药会增加死亡率。

English Abstract

宋新华, 陈旭娇, 邓冯沂, 高守红, 彭辉. 肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
引用本文: 汪东昇, 郑斯莉, 程明和, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
SONG Xinhua, CHEN Xujiao, DENG Fengyi, GAO Shouhong, PENG Hui. Research on the fingerprint and three active components assay in Shenshuaining granules by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 259-263. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911005
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种经典辅酶,对线粒体电子转移反应至关重要,在许多生物学功能中起着关键作用[1]。烟酰胺单核苷酸(NMN)是NAD生物合成的关键中间体。NMN在心脑血管疾病、肝肾功能、血管和内皮功能,以及免疫和炎症、衰老等各类疾病治疗方面都具有相当强的潜力[2],常被人称为“万能药”。NMN能够通过口服、静脉注射、腹腔注射(小鼠)等多种给药途径进入体内,通常具有较高的安全性。在急性毒性实验中,小鼠连续7 d给予最大灌胃剂量和饱和浓度的NMN,每天1次,耐受性良好,除血清丙氨酸氨基转移酶略有升高外,其余生物标志物基本保持不变,而相同处理条件下的比格犬,会有轻度的肌酐和尿酸升高[3];在长期给药实验中,小鼠连续12个月给予100和300 mg/kg的NMN,均未出现不良反应[4]。在出血性休克治疗方面,对出血性休克大鼠模型,术前连续5 d的NMN饮水给药和术后静脉推注NMN均能缩短休克复苏时间和提高复苏后的存活率[5]。据报道[6-9],在炎症治疗方面,NMN及相关代谢产物烟酰胺核糖、烟酰胺都具有一定抗炎作用。

    内毒素休克是由感染引起的全身炎症反应综合征,会导致各系统衰竭,包括循环系统、呼吸系统、血液系统,损害肝脏和肾脏功能[10]。相关研究显示,最佳的治疗时间在发病6 h内,能够提高患者的生存率,降低病死率[11]。目前临床内毒素休克以药物治疗为主(如血管活性药物、激素、抗菌素等)[12],同时辅以液体复苏、脑神经保护、吸氧等常规治疗。为便于对内毒素休克开展研究治疗,通常使用LPS进行内毒素休克动物造模,LPS是G-菌细胞壁外膜上的主要成分,也叫内毒素,能引起严重的炎症级联反应,是G-菌的主要致病成分之一[13]

    目前,NMN对内毒素休克的治疗作用尚未知。本研究旨在探究NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠模型的死亡率影响,为阐明NMN在内毒素休克治疗方面的作用提供线索。

    • 烟酰胺单核苷酸[NMN,纯度≥95%,−25~−15 ℃保存,邦泰生物工程(深圳)有限公司];烟酰胺单核苷酸[NMN~,纯度≥95%,2~8 ℃保存,尚科生物医药(上海)有限公司];脂多糖(LPS,美国Sigma公司);BT25S精密电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];独立通风系统(上海鸣励实验室科技发展有限公司)。

    • SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)。实验前在相对洁净的环境下使用独立通风系统,将动物适应性饲养2周。期间动物自由饮水、进食。笼具内温度22~26 ℃、湿度40%~70%,笼内维持正压20~25 Pa,每小时换气次数60~70次,室内明暗交替12 h(8:00~20:00照明)。

    • 根据不同实验目的,将C57BL/6J小鼠随机分为给药组和对照组。腹腔注射LPS(10 mg/kg)进行内毒素休克造模,在造模前或者造模后进行NMN腹腔注射给药,给药方式分为单次给药和两次给药方式。具体分成5个实验:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg;④造模后0.5 h和12 h分别用2种不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg;⑤造模前0.5 h用不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg。

    • 使用Log-rank检验,对给药组和溶剂对照组的生存曲线进行比较,P<0.05为差异有统计学意义,使用GraphPad Prism8软件对数据进行统计分析。

    • 图1所示,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN组小鼠首次出现死亡的时间比生理盐水组更早,整个观察期间给药组小鼠死亡的总体趋势要稍快于生理盐水组,且在观察末期存活的动物数量略少。但两组生存曲线之间比较无统计学差异(P=0.2161)。因此,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN不具有治疗内毒素休克的作用,甚至有轻微增加内毒素休克死亡率的趋势。

      图  1  LPS造模后300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

      实验进一步考察了LPS造模后0.5 h给予多个不同剂量NMN对内毒素休克死亡率的影响,如图2所示,与生理盐水组相比,10、30、100、300 mg/kg NMN给药组的小鼠首次出现死亡的时间均接近,各组中位生存时间:300、100、30、10 mg/kg给药组分别为51、55、41和38 h,生理盐水组为37 h。整个观察期间NMN给药各组死亡速度较生理盐水组稍缓,其中放缓趋势最明显的是100 mg/kg剂量组,但均不具有统计学意义(P=0.4334),表明小鼠在LPS造模后0.5 h单次给予NMN不能改善内毒素休克死亡率或减缓死亡速度。

