基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

秦烨; 黄玮; 顾雨芳; 张慈安; 修丽娟; 唐继贵; 张凤; 刘煊

doi:10.12206/j.issn.1006-0111.202109029

基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029

秦烨^1,,
黄玮²,
顾雨芳³,
张慈安³,
修丽娟³,
唐继贵³,
张凤^3, ,,
刘煊^3, ,

1.
中国人民解放军中部战区总医院, 湖北武汉 430014
2.
上海市闵行区古美社区卫生服务中心, 上海 201102
3.
海军军医大学长征医院, 上海 200003

基金项目: 国家自然科学基金资助项目（No.81804008）

详细信息

作者简介:
秦　烨，硕士，主管药师，研究方向：医院药学、临床药学，Email：kiki.807@163.com

通讯作者: 张　凤，博士，副主任药师，研究方向：生药学、临床药学，Email：fengzhangky@aliyun.com; 刘　煊，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治消化系统疾病，Email：18616630816@163.com

中图分类号: R284

Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS

QIN Ye^1
,,
HUANG Wei²,
GU Yufang³,
ZHANG Ci’an³,
XIU Lijuan³,
TANG Jigui³,
ZHANG Feng^{3
, ,},
LIU Xuan^{3
, ,}

1.
the General Hospital of the Central Theater Command of the PLA, Wuhan 430014, China
2.
Gumei Community Health Service Center, Shanghai 201102, China
3.
Changzheng hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China

摘要: 目的探明消痰通腑方的主要化学成分，为方剂药效物质基础研究和临床治疗提供科学依据。方法采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOF/MS）对消痰通腑方化学成分进行鉴定，色谱条件为Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm），以 0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，柱温30 °C，流速0.3 ml/min，进样量1 μl，检测波长254 nm；质谱条件为电喷雾离子源（ESI），正、负离子全扫描模式采集质谱数据，根据对照品、自建质谱数据库和在线获得的化合物质谱数据库对色谱峰进行物质鉴定。结果初步鉴定出55个化合物，分别来自黄连、重楼、大黄、天南星、法半夏。结论本文所建立的UHPLC-Q-TOF/MS方法能系统、准确地鉴别消痰通腑方的化学成分，可为该方剂的质量标志物筛选和有效成分研究提供参考。
- 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱 /
- 化学成分 /
- 消痰通腑方
Abstract: Objective To rapidly explore the chemical components of Xiaotan Tongfu formula, and to provide scientific basis for the basic research and clinical treatment of the formula. Methods Analysis was performed on an Agilent 1290 ultra-performance liquid chromatography system coupled with an Agilent 6530 accurate quality Q-TOF/MS system, by using a Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm), with a gradient elution applying 0.1% aqueous formic acid solution and acetonitrile as a mobile phase. The flow rate was 0.3 ml/min. The column temperature was 30°C. The injection volume was 1 μl, and the detection wavelength was 254 nm. Mass spectrometry (MS) data were collected in both positive and negative ESI ion modes. Components in the formula were identified by using the in-house compound database, and comparing the retention time (tR), MS1 and MS2 data with the standard compounds, and the online compound MS database. Results A total of 55 compounds were identified from Coptis coptidis, Pseudomonas solani, Rhubarb, Araceae artemisiae and Pinellia chinensis. Conclusion The established UHPLC-Q-TOF/MS method could systematically and accurately identify the chemical components from Xiaotan Tongfu formula, and provided a reference for the quality marker selection and the research on the active ingredient.
- UHPLC-Q-TOF/MS /
- chemical components /
- Xiaotan Tongfu formula

