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随着全球经济的高速发展和科技的不断进步，核工业在军事、医疗等领域得到全面发展，但伴随而来的是对从业人员和附近居民造成严重的辐射危害。
辐射是指能量以电磁波或粒子的形式向外传播的现象，可分为电离辐射和非电离辐射。拥有足够高能量而使原子电离的辐射为电离辐射，它包括X射线、α射线、β射线、γ射线等，具有潜在的致癌性。非电离辐射能量较低，不会电离物质而会使物质内粒子运动，包括红外线、紫外线和微波等[1]。
辐射可引起全身性的放射病，几乎所有系统、器官均可发生病理性改变，其中以神经系统、消化系统和造血器官的改变最为明显，会诱发心血管疾病、糖尿病甚至癌突变。辐射对机体的损伤可分为急性和慢性放射性损伤。短时间内接受高剂量的照射，可引起机体的急性损伤，常见于核事故和放射治疗患者。剂量低于1 Gy时少数会出现轻微症状，剂量在1~10 Gy时，会出现造血型急性放射病；剂量超过10 Gy，会出现高致死率[2]。而长期接受超剂量的全身或局部照射，可引起慢性放射病，如皮肤损伤、造血障碍、白细胞减少、生育功能受损等。此外，辐射还能直接导致视力下降、视网膜脱落，诱发孕妇流产、不育、畸胎、儿童发育不足等[3]。
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抗辐射药物是指在辐射前或后给予药物预防或治疗，可减轻或修复辐射损伤的药物。现有的抗辐射化学合成药物主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物[5]，因其毒副作用较大而应用受限，近年来天然产物因其毒副作用小、多成分多靶点的独特优势受到广泛的关注。目前认为抗辐射天然产物的作用机制主要有以下4个方面。
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辐射损伤可破坏DNA分子的结构与功能，导致DNA碱基破坏、DNA分子间交联、DNA双链或单链断裂、糖基破坏等。此外，辐射还可导致细胞周期改变以及DNA合成抑制，直接影响细胞增殖。抗辐射天然产物可通过减轻或抑制辐射致细胞周期的缩短，避免或修复DNA损伤而起辐射防护作用。
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人体产生的80%自由基是由水分子组成的。辐射可引起水分子生成强活性的氧化自由基，主要包括·OH、
${\rm{O}}^-_2 $ 、H2O2、·NO等，其中，·OH氧化性最强，可导致组织细胞产生脂质过氧化物[6]。人体由于自由基的产生造成的破坏主要有3个方面：破坏细胞膜；使血清抗蛋白酶失去活性；损伤基因导致细胞变异，如自由基和生物大分子的结合，导致DNA主链断裂或碱基破坏，通过氧化性降解使得多糖链断裂，形成脱氢自由基，破坏细胞膜上的多糖结构[7]。现代研究表明，大多数抗辐射天然产物具有清除多种自由基作用，能降低氧化酶活性，抑制细胞过氧化物的产生。 -
辐射主要损伤骨髓、胸腺和脾脏等免疫器官以及淋巴细胞等。崔玉芳等[8]发现辐射对免疫系统的损伤主要表现为两个特点——早期损伤严重和后期恢复缓慢。在辐射早期脾脏T、B淋巴细胞数量迅速减少，丝裂原反应明显降低，而在受照射1年后，小鼠的免疫组织和外周血淋巴细胞凋亡率与正常水平相比仍较高，小鼠T淋巴细胞免疫功能仍未恢复。促进淋巴细胞增殖，抑制胸腺和脾脏细胞凋亡等是抗辐射损伤的有效途径。
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造血组织是辐射的敏感组织，机体受到辐射后，造血细胞会出现功能低下甚至死亡现象，其中，造血干细胞、粒系祖细胞、红系祖细胞是辐射攻击的主要靶细胞，外周血细胞的数量随着照射剂量的增加而减少，其形态和功能也会随之发生改变[1]。因此，改善造血微环境，促进白细胞增殖，修复骨髓造血功能等有助于保护造血系统，修复辐射损伤。
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天然多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。它们是一类具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗炎、抗疲劳、抗衰老作用的生物大分子[9]。关于多糖的抗辐射作用的机制尚不清楚，一般认为与多糖的抗氧化，对造血系统的保护，引起免疫系统的效应增强以及诱导产生某些细胞因子等作用有关。
