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长期的航天载人飞行的特殊环境会影响航天员的生活质量和身体健康，因此，需要安全、有效的药物进行预防、治疗，以保障航天员的身体健康。然而，空间环境与地面环境有较大的不同，在地面上空气、温度、湿度、日光灯是主要影响药物稳定性的因素，需要规定药物的储存条件以保证药物在一定有效期内可以安全使用。但是，航天环境中的稳定性因素主要是空间辐射，包括非电离辐射和电离辐射。在执行航天任务的过程中，宇航员会受到空间电离辐射的影响。美国航空航天局（NASA）认为，空间辐射在未来可能会成为人类进行深空探测活动的最大限制因素之一[1]。其中的非电离辐射可以被药品的包装等屏蔽，而电离辐射的γ射线、χ射线等电磁波以及电子、质子、高能粒子等则难以完全屏蔽，会使药物的结构发生一定变化，从而导致其失效。
对乙酰氨基酚具有解热镇痛作用，临床上主要用于缓解轻、中度疼痛，如能最小限度地缓解膝关节的疼痛，是轻型骨关节炎短期镇痛的首选药物，广泛用于发热、头痛、神经痛以及痛经等症状，是常用的非处方药，也是航天飞行中的必备药物[2-4]。
为了考察对乙酰氨基酚缓释片在太空环境中的稳定性，本研究采60Co辐射模拟太空的射线环境。60Co是金属元素钴的放射性同位素之一，是一种穿透力很强的核辐射元素，通过β衰变释放能量产生β射线和γ射线。而太空辐射是一种包含γ射线、高能质子和宇宙射线的特殊混合体，60Co辐射和太空辐射都包含γ射线，且60Co的γ射线有很强的穿透力，效果显著，具有常温常压可处理，方法简单，成本低廉等优点[5]，常以放射源形式在各行各业广泛应用，因此，可以选择60Co辐射模拟太空的射线环境。
本文建立UHPLC法测定不同辐射剂量下的对乙酰氨基酚缓释片的含量变化，为太空环境下药品稳定性研究提供以辐射因素为主的研究思路，以揭示辐射因素对常用航天化学药品质量稳定性的影响，从而，可科学预测太空环境中药品的有效期，为今后航天药品的制剂工艺、包装储存等提供依据。
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LC-2030 PLUS高效液相色谱仪（日本岛津公司）；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；60Co辐照装置（海军军医大学海军医学系辐照中心）。
对乙酰氨基酚缓释片（上海强生制药有限公司，批号：190611）；对乙酰氨基酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100802-20100, 含量99.8%）；甲醇（Merck）、乙酸铵（Fisher）均为色谱纯；水为自制纯化水。
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将对乙酰氨基酚缓释片（含包装）置于辐照环境中，设定剂量辐射率，按照接收剂量为0、8、50、80 kGy进行60Co辐射，每天辐射1次，于1个月后取样。
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取对乙酰氨基酚对照品约20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中,加溶剂甲醇-水（4∶6）溶解并稀释至刻度，摇匀，得对乙酰氨基酚对照品储备液；再精密量取2 ml置100 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，得浓度为40 μg/ml的对照品溶液。
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取经0、8、50、80 kGy辐射后对乙酰氨基酚缓释片各10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于对乙酰氨基酚20 mg）置10 ml量瓶中，加溶剂甲醇-水（4∶6）溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取续滤液2 ml，置100 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。
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色谱柱为Shim-pack GISS C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）。流动相为甲醇-0.05%乙酸铵溶液(15∶85)，检测波长为245 nm，流速为0.3 ml/min，柱温40 ℃，进样量为10 μl，色谱图中对乙酰氨基酚的保留时间为2.67 min，理论塔板数按对乙酰氨基酚峰计算大于5000。精密称取标准品配制浓度约为40 μg/ml的对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，计算峰面积RSD为0.02％，表明仪器精密度良好。每个辐射强度取1批供试品，按照“2.3”项下配制供试品溶液，此色谱条件下进样分析。对照品溶液及供试品溶液的色谱结果见图1。
图 1 对乙酰氨基酚溶液超高效液相色谱图
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精密量取对乙酰氨基酚对照品储备液1、2、3、4、5 ml，置100 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为20、40、60、80、100 μg/ml的工作曲线。按“2.4”项下色谱条件分别进样10 μl进行测定，记录色谱图。以对乙酰氨基酚对照品浓度 (μg/ml)为横坐标，相应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y= 2.72×105X+1.5×104，r=0.9997，结果表明，对乙酰氨基酚在20～100 μg/ml浓度范围内，线性关系良好。