嘧啶类化疗药物在肿瘤治疗中的地位越来越重要，其代表药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨更受到了广泛关注，体内二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)是此类药物代谢的限速酶之一^[1]，前瞻性评价DPD的总体活性有利于提高药物疗效及减少患者的毒副反应，对临床具有重要意义。内源性物质尿嘧啶(U)是体内DPD的天然底物，在此酶的催化下生成二氢尿嘧啶(UH₂)，并最终通过尿液排出体外。测定血浆中U和UH₂的含量，并通过(UH₂)/(U)比值计算，可从代谢物的角度评价DPD的活性^[2]。临床上常用评价DPD酶活性的方法是测定患者的基因表型，DPD的编码基因DPYD序列中包含了多达7 600个多态位点，使得DPD酶的活性在人群中是高度可变的^[3]。不同的突变位点及不同位点的组合给临床检测带来了极大的困难。到目前为止，也只有DPYD*2A的多态性被用于临床实践，用来筛选出5-氟尿嘧啶代谢严重不良的患者，避免严重的毒副反应^[4]。单一应用基因的多态性来评价DPD酶的活性在临床上存在一定的困难，基因的多态性并不能直接同下游的酶的活性联系起来，两者并没有完全对等的关系。基因需通过转录、翻译和蛋白的修饰之后才能发挥作用。基因多态联合下游代谢物的含量测定更能准确的评价DPD酶的活性^[5]。目前常应用液相色谱-串联质谱联用法对人血浆或干燥唾液中U和UH₂浓度进行检测^[6-11]，但所报道的方法均有一些复杂或难以重现。本研究成功的建立了一种灵敏、高效、准确、重现性好，且能同时测定人血浆中U和UH₂浓度的UHPLC-MS/MS方法，为体内DPD总体活性提供更客观有效的评价途径。

1. 材料与方法

1.1 仪器与耗材

1290-6460A超高效液相色谱-串联质谱仪，包含G4220A二元泵、G4226A自动进样器、G1316C柱温箱、MassHunter数据处理工作站（美国Agilent）；调速涡旋混合器（美国Labnet）；SK7200H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BSA124S-CW分析天平（德国赛多利斯）；5810R型低温高速离心机、移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

尿嘧啶、二氢尿嘧啶和氯尿嘧啶（内标）对照品（纯度>99%,大连美仑生物有限公司）；乙酸铵（美国赛默飞世尔科技）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇（色谱纯，德国默克公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）(上海博光生物科技有限公司)；生理盐水（长征医院药学部自制）。

1.3 色谱分离条件

色谱柱为Agilent poroshell 120 SB-Aq-柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相为5 mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速为0.3 ml/min，梯度洗脱：0～0.3 min，100% A；0.3～1.0 min，100%～10% A；1.0～2.5 min，10% A；柱温为30 ℃，洗脱时间2.5 min，进样量5 μl。

1.4 质谱分离条件

采用ESI离子源，多重反应监测（MRM）进行一/二级质谱分析，用于定量分析的检测离子为：U[M+H]⁺ m/z 113.0→40.1，检测模式为正离子模式；UH₂[M+H]⁺ m/z 115.0→55.1，检测模式为正离子模式；氯尿嘧啶（IS）[M-H]^- m/z 145.0→42.1，检测模式为负离子模式。雾化温度为300 ℃，雾化气压力为40 psi，干燥气流速为10 L/min，鞘气温度300 ℃，鞘气流速12 L/min，解离电压为4 000 V。

1.5 样本采集

选取8名血浆样品指标正常的成年人，于当日清晨8时空腹状态下静脉采血3 ml, EDTA-3K管抗凝，离心后分离上层血浆, 于−80 ℃冰箱冻存。

1.6 样本预处理

取100 μl样本，加10 μg/ml氯尿嘧啶（IS）10 μl，加乙酸乙酯3 ml，涡旋5 min，1710×g离心10 min，取上层有机相2.7 ml，45 ℃氮气挥干仪挥干，用10%甲醇溶液100 μl复溶，涡旋1 min，取上清液进样分析。

1.7 标准溶液配制

用含有3 %牛血清白蛋白作为空白基质代替血浆配置标准曲线样品。取100 μg/ml的尿嘧啶和二氢尿嘧啶各100 μl，加800 μl水，制成10 μg/ml标准混合液，置于−20 ℃备用。取10 μg/ml标准混合液适量，用3 %牛血清白蛋白稀释制成10、20、50、100、200、500、1000、1500 ng/ml系列浓度样品, 然后按照上述“1.6”项下样品的处理方法配制。

2. 结果

2.1 专属性考察

U和UH₂的出峰时间以及峰型良好，代替血浆经过前处理后，对待测组分的测定没有干扰，内标对分析物的测定也没有干扰，且能很好分离，结果见图1。

图 1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶及内标质谱多反应监测色谱图

A.空白BSA ；B.空白BSA添加内标样本；C.定量下限（LLOQ）标添样本。

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2.2 标准曲线和线性范围

U和UH₂的线性范围是10.0～1 500.0 ng/ml，以空白BAS中U和UH₂的浓度为横坐标（X），U和UH₂与内标化合物氯尿嘧啶的峰面积比为纵坐标（Y），进行最小二乘法加权（权重系数为1/χ²），U和UH₂的线性回归方程分别是Y=0.27X+0.0022、Y=0.58X+0.0380，r均>0.990，表明线性关系良好。