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研究表明，大多数植物多糖有较为显著的抗辐射作用，能提高辐射诱导损伤的防护能力，改善辐射诱导的氧化损伤。其辅助保护辐射损伤的作用机制复杂，一般推测与其修复DNA损伤、消除自由基、增强免疫功能等有关[10]。张乃珣等[11]研究发现，酸性黑木耳多糖(AAP)和红松球果多酚的联合使用可以有效地清除体内自由基，降低自由基对体内DNA造成的损伤，显著提高对60Co γ射线诱导氧化损伤的防护能力。此外，白海娜等[12]发现原花青素与黑木耳多糖（AAP-4）同样有协同防护辐射诱导氧化损伤的作用。徐俊杰等[13]研究山药多糖对低强度连续微波辐射致小鼠免疫系统功能损伤的保护作用，发现正常动物组与辐射损伤组相比，不同剂量(200、400、800 mg/kg)的山药多糖可提高巨噬细胞的吞噬指数、T淋巴细胞的增殖刺激指数和血清IgG水平，并降低血清IL-4水平。表明山药多糖能明显改善低强度连续微波辐射对小鼠免疫系统的损害。胡淼等[14]报道，预先给药黑大蒜多糖（150~600 mg/kg）可减轻X射线辐射对小鼠免疫器官和全血白细胞、血小板的影响，提高脾脏的代偿性造血增殖能力，提高抗氧化酶水平，具有较好的辐射防护作用。Zhang等[15]发现大黄多糖(RTP)通过调控Nrf2及其下游蛋白HO-1，显著降低细胞凋亡和炎症因子，从而显著改善辐射诱导的肠道损伤。
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国内外学者从动物体内提取出不同种类的多糖，尤其是海洋动物，如虾蟹动物的甲壳质、河蚌多糖、鲍鱼多糖等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等生物活性[16]。
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研究发现微生物中，尤其生活在高压、高辐射环境中的藻类，其多糖有着较为特殊的结构与生理特性，大多有较好的抗辐射效果。Kim等[17]在探讨低分子量岩藻多糖（LMF）对中波紫外线诱导的光老化的保护作用时发现，持续15周的中高剂量（2.0、1.0 mg/cm2）LMF治疗可对受到中波紫外线照射的小鼠光老化起到明显的保护作用，可抑制皱纹形成，皮肤水肿以及中性粒细胞在光老化病灶上的聚集。杨凯业等[18]报道称铁皮石斛多糖、褐藻多糖、灵芝多糖、竹荪多糖在50 mg/L的质量浓度下的复合作用可抑制紫外线辐射诱导的皮肤细胞光老化作用。
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植物多酚是广泛存在于植物体内的一类次生代谢产物，包括黄酮类、花色苷类和酚酸类。研究表明，多酚类化合物含有多个酚羟基，具有显著的清除自由基能力，能减轻自由基对机体的伤害，从而起到辐射防护作用[19]。
Lekmine[20]等评价用阿尔及利亚南部特有植物Astragalus gombiformis Pomel地上部分制备的丁醇提取物的药理活性，采用防晒系数(SPF)等评价Astragalus gombiformis Pomel的光保护作用和抗氧化能力，结果表明提取物（SPF=37.78±0.85，SPF值>30的皮肤保护产品被认为是有效的紫外线辐射过滤器）具有良好的紫外线吸收能力，推测主要与其中的黄酮类和酚酸类化合物（主要为水飞蓟素、迷迭香酸、槲皮苷和山柰酚）的紫外吸收能力和抗氧化防御能力有关，具有潜在的辐射防护能力。
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黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物是一类从中草药中提取的天然产物，被认为是一种有效的抗氧化剂，可以调控炎症介质的调节酶或转录因子，通过与DNA的相互作用影响氧化应激，增强基因组稳定，具有神经保护和辐射保护作用[21]。
金银花素(5,7-二羟基黄酮)是从蜂胶、蜂蜜和几种植物中提取的一种黄酮类化合物。Mansour等[22]发现给药金银花素(50 mg/kg）可提高受5 Gy红外线照射雄性Wister大鼠大脑中丙二醛(MDA)水平和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性，这提示金银花素具有辐射致脑损伤的神经保护作用。Kale等[23]通过组织病理评估，显示槲皮素可显著减少辐射诱导的神经元变性和炎症浸润，揭示了槲皮素对辐射致脑损伤的神经保护作用。
Li等[24]证实芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）能够一定程度上修复UVB诱导的人表皮角质形成细胞(HEKs)的毛细血管扩张性共济失调的异常突变，从而抑制HEKs细胞凋亡和坏死，表明芹菜素对中波紫外线损伤的HEKs具有新型的保护作用。Prasad等[25]报道水飞蓟宾（silibinin）可以防止中波紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体的形成，通过增加抑癌基因p53水平进而促进DNA修复和（或）启动受损细胞的凋亡。
曲克芦丁（TRX）是一种黄酮类化合物，广泛存在于茶叶、咖啡、谷类食品、各种水果和蔬菜中，具有抗辐射作用，Panat[26]对其清除自由基的能力和抗细胞凋亡活性进行了系统的研究。TRX能清除超氧物、NO和其他模型稳定的自由基，从而保护受辐照的细胞。