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精密称取同一批未辐射的对乙酰氨基酚缓释片样品6份，按照“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进样10 μl测定，记录峰面积，计算含量，其RSD为0.9%（表1），表明该方法重复性良好。
表 1 对乙酰氨基酚缓释片重复性试验结果
编号 含量(%) 平均含量(%) RSD(%) 1 96.9 96.9 0.9 2 97.9 3 98.3 4 95.8 5 96.1 6 96.3 -
精密称取同一批未辐射的对乙酰氨基酚缓释片样品（约相当于对乙酰氨基酚20 mg）各3份，样品分别置于10 ml容量瓶中，再精密称取对乙酰氨基酚对照品16、20、24 mg各3份，置于上述3个量瓶中，加溶剂（甲醇-水为4∶6）溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取续滤液2 ml，置于100 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，每个浓度制备3份，照“2.4”项下色谱条件进样分析，计算回收率结果见表2。
表 2 对乙酰氨基酚缓释片加样回收率试验结果（n=9）
称量量
(m/mg)原有量
(m/mg)测得量
(m/mg)加入量
(m/mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)25.61 20.98 37.19 15.98 101.4 101.5 1.6 25.62 20.99 37.21 101.5 25.62 20.99 37.13 101.0 25.63 21.00 42.19 20.84 101.7 25.63 21.00 42.11 101.3 25.62 20.99 42.85 104.9 25.63 21.00 45.49 24.01 102.0 25.63 21.00 44.51 97.9 25.63 21.00 45.49 102.0 -
取辐射强度为8 kGy的供试品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定，在0、1、2、5、8、12 h分别进样10 μ1，记录峰面积，结果RSD为0.19%，表明溶液在12 h内稳定。
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每个辐射强度取1批供试品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行3份，按“2.4”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，按照外标法计算对乙酰氨基酚含量。结果见表3。
表 3 对乙酰氨基酚缓释片含量测定结果(n=3)
辐射剂量（kGy） 含量(%) 平均含量(%) 0 96.3 96.2 95.2 97.3 8 94.2 92.2 90.3 92.1 50 90.8 91.8 93.0 91.7 80 81.7 83.9 83.0 86.8 -
对乙酰氨基酚片剂含量测定的常用方法，主要有紫外分光光度法、双波长分光光度法、高效液相色谱法等[6-8]。而常规高效液相色谱法，主峰出峰时间较长，若要缩短出峰时间，则会受到干扰。超高效液相色谱法粒径更小，柱效更高，可使主峰峰形较好且出峰较快，可在5 min内测定对乙酰氨基酚缓释片主成分含量，便于大量辐射样品的测定，快速且准确。
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根据原中华人民共和国卫生部发布的《60Co辐射中药灭菌剂量标准》[9]和《美国药典》第42版[10] 对辐射灭菌的规定，选定用8、50、80 kGy来考察不同辐射剂量下对乙酰氨基酚缓释片的质量稳定性。结果显示，随着辐射剂量逐步增大，在其他条件相同的情况下，对乙酰氨基酚缓释片的主药含量逐步下降，降解程度超过10%。提示辐射强度越高，药物降解的程度越大。
Acetaminophen content assay with UHPLC in the sustained-release tablet exposed to radiation
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摘要:
目的 采用超高效液相色谱法,对γ射线辐射的对乙酰氨基酚缓释片进行含量测定。 方法 采用60Co对对乙酰氨基酚缓释片进行辐射，使用超高效液相色谱法测定其含量，色谱柱为Shim-pack GISS C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm），以0.05%醋酸铵溶液-甲醇(85∶15)为流动相,流速为0.3 ml/min,检测波长为245 nm。 结果 对乙酰氨基酚含量在浓度为20～100 μg/ml范围内线性良好,相关系数r=0.9994，重复性为0.9％，加样回收率97.9 %～104.9 %，在0、8、50和80 kGy辐射量条件下，对乙酰氨基酚含量分别为96.2 %、92.2 %、91.8 %和83.9 %。 结论 超高效液相色谱法的分离效果快速、结果准确,适用于经辐射的对乙酰氨基酚缓释片的含量测定，辐射后对乙酰氨基酚含量有所降低。 