2.3 精密度和准确度

取定量下限、低、中、高标准添加血浆样本按照前处理方法进行处理，每个浓度样品平行制备5份进行分析，连续3 d重复操作，根据当天的标准曲线计算当天实测样本浓度，计算样本在低、中和高浓度下的日内、日间精密度和准确度，结果显示，精密度和准确度的偏差均在15%左右。准确度相对偏差在20%范围内时，最低定量下限精密度偏差不大于20%，结果见表1。

表 1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的精密度 (n=5)

分析物	标示浓度 (ng/ml)	日内			日间
分析物	标示浓度 (ng/ml)	测定浓度 (ng/ml)	精密度(CV%)	准确性(RE%)	测定浓度 (ng/ml)	精密度(CV%)	准确性(RE%)
尿嘧啶	10	10.2±0.38	3.74	2.58	10.12±0.78	7.70	1.18
	20	20.63±1.21	5.87	3.15	19.97±1.35	6.74	−0.16
	500	529.73±4.64	0.88	5.95	484.32±35.72	7.37	−3.12
	1000	1093.33±25.10	2.30	9.33	1098.25±25.16	2.29	9.82
二氢尿嘧啶	10	10.32±0.71	6.86	3.18	10.28±0.65	6.37	2.77
	20	19.98±2.19	10.95	−0.12	19.86±1.85	9.31	−0.72
	500	517.51±10.69	2.07	3.50	515.66±10.36	2.01	3.13
	1000	1079.83±17.91	1.66	7.98	1080.11±24.50	2.27	8.01

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2.4 基质效应和提取回收率

取低、高2个浓度的样本进行基质效应和提取回收率考察，结果显示，U、UH₂及内标氯尿嘧啶的基质效应和提取回收率良好，结果均较稳定，结果见表2。

表 2 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的基质效应和提取回收率

分析物	标识浓度(ng/ml)	基质效应		提取回收率
分析物	标识浓度(ng/ml)	平均基质效应	CV(%)	平均回收率	CV(%)
尿嘧啶	1000	101.00	6.15	94.98	9.01
尿嘧啶	20	99.99	3.63	100.01	7.64
二氢尿嘧啶	1000	85.72	2.07	106.47	1.58
二氢尿嘧啶	20	93.58	4.53	99.54	9.77

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2.5 样品稳定性

考察低、高2个浓度的血浆样品经历3次冷冻与解冻循环的稳定性、血浆样品在室温（25 ºC）放置6 h后经样品处理后稳定性和血浆样品经样品处理后室温放置24 h的稳定性，结果显示，3次冻融、6 h室温（25 ºC）条件下和24 h放置自动进样器中的稳定性均符合要求，结果见表3。

表 3 样品的稳定性(RE%)

分析物	冻融3次		室温放置6 h		置自动进样器24 h
分析物	低	高	低	高	低	高
尿嘧啶	100.71	98.34	93.49	106.60	108.20	107.99
二氢尿嘧啶	92.67	92.64	93.61	107.26	106.97	107.15

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2.6 样本检测

应用本研究所建立的方法，对8名健康成人的血浆样本测定分析，在样本实测过程中, 同时插入已知浓度的随行质控样本(QC样本), 随时监控样本测定的准确度。U和 UH₂浓度测定结果见图2。

图 2 实测8名健康成人内源性U和UH₂浓度值

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3. 讨论

3.1 空白基质的选择

U和UH₂是人体内常见的两种物质，且同核酸的代谢密切相关，由于U和UH₂均为人体内源性物质，故不能采用人源的基质进行方法学的开发及验证，通过查阅资料，选择了不含U和UH₂的3%牛血清蛋白作为基质进行方法学的开发^[12]。也有文献报道采用去除U和UH₂的人源血浆基质进行方法学实验^[9]，但基质的来源较珍贵，不适合方法的普及，所以选用3%牛血清蛋白作为替代基质。