有些英国科学家研究发现，每天喝两杯绿茶、吃一个橘子，就可以帮助“电脑族”们抵御计算机辐射[27]。而儿茶素类化合物作为茶叶中的主要功能成分，具有显著的抗辐射作用。茶树中儿茶素类化合物主要包括，儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯及表没食子儿茶素没食子酸酯8种单体。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯生理活性较为突出，具有抗氧化性和抗细胞凋亡活性，可预防不同刺激对组织的损伤。Korystova等[28]研究发现在对辐射诱导的大鼠主动脉损伤的预防作用中，发现红茶比绿茶更加有效，即使浓度低于1 g/100 ml的红茶也能够有效预防红外线对主动脉造成的损伤。红茶中的儿茶素含量明显低于绿茶，但两种茶中的黄酮醇含量几乎相等。儿茶素、表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯可增加大鼠主动脉的氧化应激，而黄酮醇可降低辐射诱导的氧化应激。因此，红茶药效的提高是由于儿茶素含量的降低使黄酮醇的正向调节作用更大程度地得到发挥所致。
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酚酸类化合物系指具有多羟基的芳香羧酸类化合物，主要以糖、酯以及有机酸的形式存在于植物中，现代研究表明酚酸类化合物能够清除体内多种自由基，具有良好的抗氧化活性和潜在的辐射防护作用。
Milton等[29]报道，鱼腥草细胞培养物的甲醇提取物因细胞产生酚类次生代谢物而具有潜在的光保护作用，结果显示鱼腥草细胞的甲醇提取物(310～2500 g/ml)能够显著提高受紫外线照射的3T3-Swiss白化成纤维细胞活力。提取物的LC-MS化学分析表明，其总酚和总酚酸含量（主要为没食子酸和毛蕊花苷）较高，具有特征的紫外吸收峰(第一和第二波段的峰值分别为294和330 nm)，能够抵消紫外线对皮肤的有害影响。
Abozaid等[30]报道肉桂酸纳米颗粒可作为一种辐射诱导胰腺炎的氧化还原信号通路的调节剂，首先用I-精氨酸和γ射线诱导大鼠患急性胰腺炎，口服肉桂酸纳米颗粒(CA-NPs)后，急性胰腺炎的严重程度及血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低。同时，胰腺组织的MDA水平显著降低，谷胱甘肽的消耗显著恢复，caspase-3水平降低，可明显改善胰腺组织损伤或凋亡。因此，肉桂酸纳米颗粒对辐射诱导的急性胰腺炎具有较好的治疗潜力。Liu等[31]研究发现姜黄素（Cur）对长波紫外线辐射诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）光老化具有一定的保护作用。Zhang等[32]发现白藜芦醇通过激活Sirtuin1 (Sirt1，组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，可减轻炎症损伤)减轻辐射诱导的小鼠肠道损伤。周瑞芳等[33]研究表明，丹酚酸B可减轻γ射线辐射诱导的造血系统损伤和骨髓细胞的DNA及蛋白质的减少，恢复小鼠免疫系统的辐射损伤，具有显著的抗γ射线辐射作用。
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花色苷是花青素和糖以糖苷键结合而成的一种化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，起到保护植物抗氧化的作用。其抗氧化和消除自由基能力可防护不同射线辐射，能够发挥独特的生理效应。
Fernandes等[34]发现花色苷家族成员（矢车菊色苷、锦葵色苷及其衍生色素）具有促进皮肤维持健康的活性，研究表明大部分化合物能够抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌菌株的生长繁殖，减少HEKs和HDF活性氧的产生，抑制皮肤降解酶的活性且无细胞毒性作用，具有一定的紫外线过滤作用。
Targhi等[35]研究黑桑花色苷对大鼠肝组织和骨髓细胞的辐射防护作用，以 60Co γ射线远距放射（3 Gy和6 Gy）建立大鼠辐射损伤模型，随后腹腔注射200 mg/kg的黑桑花色苷，结果显示黑桑花色苷可降低大鼠肝脏MDA和SOD的水平，降低γ射线照射对大鼠骨髓细胞和肝脏的遗传毒性和细胞毒性，有潜在的辐射保护作用。
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皂苷（saponin）类化合物是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，存在于人参、桔梗、刺五加等许多中草药中，在增强免疫、抗肿瘤、抗炎等方面具有显著的生物活性。研究表明人参皂苷的抗辐射机制与清除自由基、抗氧化活性，与其对心血管系统、免疫系统的保护作用以及对细胞凋亡的抑制作用有关[36]。