Abstract:Objective To assay the contents of acetaminophen with ultra high-performance liquid chromatography (UHPLC) method in the sustained-release tablets radiated by Gamma ray. Methods Acetaminophen sustained-release tablets were radiated by 60Co. UHPLC equipped with the Shim-pack GISS-C18（2.1 mm×50 mm, 1.9 μm）was used for the assay. The mobile phase was methanol-0.05 % ammonium acetate solution (15∶85). The flow rate was 0.3 ml/min with the detection wavelength at 245 nm. Results The acetaminophen showed good linear relationship within the range of 20-100 μg/ml (r=0.999 4). The RSD values of repeatability was 0.9 %. The average recovery was 97.9 %-104.9 %. Acetaminophen content was 96.2 %, 92.2 %, 91.8 %, 83.9 % at 0, 8, 50 and 80 kGy radiation, respectively. Conclusion This method is speedy and accurate. It can be used to assay the content of acetaminophen in the sustained-release tablets after radiation. The content of acetaminophen decreased after radiation. -
Key words:
- acetaminophen /
- UHPLC /
- content /
- radiation
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小檗碱是从毛茛科植物根茎中提取的一种季胺类异喹啉类生物碱，又称黄连素，为中药黄连的主要成分，临床多用其盐酸盐。盐酸小檗碱（BBR）的药理作用主要为清热解毒，属于传统的消化系统用药，临床上常用作抗菌剂，用于治疗细菌性痢疾、肠胃炎等肠道感染[1-2]。盐酸小檗碱溶解度低， 渗透性差，在口服给药时，还存在药物释放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。对于需要达到一定血药浓度为疗效前提的疾病来说，盐酸小檗碱的传统剂型还无法达到理想的治疗效果[3]。
纳米乳（NE）是由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂组成的脂质纳米给药载体。粒径范围为1～100 nm，液滴呈大小均匀的球形，外观呈透明或半透明。纳米乳是一种热力学稳定的胶体分散体系，制备工艺简单，所需能量低甚至能够自发形成。纳米乳处方中油相和表面活性剂、助表面活性剂等组成成分的增溶效果，可以显著提升难溶性药物的溶解度。纳米乳小且均匀的粒径，可透过胃肠道的水化层，改善胃肠上皮细胞对药物的吸收。纳米给药体系具有较低的表面张力，可提高膜的通透性，促进药物吸收，提高其生物利用度[4]。纳米乳自身的独特优势，使其具有广泛的临床应用范围，可通过口服、透皮、注射等多种途径给药[5-6]。
本研究结合纳米乳剂型的优势，制备了盐酸小檗碱口服纳米乳(BBR-NE)，采用伪三元相图法和星点设计-效应面法优化了制备工艺，并对其体外特性进行表征，从而解决盐酸小檗碱口服给药剂型溶解度差、生物利用度低等问题，提高药物的疗效，为小檗碱的临床应用提供新的给药剂型[4]。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF 5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Zetasizer Nano ZS90 测定仪（英国马尔文公司）。
1.2 试药
盐酸小檗碱原料药（批号XC20170113，西安小草植物科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，纯度>86.7 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20181008，上海凌峰化学试剂有限公司）；吐温-80（批号2015021，上海凌峰化学试剂有限公司）；甘油（批号20191110，上海源叶生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，批号970248，上海浦东高南化工厂）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40，批号19523275L0，德国 BASF 公司）；烷基糖苷0810（APG，平均聚合度1.2～1.8，批号170502，上海发凯化工有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号170857，上海嘉法狮贸易有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号F20160731，国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（批号F20180725，中国医药集团上海化学试剂公司）；中链脂肪酸（MCT，批号193717，嘉法狮（上海）贸易有限公司）；大豆油（批号20190801，江西金海棠药用油有限公司）；蓖麻油（批号20180815，上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；羟丙甲基纤维素（HPMC，批号H08827，阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为重蒸水。