3.2 色谱柱的选择

U因其特殊的化学性质，在大部分的色谱柱上均没有保留。U和UH₂的LogP值分别为−0.707和−0.840，有较强的亲水性，决定了其不保留的性质。在定量方法的开发过程中，先后采用了Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱，Agilent Zorbax Eclipse-C₁₈色谱柱，Waters Atlantis T₃色谱柱，Waters Xselect色谱柱，Waters Xbridge等色谱柱来进行条件摸索，但上述色谱柱对U和UH₂均没有保留。最后，采用Agilent Zorbax SB-Aq对U和UH₂进行定量分析，该色谱柱对强极性的化合物有较好的保留效果，同时，兼容100%的起始流动相也对保留产生了良好的结果。

3.3 样本预处理的优化

本研究还分别考察了几种常见的处理方法，包括甲醇和乙腈的蛋白沉淀、Waters Oasis HLB萃取板的固相萃取以及乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，二氯甲烷/三氯甲烷，环己烷进行的液液萃取，结果发现乙酸乙酯对U和UH₂的萃取效果较好，同时，还分别考察了5%、10%、20%、30%、40%、50%的异丙醇、乙酸乙酯溶液对U和UH₂的萃取效果，结果发现，单纯的乙酸乙酯对待测化合物具有较好的提取效率。提取回收率均高于90%，且RSD<10%。另外对3%牛血清蛋白的基质效应进行了考察，结果发现平均基质效应在85%～101%之间，RSD<7%，说明该前处理方法对于基质的清除较为彻底，测定结果稳定，没有明显的基质干扰。

本研究虽重在方法开发，收集的样本数量较少，但从测定的U和UH₂浓度分布来看DPD对内源性U的代谢存在个体差异，建议临床应用5-氟尿嘧啶及其卡培他滨筛查DPD总体活性^[12-13]，后续可进一步扩大样本数量进行深入研究。

4. 结论

本实验建立了一种快速，稳定，高灵敏度的UHPLC-MS/MS方法，可用于测定人体内源性物质U和UH₂的含量，从代谢物的角度评价DPD酶的活性，从而协助临床医生制定化疗药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨合理的用量，以较低的毒副反应获得最大的临床疗效。

图 1 混合对照品的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

A.正离子模式；B.负离子模式

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图 2 消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图

