肝纤维化（HF）是一种创伤愈合反应，其特征是细胞外基质（ECM）在肝内的过度沉积，导致肝功能丧失和肝脏结构破坏^[1]。在正常肝脏中，肝星状细胞（HSC）是位于肝脏窦状隙的DISE腔内，负责储存维生素A。当肝脏受到损伤刺激时，HSC从静止状态转化为具有增殖、类维生素A消失、趋化性、收缩性、纤维生成等特性的肌成纤维细胞（MFs），参与肝纤维化进程^[2-4]。

核糖体蛋白S5（RPS5）是核糖体40S小亚基的组成成分，是核糖体生物发生所必需的。越来越多的证据表明，一些核糖体蛋白除了参与蛋白质加工合成之外，还具有许多核糖体外功能^[5-6]。例如，RPS5基因对于胚胎干细胞的分化和类胚体的形成至关重要^[7]；RPS5的β-发夹结构能够与HCV IRES相互作用，并介导HCV的翻译过程^[8]；RPS5在结肠癌中异常表达，并可能在癌变过程中作为检查点发挥重要作用^[9]。此外，RPS5还参与小鼠红白血病细胞分化，其表达下调会影响细胞周期蛋白依赖激酶-2、-4和-6的蛋白水平，并延迟体外红细胞成熟，引起G1/G0细胞周期停滞^[10-11]。

本课题组前期研究发现，在肝纤维化过程中，RPS5在静息和激活的HSC内存在差异表达^[12-13]。体外实验证实RPS5参与HSC活化，体内研究表明，RPS5基因敲减可加重肝纤维化，RPS5过表达则减轻肝纤维化^[13]。但是，我们并没有研究特异性敲减HSC内RPS5的表达对肝纤维化的影响^[14-17]。为此，我们构建了GFa2（GFAP启动子）-驱动shRPS5腺病毒，并研究其靶向敲减HSC的RPS5表达对肝纤维化进展的影响。

1.   材料和方法

1.1   材料

1.1.1   实验试剂

高糖DMEM培养基（Gibco）；Western及IP细胞裂解液液（Beyotime）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific）；RPS5抗体（Santa Cruz）、ALB、GAPDH抗体（Cell Signaling Technology）、GFAP、α-SMA、胶原蛋白 I抗体（Abcam）；山羊（多克隆）抗兔 IgG（H+L）、山羊（多克隆）抗小鼠 IgG（H+L）（LI-COR Biosciences）；Odyssey成像系统（LI-COR Biotechnology）；SYBR Premix Ex TaqTM PCR 试剂盒（Takara）。

1.1.2   实验动物

雄性Sprague-Dawley大鼠，清洁级，重约200 g，购于上海SLAC实验动物有限公司。

1.2   方法

1.2.1   原代HSC和肝细胞提取

原代HSC和肝细胞从雄性SD大鼠分离，通过蛋白酶-胶原酶消化，单步Nycodenz梯度纯化^[13]。分离的HSC和肝细胞在含有10%胎牛血清（FBS）DMEM培养基，5% CO₂、37 ℃培养箱中培养。每隔1天更换1次培养基。通过GFAP免疫染色评估，HSC的纯度为90%~95%。本实验于分离后第3天在转分化的HSC上进行。HSC以感染复数（MOI）50感染腺病毒48 h。

1.2.2   构建重组腺病毒

根据AdEasy™ Adenoviral Vector System（AgilentStratagene, USA）的说明制备质粒 pShuttle-GFa2-shRPS5。将GFAP基因启动子（GFa2）、shRPS5序列和必需元件克隆到无启动子穿梭载体pShuttle中，穿梭载体pShuttle-GFa2驱动shRPS5的表达。重组AdGFa2-shRPS5和AdGFa2-shNC腺病毒在293细胞中扩增，通过氯化铯梯度超速离心纯化。使293细胞通过噬斑测定病毒原液的滴度。shRPS5和shNC序列见表1。

表  1  shRPS5和shNC序列

名称	序列
shRPS5	5′-GCTCATGACTGTACGAATTCTCGAGAATTCGTACAGTCAT GAGC-3′
shNC	5′-GCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAA GCGCGC-3′

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1.2.3   蛋白印迹法(Western-blot)

将HSC细胞中的培养基吸弃，用PBS洗涤1次，加入Western及IP细胞裂解液冰上裂解20 min。通过BCA法测量蛋白浓度后将蛋白样品在95 ℃下加热5 min。制胶上样，将20 μg样品进行10% SDS-PAGE电泳，结束后将蛋白质转移到NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入RPS5、ALB、GAPDH、GFAP、α-SMA和I型胶原的单克隆抗体4 ℃孵育过夜，用PBST洗膜3次，每次10 min。山羊（多克隆）抗兔IgG（H+L）或山羊（多克隆）抗小鼠IgG（H+L）室温孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。Odyssey红外扫描成像系统对NC膜扫描，观察相关蛋白的表达情况。