2. 方法与结果
2.1 盐酸小檗碱HPLC含量测定方法的建立[7-8]
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L与磷酸二氢钾（0.5 %三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。
2.1.2 方法学考察
精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇稀释定容于10 ml量瓶中作为储备液，用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。称取适量盐酸小檗碱纳米乳于10 ml 量瓶中，加入甲醇超声破乳30 min，10000 r/min离心5 min，取1 ml上清液于10 ml 量瓶中，加甲醇定容后过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在1.00～100.00 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=37.059 X+16.952 （r=0.999 9）。低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度分别为0.68 %、1.64 %、0.80 %，日间精密度分别为0.95 %、0.23 %、013 %，加样回收率RSD分别为1.42 %、0.70 %、1.57 %，表明该方法可用于纳米乳中盐酸小檗碱的含量测定。
2.2 盐酸小檗碱纳米乳的制备[4]
2.2.1 油相、表面活性剂和助表面活性剂的筛选
采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳。根据各类溶剂口服的安全性，筛选出以下各相备选溶剂，以BBR的溶解度为指标，确定各相最佳选择。
油相：Capryol 90、蓖麻油、橄榄油、大豆油、IPM、MCT；表面活性剂：吐温-80、APG、RH-40；助表面活性剂：1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃离心管中加入5 ml 上述各溶剂与过量盐酸小檗碱，置于恒温（25 ℃）振荡器振摇（100 r/min）72 h，得到以上各溶剂的饱和盐酸小檗碱溶液。取该饱和溶液于5000 r/min 条件下离心10 min，吸取1 ml上清液置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释定容之后过0.45 μm微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。
结果如图1所示：油相中盐酸小檗碱的溶解度从大到小依次为：Capryol 90> MCT>蓖麻油>大豆油>橄榄油>IPM；表面活性剂的顺序为：吐温-80>APG>RH-40；助表面活性剂的顺序为：1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即盐酸小檗碱在Capryol 90、吐温-80、1,2-丙二醇中溶解度最大，故选择Capryol 90为油相，吐温-80为表面活性剂，1,2-丙二醇为助表面活性剂。
2.2.2 表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）的筛选
按照上述筛选的结果，将表面活性剂和助表面活性剂按照Km分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例混合，再取油相与此混合表面活性剂按照1∶9、2∶8；3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比配制成混合溶液，在磁力搅拌下滴加蒸馏水。观察溶液的颜色、乳光和澄明度，判断临界点，记录体系由浑浊变澄清时的加水量，计算临界点时各组分的比例。用Origin 10.0软件绘制伪三元相图，图中各临界点连线下方的区域即为纳米乳区，比较该区域面积大小，确定表面活性剂与助表面活性剂的质量比[9-11]。结果见图2。图中阴影部分即为成乳区，且当Km为2∶1时达到最大，故将Km定为2∶1。然而在实际制备纳米乳过程中，处方中各组分的不同比例会产生交互影响作用，因此，需要进一步采用星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳的制备工艺。
2.2.3 星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳处方[4]
选择对纳米乳影响较大的表面活性剂与助表面活性剂质量比Km（X1）和油相质量百分数（X2）作为考察因素，以多分散系数（PDI，Y1）和载药量（Y2）为考察指标。实验过程中发现当Km≥4时，大部分处方难以成乳；当Km≤1:2时，平均粒径>100 nm，故将Km范围定在1∶1至3∶1。当含油量增至0.5 g（50 %）时，平均粒径已接近100 nm，而当含油量范围在0.2～0.5 g（20 %～50 %）时，可将粒径控制在100 nm之内。根据单因素试验结果确定了Km的取值范围和油相质量百分数，并将两个评价指标进行归一化，将每个指标换算成0～1之间的“归一值（OD）”,并求算几何平均数，得总评“归一值”。计算公式如下: OD=(d1d2d3…... dk)1/k（k为指标数）。对取值越小越好的因素（PDI）和取值越大越好的因素（载药量）采用Hassan法[9]分别进行数学转换，求归一值dmin和dmax，公式如下：dmin=(Ymax−Yi)/(Ymax−Ymin)；dmax=(Yi−Ymin)/(Ymax−Ymin)。采用2因素5水平星点设计优化处方，因素水平见表1，星点设计各组实验结果见表2。