Wen[37]等研究黄芪甲苷对中波紫外线诱导的大鼠真皮成纤维细胞早衰的抗光老化作用，结果显示黄芪甲苷不仅能通过激活细胞外调解蛋白激酶ERK和丝裂原活化蛋白激酶p38信号抑制中波紫外线诱导的胶原-I的降解，还通过激活细胞自噬增加胶原-I的积累，从而保护中波紫外线诱导的光老化细胞，表明黄芪甲苷在抗光老化治疗中的潜在优势。
Wang等[38]分析柴胡皂苷-d (SSd)对肝癌细胞自噬活性和放射敏感性的影响，SSd通过抑制mTOR磷酸化促进肝癌细胞自噬，增加辐射诱导的肝癌细胞凋亡并且抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的放射增敏治疗提供了一种可能的途径。
Kim等[39]研究知母皂苷A-III（TA-III）对中波紫外线诱导的HEKs和HDF侵袭效应的保护作用时发现，TA-III在非细胞毒性剂量下（50 nmol/L）以剂量依赖的方式抑制中波紫外线诱导的环氧合酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）转录和蛋白表达水平，降低中波紫外线诱导的原代皮肤细胞的侵袭，组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和COX-2在HEKs中的过度表达，表明其具有光保护剂的开发潜力。
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除了上述多糖类、多酚类以及皂苷类化合物，天然产物中的许多其他化合物同样具有良好的辐射防护作用，包括维生素类、蛋白类、无机成分、稀有元素等。
Rostami等[40]研究发现预先摄入硒和维生素E能够对X射线辐射引起的遗传损害起到一定的防护作用。段一凡等[41]报道茶叶籽不饱和脂肪酸对中波紫外线诱导的HEKs损伤具有保护作用。Jaisin等[42]研究发现胡椒碱（10～40 µmol/L）预处理可抑制中波紫外线诱导的炎症信号通路，减弱HEKs的细胞毒性并且抑制其凋亡。这提示胡椒碱的抗炎作用能保护HEKs免受中波紫外线辐射的损伤，可作为一种紫外线辐射诱导皮肤炎症的有效治疗手段。
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近年来，国内外越来越重视辐射损伤的防护，抗辐射药物的寻找也变得十分紧迫。而与传统的化学合成药物相比，天然来源的药物具有活性高、选择性强、毒副作用小等优点，作为抗辐射药物有着广阔的开发前景。但是抗辐射天然产物的筛选方法耗时耗力，因此建立高通量、高专属性的抗辐射天然产物筛选方法意义重大。此外，对已有的天然产物进行结构改造，以期获得抗辐射活性更高或毒副作用更小的衍生物以及提高抗辐射天然产物的提取纯化效率等皆是未来抗辐射天然产物研究的重点和难点。
Research progress of anti-radiation natural products
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摘要: 随着科技的高速发展，基于核物理的诊断技术和放疗技术在医学中得到广泛应用，但同时也会给人体造成不同程度的损伤。因此，研究和开发能够预防以及治疗辐射损伤的药物意义重大。综述抗辐射天然产物如多糖、黄酮、酚酸、皂苷等的研究进展，并对其研究前景进行展望，为其进一步开发提供参考。Abstract: With the rapid developments of science and technology, the diagnosis technology based on nuclear physics and radiotherapy technology are widely used in medicine, but radiation at the same time could have different levels of damage to human body. Therefore, it is of great significance to research and develop drugs that can prevent and treat radiation damage. The research progresses and prospects of radiation-resistant natural products, such as polysaccharides, flavonoids, phenolic acids, saponins and so on, were reviewed in this paper in order to provide a reference for further developments.
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Key words:
- radiation /
- natural products /
- polysaccharides /
- flavonoids /
- phenolic acids /