A.水提液正离子模式；B.水提液负离子模式；C.70%甲醇提取物正离子模式；D.70%甲醇提取物负离子模式

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表 1 消痰通腑方的鉴定分析结果

序号	质量	相对时间（min）	分子式	m/z（MS1）	部分特征离子峰	m/z (MS2)	差异(Δ ppm)	名称	来源药材	来源文献
1	174.1115	0.906	C₆H₁₄N₄O₂	175.1193	[M+H]+	175,158,116	−1.01	精氨酸	黄连*，制半夏	[8,11]
	174.1113	0.906		173.1036	[M-H]-	173,131	−2.40
2	192.0617	0.965	C₇H₁₂O₆	191.0552	[M-H]-	191,173,111	−4.71	奎宁酸	黄连	[8]
3	251.1022	0.996	C₁₀H₁₃N₅O₃	252.1093	[M+H]+	252,194,137	0.79	脱氧腺苷	重楼，制半夏	[11-12]
4	192.0281	1.189	C₆H₈O₇	230.9906	[M+K]+		1.73	柠檬酸	黄连	[12]
	192.0276	1.168		191.0203	[M-H]-	191,111,103	3.14
5	332.0767	1.394	C₁₃H₁₆O₁₀	333.0878	[M+H]+		4.61	没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷	大黄*	[13]
	332.0746	1.395		331.0672	[M-H]-	271,169	0.30
6	170.0216	1.396	C₇H₆O₅	171.0289	[M+H]+	171,155,153	0.29	没食子酸	大黄*	[13]
	170.0216	1.520		169.0143	[M-H]-	125,111	0.42
7	131.0945	1.508	C₆H₁₃NO₂	132.1018	[M+H]+	132,86	−0.76	异亮氨酸	天南星，制半夏	[11,14]
	131.0939	1.475		130.0869	[M-H]-		−3.84
8	165.079	2.273	C₉H₁₁NO₂	166.0864	[M+H]+	166,120	0.60	苯丙氨酸	天南星，制半夏	[11,14]
	165.0792	2.238		164.0723	[M-H]-		3.66
9	354.0946	3.752	C₁₆H₁₈O₉	353.0874	[M-H]-	353,191	−1.13	绿原酸	黄连*	[8]
10	204.0899	4.31-	C₁₁H₁₂N₂O₂	205.0973	[M+H]+	159,146	0.10	色氨酸	黄连*，制半夏	[8,11]
	204.0897	4.207		203.0819	[M-H]-	142,116	−0.69
11	326.1026	4.812	C₁₅H₁₈O₈	325.0919	[M-H]-	325,235,145	2.86	对香豆酸-O-葡萄糖苷	大黄	[13]
12	452.1327	5.06-	C₂₁H₂₄O₁₁	475.1211	[M+Na]+		0.00	儿茶素-O-葡萄糖苷 /表儿茶素-O-葡萄糖苷	大黄	[13]
	452.1319	4.993		451.1239	[M-H]-	451,137	−1.55
13	578.143	5.392	C₃₀H₂₆O₁₂	579.1505	[M+H]+		0.94	原花青素B2	大黄*	[13]
	578.1417	5.277		577.1345	[M-H]-	577,289	−1.23
14	290.0797	6.073	C₁₅H₁₄O₆	291.0867	[M+H]+	161	1.37	儿茶素	大黄	[13]
	290.0794	5.995		289.0721	[M-H]-	245,203,187	1.04
15	194.0586	6.076	C₁₀H₁₀O₄	217.0492	[M+Na]+	177，145	4.68	阿魏酸	大黄	[13]
16	654.1949	6.449	C₃₃H₃₄O₁₄	653.1871	[M-H]-	653,313,169	−0.77	4-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷	大黄	[13]
17	484.0858	6.826	C₂₀H₂₀O₁₄	483.078	[M-H]-	313,169	0.00	没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷	大黄	[15]
18	164.0470	8.434	C₉H₈O₃	163.0397	[M-H]-	163,155	−2.45	对香豆酸	大黄	[13]
19	564.1492	8.589	C₂₆H₂₈O₁₄	565.1559	[M+H]+	565,505	1.24	夏佛托苷	天南星	[16]
	564.1478	8.556		563.1418	[M-H]-		2.13
20	322.1093	8.578	C₁₉H₁₆NO₄+	323.1163	[M+H]+	265,189	3.40	格兰地新	黄连	[17]
21	284.0687	8.920	C₁₆H₁₂O₅	285.076	[M+H]+	242	1.05	大黄素甲醚	大黄	[18]
22	564.1871	9.192	C₂₇H₃₂O₁₃	587.1756	[M+Na]+	356,322	3.58	鼠李糖甘草苷	法半夏	[16]
23	234.0533	9.318	C₁₂H₁₀O₅	235.0604	[M+H]+	222,189	1.28	2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮	大黄	[13]
	234.0531	9.262		233.0458	[M-H]-		1.29
24	578.1641	9.686	C₂₇H₃₀O₁₄	577.1554	[M-H]-	577,146	−1.55	异佛莱心苷	法半夏	[11]
25	442.0921	9.820	C₂₂H₁₈O₁₀	443.0976	[M+H]+	393,123	4.81	表儿茶素没食子酸酯	大黄	[13]
	442.0901	9.820		441.0824	[M-H]-		0.23
26	550.1704	9.845	C₂₆H₁₈O₁₀	549.1614	[M-H]-	283,239	0	芹糖异甘草苷	法半夏	[10]
27	446.0856	9.912	C₂₁H₁₈O₁₁	469.0733	[M+Na]+	279,248	−1.71	大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷	大黄	[15]
	446.0848	9.845		445.0772	[M-H]-		−0.90
28	478.1471	9.978	C₂₃H₂₆O₁₁	479.1551	[M+H]+		0.63	异莲花掌苷	大黄	[15]
	478.1472	9.922		477.14	[M-H]-	313	−0.42