表 1 星点设计因素水平表因素 水平 −1.41 −1 0 +1 +1.41 X1（Km） 1∶1 1.29∶1 2∶1 2.71∶1 3∶1 X2（含油量/g） 0.2 0.24 0.35 0.46 0.5 表 2 星点设计各组实验结果编号 X1 X2 平均粒径
(l
/nm)Y1 Y2
(mg/g）dmin dmax OD 1 0 −1.41 46.32 0.29 0.72 0.54 0 0 2 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.367 0.558 3 −1 1 85.3 0.25 0.91 0.78 0.820 0.800 4 0 0 74.06 0.23 0.84 0.85 0.53 0.67 5 1 −1 76.58 0.35 0.72 0.21 0.01 0.04 6 1.41 0 59.8 0.36 0.76 0.12 0.15 0.13 7 1 1 101.4 0.38 0.78 0.04 0.34 0.12 8 −1.41 0 58.68 0.21 0.80 1.00 0.36 0.60 9 −1 −1 45.8 0.21 0.84 0.99 0.51 0.71 10 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 11 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 12 0 0 74.06 0.23 0.80 0.85 0.37 0.56 13 0 1.41 91.88 0.39 0.95 0.00 1.00 0.00 对X1进行二次式回归，得到方程R1=0.23+0.06 A+3.22×10−3B−2.75×10−3AB+0.03A2+0.03B2 ，（r=0.970 8），P<0.001；对X2进行二项式回归，得到方程R2=0.81−0.04A+0.06B+1.37×10−3AB−0.01A2+0.01B2，（r=0.913 5），P<0.05；对总归一值（OD）进行二项式回归，方程为OD=0.87−0.28A+0.03B−0.01AB−0.03A2−0.34B2，（r=0.910 2），P<0.05。以OD作为指标时，为使方程有效，对其进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型的P < 0.05，说明OD与X1、X2回归方程的非线性关系显著。回归方程的相关系数r=0.910 2，表明模型能说明91.02 %响应值的变化，拟合情况良好，回归方程具有较好的代表性，能准确预测实际情况[12]。
表 3 星点设计-效应面法优化纳米乳处方方差分析表来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 1.48 5 0.18 5.88 0.0190 A-A 0.65 1 0.51 12.82 0.0090 B-B 7.73 1 3.600 0.15 0.7067 AB 4.40×10−5 1 0.016 8.74×10−3 0.9281 A2 6.32×10−3 1 0.37 0.13 0.7335 B2 0.83 7 0.026 16.41 0.0049 残差 0.35 3 0.058 纯误差 0.011 4 8.70×10-3 42.60 0.0017 总和 1.83 12 r 0.90 校正后r 0.82 C.V.% 35.29 信噪比 7.05 由拟合曲线可绘制X1、X2和OD值的关系，所绘制的三维效应面和二维等高线如图3所示。利用Design Expert 8.0软件的预测分析功能，根据拟合回归方程、三维效应面图和二维等高线图综合分析，得到最佳处方为X1= 0，X2=0.53，预测值OD为0.6214。故优化后的盐酸小檗碱纳米乳处方为：油相Capryol 90占体系的32.84 %，表面活性剂吐温-80占体系的33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %[4]。
2.2.4 最优处方的验证
对最优处方进行处方验证，结果如表4所示，预测值OD为0.6214，实际OD值为0.6510，偏差为4.76 %。表明预测值与实测值之间偏差较小，表明星点设计-效应面法（CCD-RSM）可用于筛选盐酸小檗碱纳米乳，筛选的处方预测良好、可靠。
表 4 最优处方验证结果评价指标 实测值 实际OD值 预测OD值 偏差（%） PDI 0.235±0.03 0.6510 0.6214 4.76 载药量（mg/g） 0.829 2.3 盐酸小檗碱纳米乳的体外表征[4]
2.3.1 BBR-NE载药量的测定
取适量BBR-NE于10 ml量瓶中，加甲醇超声破乳30 min，加甲醇稀释定容。4 ℃离心（10000 r/min，5 min），吸取1 ml上清液置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释定容后即得样品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，计算纳米乳的载药量。测定结果如表5。