1.2.4   实时PCR

用Trizol试剂盒提取总RNA。用SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒，合成cDNA，定量PCR检测基因mRNA表达。以管家基因β-肌动蛋白（β-actin）作为内部对照，并将基因特异性mRNA表达与β-actin表达进行归一化。引物序列见表2。

表  2  实时qPCR引物序列

名称	正向引物序列	反向引物序列
β-actin	5′-CCAT TGAACACGGCATTGTC-3′	5′-TCATAGATGGGCACAC AGTG-3′
RPS5	5′-AAATGTGCAGGTGTTGACCA-3′	5′-CACGCTCCTCCTGAAGAATC-3′
α-SMA	5′-CCGAGATCTCACCGACTACC-3′	5′-TCCA GAGCGACATAGCACAG-3′
collagen I	5′-CCGTGACCTCAAGATG TGCC-3′	5′-GCTCATACCTTCGCTT CCAA-3′

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1.2.5   动物肝纤维化模型

用二甲基亚硝胺（DMN）和胆管结扎术（BDL）的方法建立大鼠肝纤维化模型^[13]，尾静脉注射腺病毒（4×10⁹pfu）特异性敲减肝内HSC的RPS5水平。

1.2.6   组织标本采集及指标的检测

肝组织切片HE染色分析病理改变情况；羟脯氨酸（羟脯氨酸检测试剂盒）含量测定、切片天狼星红和 Masson染色评价胶原沉积情况；免疫组织化学染色检测α-SMA和RPS5的表达情况。

1.2.7   统计分析

数据分析通过SPSS 21统计软件进行，采用t检验分析，实验结果用均数±标准差（$\bar x $±s）表示。与对照组比较，P<0.05 则认为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   AdGFa2-shRPS5对RPS5表达的抑制作用

为了确定AdGFa2-shRPS5对RPS5表达的影响及对HSC的特异性，我们分别用AdGFa2-shRPS5和AdGFa2 shNC转染大鼠的原代HSC和肝细胞48 h，蛋白印迹法和实时PCR测定RPS5的表达情况。结果显示，RPS5 mRNA和蛋白质水平仅在原代HSC中降低（图1A、1B），在肝细胞中没有明显变化（图1C、1D）。

图  1  AdGFa2-shRPS5对HSC和肝细胞中RPS5表达的影响(n=3)

A、B. AdGFa2-shRPS5特异性敲减原代HSC中RPS5的表达；C、D.AdGFa2-shRPS5对原代肝细胞中RPS5的表达；^*P<0.05，与AdGFa2 shNC比较

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2.2   AdGFa2-shRPS5对HSC活化的影响

AdGFa2-shRPS5转染原代培养的HSC，蛋白印迹法和实时PCR分析α-SMA和I型胶原表达变化。结果表明，AdGFa2-shRPS5感染HSC后，α-SMA和I型胶原mRNA和蛋白质的表达显著增加（图2A、2B）。免疫荧光结果显示，转染AdGFa2-shRPS5的HSC形态明显改变，细胞更加扁平而延展（图2C）。以上结果表明RPS5敲减促进了HSC的活化。

图  2  AdGFa2-shRPS5对HSC活化的影响

A、B.AdGFa2-shRPS5感染HSC后显著增加α-SMA和Ⅰ型胶原的表达；C.用AdGFa2-shRPS5和AdGFa2-shNC感染HSC 3 d，免疫荧光染色检测α-SMA的表达(比例尺：25 μm)；^*P<0.05，与AdGFa2 shNC比较

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2.3   AdGFa2-shRPS5对BDL诱导的肝纤维化的影响

为了考察AdGFa2-shRPS5体内对肝纤维化的影响，我们构建了BDL肝纤维化模型。BDL手术前2 d和手术后5 d由尾静脉注射AdGFa2-shRPS5，2周后处死所有大鼠（图3A），评价肝纤维化情况。免疫组织化学染色结果所示，与AdGFa2-shNC组相比，AdGFa2-shRPS5降低了小鼠体内RPS5的表达，促进HSC的活化，α-SMA表达相应增加，表明肝纤维化程度加重。HE染色结果表明，在AdGFa2-shRPS5组中，反应性胆管周围有更广泛的胆管增生和有害的肝实质塌陷，α-SMA阳性表达增加。此外，天狼星红和Masson染色结果显示AdGFa2-shRPS5增加了胶原沉积（图3B）。天狼星染色半定量分析表明，AdGFa2-shRPS5处理的BDL大鼠纤维化面积增加了161%（P<0.05，图3C）。羟脯氨酸含量AdGFa2-shRPS5组明显高于AdGFa2 shNC组（P<0.05，图3D）。并且α-SMA和I型胶原mRNA的表达也与其蛋白质水平结果表达相一致（图3E）。