29	310.1058	10.092	C₁₅H₁₈O₇	333.0949	[M+Na]+		1.20	2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷	大黄	[13]
	310.1055	10.002		355.1035	[M+HCOOH-H]-	345	0.00
30	234.0897	10.684	C₁₃H₁₄O₄	235.097	[M+H]+	235	2.13	2-(2′-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮	大黄	[13]
	234.0895	10.631		233.0822	[M-H]-		1.29
31	862.1953	10.833	C₄₂H₃₈O₂₀	861.1888	[M-H]-	699,654	0.46	番泻苷 B	大黄	[13]
32	320.0893	11.572	C₁₉H₁₄NO₄	321.0991	[M+H]+	292,234	−1.90	黄连碱	黄连	[19]
33	399.1665	12.363	C₂₂H₂₅NO₆	422.1598	[M+Na]+	350,336,292	4.69	秋水仙碱	天南星	[20]
34	462.1161	12.313	C₂₂H₂₂O₁₁	461.1088	[M-H]-	461,331,169	−0.22	桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷	大黄	[9]
35	418.1257	13.394	C₂₁H₂₂O₉	417.1188	[M-H]-	255,213	−0.72	异甘草苷	法半夏	[10]
36	1048.5438	14.102	C₅₁H₈₄O₂₂	1071.5336	[M+Na]+	869,577	−0.93	重楼皂苷G	重楼	[21]
	1048.5457	14.078		1047.5386	[M-H]-		0.48
37	408.1422	14.182	C₂₀H₂₄O₉	431.1314	[M+Na]+	306,292	0.23	6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷	大黄	[13]
	408.1424	14.112		407.1352	[M-H]-		0.98
38	432.1053	14.372	C₂₁H₂₀O₁₀	455.0942	[M+Na]+	455,292	−1.54	芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷	大黄	[13]
	432.1060	14.317		431.0989	[M-H]-		1.16
39	1046.5283	14.384	C₅₁H₈₂O₂₂	1047.5356	[M+H]+	415,172	−1.43	polyphylloside III	重楼	[20]
	1046.5282	14.852		1091.5286	[M+HCOOH-H]-		0.55
40	416.1109	14.554	C₂₁H₂₀O₉	439.0999	[M+Na]+	439,336	−0.23	大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷	大黄	[13]
	416.1104	14.487		415.1032	[M-H]-		−0.72
41	286.048	15.273	C₁₅H₁₀O₆	287.0552	[M+H]+		0.74	木犀草素	黄连*	[8]
	286.0484	15.216		285.0412	[M-H]-	285,215,199	2.20
42	446.1213	15.932	C₂₂H₂₂O₁₀	469.1104	[M+Na]+	469,283	−0.21	大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷	大黄	[15]
	284.0687	15.865		283.0616	[M-H]-		1.41
43	450.1523	17.150	C₂₂H₂₆O₁₀	473.1413	[M+Na]+	473,230	−1.06	决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷	大黄	[15]
	450.1528	17.097		449.1469	[M-H]-		3.56
44	838.3969	17.208	C₄₂H₆₂O₁₇	837.3886	[M-H]-	661,351	−3.34	甘草皂苷G2	法半夏	[10]
45	822.4012	17.943	C₄₂H₆₂O₁₆	845.392	[M+Na]+		−3.17	甘草酸	法半夏*	[10]
	822.4031	17.914		821.3959	[M-H]-	351,193	−0.83
46	284.0328	18.384	C₁₅H₈O₆	283.0257	[M-H]-	239	3.18	大黄酸	大黄	[18]
47	884.4779	19.643	C₁₅H₂₀O₃	907.4652	[M+Na]+	685,292	−1.10	纤细薯蓣皂苷	重楼	[21]
	884.4762	19.622		929.4748	[M+HCOOH-H]-		−0.43
48	870.4622	19.768	C₄₄H₇₀O₁₇	893.4502	[M+Na]+	376,251	−0.34	重楼皂苷H	重楼	[21]
	870.4607	19.622		915.459	[M+HCOOH-H]-		−0.55
49	854.4664	19.773	C₄₄H₇₀O₁₆	877.4557	[M+Na]+	877,306	−1.31	重楼皂苷II	重楼	[21]
	870.4646	19.750		869.4546	[M-H]-		0.69
50	738.4219	19.932	C₃₉H₆₂O₁₃	783.4170	[M+HCOOH-H]-	783,146	−0.26	重楼皂苷VI	重楼	[21]
51	270.0537	20.820	C₁₅H₁₀O₅	269.0460	[M-H]-	225,146	1.86	芦荟大黄素	大黄	[18]
52	868.482	22.136	C₄₅H₇₂O₁₆	891.4746	[M+Na]+	725,415	3.70	薯蓣皂苷	重楼	[22]
	868.482	22.104		913.4809	[M+HCOOH-H]-		0.77
53	854.4668	22.323	C₄₄H₇₀O₁₆	877.4572	[M+Na]+	196,140	0.43	重楼皂苷I	重楼*	[21]
	854.4655	22.297		899.4609	[M+HCOOH-H]-		−1.07
54	254.0577	22.790	C₁₅H₁₀O₄	255.0647	[M+H]+	196	−1.96	大黄酚	大黄	[18]
55	576.4428	27.329	C₃₅H₆₀O₆	599.4282	[M+Na]+	429,355	6.67	胡萝卜苷	天南星*	[23]
	576.4374	27.263		621.4349	[M+HCOOH-H]-		−2.68
注：*表示在水提液中未检测出的化合物