- saponins
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复方玉红栓是长海医院特色医院制剂，处方由磺胺嘧啶、盐酸达克罗宁、苦参、槟榔、松香、紫草、白芷等中西药组成，临床使用有30多年历史。该药具有消炎[1]、止痛[2]及止血[3]等作用，用于治疗混合痔内出血、内痔水肿脱垂、单纯内痔出血等，临床疗效显著，但目前质量标准仅对2种化学药盐酸达克罗宁和磺胺嘧啶进行鉴别和含量测定，其他成分未制定质量标准，有待提升。本研究建立了苦参、松香、白芷的TLC鉴别方法，同时建立测定磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁含量的HPLC方法，实现更好地控制本品质量、提高疗效稳定性和可靠性、增强临床使用的安全性目的。
1. 材 料
1.1 仪器
岛津高效液相色谱仪（包括LC-20AD泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、CBM-20A控制器和LC solution工作站，日本岛津公司）；Goodsee-20E型薄层成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；BT124S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；UV2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；DL-720A 超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；硅胶G薄层板（上海东方药品科技实业有限公司，规格10 cm×10 cm，批号：20190426）；硅胶GF254薄层板（上海东方药品科技实业有限公司，规格10 cm×10 cm，批号：20141129）。
1.2 试药
复方玉红栓（本院自制，规格：每粒重1.4g，磺胺嘧啶25 mg、含盐酸达克罗宁5 mg；包装：7粒/盒，批号：200518、190531、190225），松香酸（批号A25F6C1，含量大于90%，上海源叶生物科技有限公司），磺胺嘧啶（批号100026-201404，含量99.7%），盐酸达克罗宁（批号100423-201102、含量99.8%），苦参碱（批号110805-201709，含量99.6%），白芷药材（批号120984-200602），苦参药材（批号121019-201604）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余所用化学试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
2. 方法和结果
2.1 TLC鉴别
2.1.1 白芷
取本品7粒（批号200518），加乙醇200 ml，水浴加热使溶解，放冷至室温，抽滤，滤液挥至无醇味后，加0.1 mol/L盐酸溶液100 ml，加热使溶解，静置分层，取上层溶液，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液100 ml，萃取，取下层溶液，用盐酸调节pH值至5，加石油醚（30～60 ℃）50 ml萃取2次[4]，合并石油醚层挥干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作供试品溶液；同法制备缺白芷的阴性溶液；另取白芷药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取上述3种溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙醚（6∶5）为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照在此相应位置无斑点。薄层色谱图见图1A。
图 1 复方玉红栓的TLC图a1.白芷阴性对照溶液；a2.白芷供试品溶液；a3.白芷对照药材溶液；b1.松香供试品溶液；b2.松香阴性对照溶液；b3.松香酸对照品溶液；c1.苦参供试品溶液；c2.苦参对照药材溶液；c3.苦参碱对照品溶液；c4.苦参阴性对照溶液。2.1.2 松香
取本品1粒（批号200518），加乙醇100 ml[5]，水浴加热使溶解，冷藏1 h，取出过滤，取滤液挥干，残渣加乙醇2 ml使溶解，取上清液作供试品溶液；同法制备缺松香的阴性溶液；另取松香酸对照品适量，加乙醇溶解制成每1 ml含松香酸1 mg的溶液，作对照品溶液。取上述3种溶液各10 µl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶2∶0.1）为展开剂[6]，展开，取出晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照在此相应位置无斑点。薄层色谱图见图1B。
2.1.3 苦参