表 5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果($\bar x $ ±s ，n=3)批号 盐酸小檗碱（mg/g） RSD（%） 201118 0.83±0.01 0.16 201119 0.83±0.02 0.21 201120 0.83±0.01 0.17 2.3.2 BBR-NE粒径大小与分布的测定
按照最优处方制备BBR-NE，稀释到适宜浓度，均匀分散后，采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径大小。粒径结果如图4和图5所示。所制备的BBR-NE粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（68.85±8）nm，PDI为(0.245±0.03)，表明该制剂粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。
2.3.3 BBR-NE的形态学考察
采用透射电镜（TEM）观察所制备的BBR-NE的形态。取适量BBR-NE滴于铜网上，自然干燥后滴加2 %磷钨酸（pH=7.4）溶液于铜网上负染3 min，晾干后置于透射电镜下观察其外观形貌。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图6所示。结果表明，BBR-NE呈均一圆整的球形，具明显层状结构，粒径大小约为68 nm。
2.3.4 BBR-NE体外释放度的测定[4]
取制备好的盐酸小檗碱纳米乳2 ml，置于透析袋（分子截留值为7 000）中。于pH 1.2的人工胃液中释放2 h，再于pH 6.8的人工小肠液中释放22 h，溶出介质体积满足漏槽条件。将透析袋置于离心管中（含30 ml透析液），在恒温振荡器（37 ℃，100 r/min）中释放24 h，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h定时取样1 ml，随后立即补加等温等体积释放介质。收集的样品过0.45 μm滤膜后，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算累积释放度。释放曲线如图7所示，拟合方程如表6所示。
表 6 盐酸小檗碱纳米乳释药曲线的拟合方程释药模型 拟合方程 r 零级动力学方程 Q=29.352 t–4.123 0.816 4 一级动力学方程 ln(1–Q)=92.395 t+0.240 0.962 3 希古契（Higuchi）方程 Q=20.952 t 1/2–6.735 0.889 6 由释放曲线可以看出，BBR-NE在人工胃液中（0～2 h）累积释放度很低（<20%），进入人工小肠液后（2～24 h）释放度逐渐上升，累积释放度达到80 %以上，表明该制剂具有一定缓释效果，其释药行为符合一级动力学方程。
3. 讨论
纳米乳的处方筛选过程中，目前常采用绘制伪三元相图、正交试验设计法、星点设计-效应面法等方法。其中，伪三元相图法的精度不高，常用于初筛[13-14]；正交试验设计法在因素水平较少时试验次数虽不多，但由于采用线性模型拟合，预测性较差[15]；而星点设计-效应面法各因素对效应的影响拟合结果多数是非线性，可从效应面上选择最佳效应区域，适合于多因素、多水平的处方优化。
在应用伪三元相图筛选Km时，随着表面活性剂和助表面活性剂质量比的增加，形成纳米乳区域的面积逐渐增加，当Km为2∶1 时最大，而后稍有减小。这是由于加入吐温-80的比例增加，纳米乳的乳化作用增强。因此需要综合考虑选择最佳的Km值。
本研究在单因素筛选的基础上，利用星点设计-效应面法，以载药量及外观形态为考察指标，优化并确定了盐酸小檗碱纳米乳的最优处方：油相 Capryol 90占体系32.84 %，表面活性剂吐温−80占体系33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %，载药量为0.829 mg/g。 外观形态分析，表明所制备的BBR-NE 呈圆整均一的球体且具有明显的层状结构，平均粒径为 (68.85±8) nm，呈正态分布，多分散系数为(0.245±0.03)，说明该制剂粒径大小符合纳米乳粒径要求且均匀性好[4]。由验证试验结果可知，该制备工艺稳定可行，有望为盐酸小檗碱临床应用提供一种新的给药剂型。
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表 2 对乙酰氨基酚缓释片加样回收率试验结果（n=9）
称量量
(m/mg)原有量
(m/mg)测得量
(m/mg)加入量
(m/mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)25.61 20.98 37.19 15.98 101.4 101.5 1.6 25.62 20.99 37.21 101.5 25.62 20.99 37.13 101.0 25.63 21.00 42.19 20.84 101.7 25.63 21.00 42.11 101.3 25.62 20.99 42.85 104.9 25.63 21.00 45.49 24.01 102.0 25.63 21.00 44.51 97.9 25.63 21.00 45.49 102.0 
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表 3 对乙酰氨基酚缓释片含量测定结果(n=3)
辐射剂量（kGy） 含量(%) 平均含量(%) 0 96.3 96.2 95.2 97.3 8 94.2 92.2 90.3 92.1 50 90.8 91.8 93.0 91.7 80 81.7 83.9 83.0 86.8
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