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消痰通腑方应用于治疗胃肠癌前病变患者已有十余年，能够延缓胃肠癌前患者向肿瘤的进展，同时对脓毒症等危重症患者的胃肠功能恢复有较好疗效^[1-5]。该方剂由法半夏、生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连六味中药配伍组成，法半夏、制大黄为主药，旨在消痰止呕、泄下通俯之意。半夏乃燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之良药，法半夏为半夏的炮制品，倍其化痰之力；制大黄为生大黄炒制，泻下力缓，能通达肠腑而推陈出新，又不伤正气，两者合用，既燥湿化痰，又缓消积滞，达消痰通腑之功。黄连既能泻脾胃之火，又能燥痰饮之湿。

目前对该方剂的研究集中在药理功效方面，尚无对该方剂化学成分、有效成分的相关研究报道。寻找中药复方的临床药效基础，是长期困扰中医人临床研究的难点。超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOF/MS）是一种简便、快速、高灵敏度的现代分析技术，能够提供化合物的精确分子量、元素组成以及离子碎片信息（MS1和MS），广泛用于中药化学成分的快速分析和鉴别^[6-7]。本研究拟采用此方法对消痰通腑方的化学成分开展研究，为其质量标志物筛选和探明药效物质提供实验依据。

1. 材料

Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱和 6530型四极杆-飞行时间串联质谱仪（美国安捷伦）；CPA255D型1/10万电子天平(德国Sartorius)；Eppendorf mini spin离心机、Eppendorf 5430r离心机(德国Eppendorf)；Lyovapor L-200冷冻干燥机(瑞士BUCHI)；Milli-Q型纯水系统(美国Millipore)；SK7200H型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

甘草酸（批号：F610137）、重楼皂苷I（批号：F278755）、重楼皂苷II（批号：F297228）、重楼皂苷VI（批号：F483230）、薯蓣皂苷（批号：F543583）、重楼皂苷H（批号：F297228）、奎宁酸（批号：F435708）、柠檬酸（批号：F594530）、异佛莱心苷（批号：F109963）、芹糖异甘草苷（批号：F667242）购自上海一飞生物科技有限公司，异佛莱心苷纯度为95%，其余对照品纯度均≥98%；芦荟大黄素（批号：D1226AS）、大黄素甲醚（批号：O1026AS）、大黄酚（批号：D0316AS）、大黄酸（批号：N1107AS）购自大连美仑生物科技有限公司，纯度均≥98%；水为去离子水；甲醇、乙腈、甲酸（质谱纯，德国E. Merck公司）；其余试剂均为分析纯。

消痰通腑免煎剂由法半夏、生大黄、制大黄等药物组成。由江阴制药厂生产，长征医院监制，生产批号：20200420。

3. 讨论

中药方剂在中医临床实践中形成了以汤剂为主的口服给药方式，药材煎煮制备获得复方时是否会导致化学成分的改变，消痰通腑方免煎剂是否也需要对上述化合物进行检测来确定方剂的质量均未知。再有，中药方剂具有多成分、多靶点、多途径、整合调节的作用特点，因此，有必要对消痰通腑方所含所有药材的化学成分群进行分析，初步确定其化学成分特征，为后期研究和临床应用提供数据参考。

为了实现化合物的高效、快速提取，首先考察了不同的超声提取溶剂（水、70%及100%甲醇溶液）、提取时间（30、45 和60 min）、样品与溶剂的比例（1:5、1:10和1:20），结果表明，以10倍溶剂即50 ml的75%甲醇溶液超声提取30 min为最佳样品制备方法。为了获得分离效果好、总离子流强的色谱图，选择了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水（含0.1%甲酸）和乙腈-水（含0.1%甲酸）流动相体系进行分析。结果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液组成的流动相在正、负离子扫描模式下均表现出良好的分离效果和丰富的信号响应。除此以外，本研究还考察了不同流速（0.3、0.4 和0.5 ml/min）和不同柱温（25、30 和35 ℃）对于分析效果的影响。结果显示，当柱温在30 °C，流速为0.3 ml/min时，色谱峰峰形尖锐、色谱图基线稳定，柱压平稳。