      图  2  LPS造模后不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    • 在LPS造模前0.5 h进行NMN给药。如图3所示,300 mg/kg NMN预防给药组小鼠首次出现死亡的时间稍早于生理盐水组,而2组死亡的总体趋势相近,前者的中位生存时间为83 h,后者为91 h,生存曲线比较无统计学差异(P=0.5946),故LPS造模前0.5 h给予300 mg/kg NMN不能改善内毒素休克小鼠的死亡率,不具有防治作用。

      图  3  LPS造模前300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响

      随后又进行多个不同剂量NMN单次预给药实验。如图4所示,NMN 30、100、300、600 mg/kg组与生理盐水组小鼠首次出现死亡的时间均相近,之后各组死亡趋势也类似,各组中位生存时间分别是:NMN给药组30 mg/kg为34 h、100 mg/kg为43 h、300 mg/kg为40 h、600 mg/kg为55 h,生理盐水组为37 h,各组生存曲线也无统计学意义。结果表明,在造模前进行NMN单次预给药对于LPS构建的内毒素休克模型无明显改善生存率的作用。

      图  4  LPS造模前不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    • 考虑到NMN在体内的代谢速度较快,能够迅速入血进入各个组织器官并代谢为活性分子NAD,而NAD被证明在多种炎症性疾病中具有保护作用,因此,观察NMN的2次给药是否对内毒素休克有治疗效果。

      图5所示,2次重复实验结果均表明,LPS造模后0.5 h和12 h,给予2次NMN(每次300 mg/kg)治疗组小鼠其首次出现死亡的时间早于生理盐水组;之后,NMN治疗组小鼠死亡速度明显快于对照组,且观察末期NMN治疗组小鼠存活率不及对照组一半,2次重复实验的生存曲线间均具有统计学差异(P=0.0404;P=0.0038)。因此,该结果表明,LPS造模后2次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。

      图  5  LPS造模后两次NMN给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    • 不同厂家生产的NMN因药物纯度、杂质成分不同等,可能导致治疗效果有差别。为排除非药物分子本身因素如厂家生产工艺因素,进一步明确上述NMN治疗内毒素休克的作用,接着引入另一厂家生产的NMN(以下均简称NMN~),并同时测试比较两家NMN产品治疗内毒素休克的效果。

      实验首先对LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)增加内毒素休克死亡率的作用进行了验证。如图6所示,NMN给药组和NMN~给药组这2组小鼠首次出现死亡的时间和观察末期小鼠存活数都接近,整个观察期小鼠死亡趋势非常相似,与生理盐水对照组相比,两组都明显加重内毒素休克小鼠的死亡率,与对照组的生存曲线间均有统计学差异(P=0.0499;P=0.0260)。3组中位生存时间分别是:NMN给药组57.5 h、NMN~给药组51.5 h、生理盐水组106.5 h。此外,该结果与上述单个NMN产品连续2次给药效果类似(图5)。因此,两家NMN产品效果基本相同,也进一步证明了LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)确实可加重内毒素休克病情,加速小鼠的死亡。

      图  6  不同厂家NMN两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

      最后,实验又考察了两家NMN产品预防给药效果,即在LPS造模前0.5 h进行NMN或NMN~给药。如图7所示,NMN组、NMN~组、生理盐水组3组小鼠首次出现死亡的时间及之后每组小鼠死亡的速度都相近,直至每组均剩20%小鼠存活(第71小时)。之后,生理盐水组小鼠不再死亡,而NMN组、NMN~组小鼠陆续死亡殆尽。3组中位生存时间分别是:NMN给药组40 h、NMN~给药组45 h、生理盐水组37 h。可见,两家NMN产品作用相似,对LPS所致的内毒素休克无治疗效果,且与生理盐水组比较时均有加重内毒素休克死亡率的趋势,但是均无统计学意义(P=0.6447;P=0.9725)。该结果与上述NMN单次预防给药的实验结果相一致(图3图4)。

      图  7  不同厂家NMN预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    • 目前NMN是保健品领域的开发热点,以抗衰老以及各类疾病治疗作用为目的,在国内外已有不少人开始服用NMN[14]。但是NMN对内毒素休克的作用尚未知,对患有这种疾病的患者能否服用NMN亦不清楚。

      根据现有的研究报道,NMN在小鼠疾病模型其腹腔注射给药的有效剂量为10~600 mg/kg[2, 4]。本实验中,我们测试了不同NMN剂量尤其是300 mg/kg时对小鼠内毒素休克的治疗效果,结果显示,小鼠在LPS造模后0.5 h或造模前0.5 h单次给予不同剂量NMN均无明显改善生存率的作用,不具有治疗效果;甚至在LPS造模后两次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。为排除厂家生产工艺等因素,我们又同时用两个厂家生产的NMN产品进行实验,以重复上述结果,最终再次证明LPS造模后两次给予NMN确实可加速小鼠的死亡,增加死亡率。

      因此,本次实验结果表明,NMN在某些疾病尚未证明其安全性的情况下,应谨慎推广,尤其是内毒素休克的患者,应慎用甚至是禁用NMN治疗。

参考文献 (14)

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