取本品14粒（批号200518），加0.1mol/L盐酸溶液100 ml，水浴加热使溶解，分取下层溶液，同法操作2次合并下层溶液，加2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9，加三氯甲烷50 ml萃取2次[7]，取三氯甲烷层挥干，残渣加乙醇2 ml使其溶解，作供试品溶液；同法制备缺苦参的阴性溶液；另取苦参药材1 g，同法制成对照药材溶液；取苦参碱适量，加乙醇溶解制成每1 ml含苦参碱0.5 mg的溶液，作对照品溶液。取上述4种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（5∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出晾干，喷以稀碘化铋钾试液显色[8]，置日光灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点，阴性对照在此相应位置无斑点。薄层色谱图见图1C。
2.2 HPLC法同时测定磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁含量
2.2.1 色谱条件
SHIMADZU C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇(A)-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(B)，用磷酸调节pH值至3.3，梯度洗脱（0～6.0 min，25 % B；6.0～25.0 min，50 % B；25.0～30.0 min，25 % B）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：280 nm；进样量：20 μl。
2.2.2 溶液制备
（1）对照品溶液：取磺胺嘧啶对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含磺胺嘧啶0.25 mg的溶液，作为储备液1；取盐酸达克罗宁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含盐酸达克罗宁0.25 mg的溶液，作为储备液2；精密量取储备液1和储备液2适量，加流动相稀释制成每1 ml含磺胺嘧啶50 μg、盐酸达克罗宁10 μg的混合对照品溶液。
（2）供试品溶液：取本品10粒（批号200518），切碎，取约0.7 g（相当于磺胺嘧啶12.5 mg，盐酸达克罗宁2.5mg），精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇25 ml，90 ℃水浴加热5 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，冷藏静置1 h，滤过，取续滤液放至室温，再精密量取续滤液5 ml，置25 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度、摇匀，作供试品溶液。
（3）阴性样品溶液：根据处方制备不含磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的阴性样品，再按（2）项下方法制成阴性对照溶液。
2.2.3 专属性试验
分别取“2.2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液各20 μl注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图2。结果表明，在混合对照品色谱相应位置上，供试品溶液色谱图中均具有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照液在此处均无吸收峰，表明检验方法的专属性良好。
2.2.4 线性关系考察
分别精密量取“2.2.2”项下（1）的储备液1和储备液2适量，用流动相稀释，配制磺胺嘧啶系列浓度为12.40、24.80、49.60、74.40、99.20 µg/ml，盐酸达克罗系列浓度2.56、5.12、10.24、15.36、20.48 µg/ml的混合对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件，进样20 µl，记录峰面积，以对照品浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归分析，得到磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的回归方程分别为A盐酸达克罗宁=77680 c+44018（r=0.999 9），线性范围2.56～20.48 µg/ml；A磺胺嘧啶=72528 C+2862.9（r=0.999 9），线性范围12.40～99.20 µg/ml。结果表明磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁在相应范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验