本研究采用的分析方法具有快捷、简便、易行，样品用量小和高通量等特点，且样品前处理简单，所建立的方法可用于快速鉴别消痰通腑方免煎剂的化学成分。所鉴定的化合物中包括多数具有抗炎抗肿瘤等活性的化合物。例如，已有文献表明，重楼皂苷类成分如重楼皂苷I可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移等发挥抗肿瘤作用^[24-25]；天南星中的夏佛托苷可以通过诱导自噬激活发挥抗肿瘤细胞增殖作用^[26]；黄连碱作为黄连中的主要成分之一，具有抗真菌、胃黏膜保护、细胞毒等一些药理活性^[27]；含大黄的方剂具有辅助放、化疗增敏减毒的功效，所含化合物大黄酸、大黄素甲醚在抗炎、抗肿瘤等方面都具有显著效果^[28]。

综上，本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技术开展消痰通腑方免煎剂中的化学成分分析，丰富了全方的物质基础研究，为进一步明确其质量控制标志物和药效物质研究提供了科学依据。

参考文献 (28)

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基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029

作者简介: 秦 烨，硕士，主管药师，研究方向：医院药学、临床药学，Email：kiki.807@163.com

通讯作者: 张 凤，博士，副主任药师，研究方向：生药学、临床药学，Email：fengzhangky@aliyun.com; 刘 煊，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治消化系统疾病，Email：18616630816@163.com

Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS

1. 材料与方法

1.1 仪器与耗材

1.2 药品与试剂

1.3 色谱分离条件

1.4 质谱分离条件

1.5 样本采集

1.6 样本预处理

1.7 标准溶液配制

2. 结果

2.1 专属性考察

2.2 标准曲线和线性范围

2.3 精密度和准确度

2.4 基质效应和提取回收率

2.5 样品稳定性

2.6 样本检测

3. 讨论

3.1 空白基质的选择

3.2 色谱柱的选择

3.3 样本预处理的优化

4. 结论

计量

出版历程

基于UHPLC-Q-TOF/MS技术快速分析消痰通腑方化学成分

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029

1. 中国人民解放军中部战区总医院, 湖北 武汉 430014 2. 上海市闵行区古美社区卫生服务中心, 上海 201102 3. 海军军医大学长征医院, 上海 200003

作者简介: 秦 烨，硕士，主管药师，研究方向：医院药学、临床药学，Email：kiki.807@163.com

通讯作者: 张 凤，博士，副主任药师，研究方向：生药学、临床药学，Email：fengzhangky@aliyun.com; 刘 煊，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治消化系统疾病，Email：18616630816@163.com

English Abstract

Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS

1. the General Hospital of the Central Theater Command of the PLA, Wuhan 430014, China 2. Gumei Community Health Service Center, Shanghai 201102, China 3. Changzheng hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China

全文HTML

2.1. 供试品溶液的制备

2.2. 对照品溶液制备

2.3. 化合物分析库的建立和数据分析

2.4. 色谱条件

2.5. 质谱条件

2.6. 化合物的鉴定

目录

全文HTML

2.1. 供试品溶液的制备

2.2. 对照品溶液制备

2.3. 化合物分析库的建立和数据分析

2.4. 色谱条件

2.5. 质谱条件

2.6. 化合物的鉴定

作者简介:
秦　烨，硕士，主管药师，研究方向：医院药学、临床药学，Email：kiki.807@163.com

通讯作者: 张　凤，博士，副主任药师，研究方向：生药学、临床药学，Email：fengzhangky@aliyun.com; 刘　煊，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治消化系统疾病，Email：18616630816@163.com

1. 中国人民解放军中部战区总医院, 湖北武汉 430014

2. 上海市闵行区古美社区卫生服务中心, 上海 201102

3. 海军军医大学长征医院, 上海 200003

作者简介:
秦　烨，硕士，主管药师，研究方向：医院药学、临床药学，Email：kiki.807@163.com

通讯作者: 张　凤，博士，副主任药师，研究方向：生药学、临床药学，Email：fengzhangky@aliyun.com; 刘　煊，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治消化系统疾病，Email：18616630816@163.com

1. the General Hospital of the Central Theater Command of the PLA, Wuhan 430014, China

2. Gumei Community Health Service Center, Shanghai 201102, China

3. Changzheng hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China