图  3  AdGFa2-shRPS5对BDL诱导的肝纤维化的影响(n > 6)

A.BDL诱导大鼠肝纤维化的示意图；B.各组代表性肝切片H&E（100×）、天狼星红（Sirius red）染色（40×）、Masson染色（100×）、a-SMA（100×）和RPS5（400×）；C.羟脯氨酸测定胶原蛋白含量；D.半定量分析计算Sirius red染色胶原含量；E. α-SMA和I型胶原mRNA水平；^*P<0.05，与AdGFa2-shNC对照组比较

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2.4   AdGFa2-shRPS5对DMN诱导的肝纤维化的影响

为了进一步证实AdGFa2-shRPS5对肝纤维化的作用，腹腔注射DMN制备纤维化模型。分别在第一次DMN注射前2天和后2周通过尾静脉向大鼠注射AdGFa2-shRPS5，在4周后处死所有大鼠（图4A）。AdGFa2-shRPS5抑制大鼠体内RPS5的表达，α-SMA在肝脏中的表达增加（图4B）。与BDL模型一致，HE、天狼星红、Masson、α-SMA染色及α-SMA RT-PCR分析证实（图4B，4E），AdGFa2-shRPS5也促进了DMN诱导的肝纤维化的发展。在DMN模型中，AdGFa2-shRPS5组的羟脯氨酸含量高于AdGFa2 shNC组（P<0.05，图4C）。天狼星红染色的半定量分析结果显示，AdGFa2-shRPS5使纤维化面积显著增加约157%（P<0.05，图4D）。综上结果证实特异性敲减HSC内的RPS5加剧了纤维化的进展。

图  4  AdGFa2-shRPS5对DMN诱导的肝纤维化影响(n > 6)

A.DMN诱导大鼠肝纤维化的示意图；B.各组肝切片H&E（100×）、天狼星红染色（40×）、Masson染色（100×）、a-SMA（100×）和RPS5（400×）；C.羟脯氨酸测定胶原蛋白含量；D.半定量分析计算Sirius red染色胶原含量；E.α-SMA和I型胶原mRNA水平；^*P<0.05，与AdGFa2-shNC对照组比较

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3.   讨论

肝纤维化是一个动态过程，其特征是慢性肝损伤导致ECM的过度沉积，当肝损伤发生时，HSC活化以获得成纤维能力，因此HSC是肝纤维化的主要生成细胞。文献表明，在转分化的HSC和人类肝硬化肝脏中RPS5显著降低^[13]。RPS5的过表达使得体内肝纤维化得到改善，而RPS5的敲减促进了肝纤维化^[13]。但究竟是哪一种细胞在这一过程中起主要作用仍值得进一步研究。因此，有必要仅针对肝脏中一个或有限细胞群进行研究。胶质纤维酸性蛋白GFAP是成熟星形胶质细胞中的主要中间丝状蛋白，但也在肝脏的HSCs中表达。因此，使用GFAP启动子GFa2来驱动RPS5敲减可能是靶向HSC的方法。在此研究中，我们使用GFAP启动子驱动shRNA系统来研究RPS5靶向HSCs对大鼠肝纤维化进展的影响。

本研究构建重组腺病毒AdGFa2-shRPS5，并证实AdGFa2-shRPS5可以特异性地将HSCs中RPS5的表达降低约50%，对肝细胞没有明显作用。研究证明RPS5的敲减促进HSCs的活化。体内研究结果表明，两种慢性肝损伤动物模型中纤维化的发展随着RPS5的特异性敲减而加重，并伴有显著的细胞外基质沉积。综上结果表明，RPS5的下调有助于HSC的激活，从而促进体内肝纤维化，表明RPS5可能是HSC激活的分子开关。

RPS5是核糖体40S小亚基的组成成分，是核糖体生物发生所必需的，并且具有许多核糖体外功能，如促进细胞的凋亡、DNA修复、细胞增殖和分化^[5-6,10-11]。文献证实RPS5可抑制LPS诱导的巨噬细胞中的IL-6和NO释放，表明RPS5也参与炎症过程^[18]。本研究结果表明，RPS5在调节HSC活化中起着重要作用，揭示了RPS5的新功能。由于GFa2启动子的活性较弱，我们没有研究过表达HSC中的RPS5对体内肝纤维化的影响。

本研究为敲减HSC中的RPS5对肝纤维化有促进作用提供了证据。使用AdGFa2-shRPS5的一个关键优势是靶向HSC，并且对正常肝细胞没有影响。结果表明，RPS5对肝纤维化的发生发展至关重要，可能是治疗肝纤维化的一个有前景的靶点。