精密吸取"2.2.2"项下（1）的混合对照品溶液20 µl，按"2.2.1"项下色谱条件重复进样6次；同法操作，每天进样1次，共进样6 d，分别记录，按峰面积计算得磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的日内精密度分别为0.07 %和0.58 %（n=6），日间精密度分别为1.60 %和1.65 %（n=6）。结果表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验
分别取同一供试品溶液（批号200518），在0、1、2、4、8、12 h按"2.2.1"项下色谱条件进样，按峰面积计算得磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的RSD分别为0.74 %和0.92 %（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.7 重复性试验
取本品（批号200518），按“2.2.2”项下（2）的方法制备供试品溶液6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的RSD分别为1.90 %和1.58 %（n=6），表明该方法重复性良好。
2.2.8 回收率试验
按处方工艺制备磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁标示量为80%、100%、120%的3种样品，按“2.2.2”项下（2）的方法制备供试品溶液各3份，并按“2.2.1”项下条件测定，计算平均回收率，结果表明磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的平均回收率分别为（99.10±0.48）%、（99.54±0.68）%（n=9）。
2.2.9 含量测定
取3个批号样品，分别按“2.2.2”项下（2）的处理方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，代入回归方程计算含量，结果见表1。
表 1 磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的含量测定结果($ \overline x $ ±s, n=3)批号 磺胺嘧啶含量（mg/粒） 盐酸达克罗宁含量（mg/粒） 200518 24.62±0.50 4.88±1.02 190531 24.55±0.78 4.97±0.72 190225 24.18±0.41 4.68±0.48 3. 讨论
3.1 薄层色谱鉴别
复方玉红栓是以混合脂肪酸甘油酯作为油脂性基质的栓剂，中药成分在处方中含量少，以原药材总量计仅为4 %，油脂性基质占比90 %，药物受基质影响很大，若操作过程中油脂性基质未完全除去，中药有效成分提取不完全，实验时易发生斑点拖尾甚至没有斑点显现，严重影响鉴别的专属性和灵敏度，所以在操作过程中去除干扰的油脂性基质和选择合适提取方法至关重要[9]。根据待测药材的成分特性，本研究在参考文献的基础上建立了白芷、松香、苦参3种中药材的提取和TLC鉴别方法，所建立的方法可以用于复方玉红栓制剂中3种药材的鉴别。本研究还尝试建立紫草和槟榔的TLC鉴别方法，但两者在处方中所占比例更少，大量混合脂肪酸甘油酯严重干扰两味药材的提取，因此尚未建立它们特征性的鉴别方法。
3.2 HPLC法同时测定磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁含量
目前尚未见有同时测定磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁的研究报道。本研究采用甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.3）为流动相，建立了梯度洗脱条件，同时测定两者的含量。对色谱条件考察时发现，随着0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液比例增加，盐酸达克罗宁出峰时间提前，但峰形不对称影响测定准确性，经过摸索最终确定本实验洗脱比例[10]。研究中考察了两种成分的提取条件，发现不同的提取温度和时间影响提取效率，盐酸达克罗宁不稳定[11]，遇热易发生降解，本实验摸索了水浴温度90 ℃，提取5 min的条件，既保证了有效成分提取完全又防止了盐酸达克罗宁的降解。
本研究首次建立了松香、苦参、和白芷的薄层色谱鉴别方法，此方法操作性强，斑点显色清晰；用HPLC法同时测定磺胺嘧啶和盐酸达克罗宁，此方法的准确性、重现性好，符合快速测定要求。本研究为该制剂全面控制药品质量和临床疗效提供了重要依据。
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