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环境条件是维持机体正常生理功能的重要因素,长期生活于低海拔地区的人,当快速进入海拔 3 000 m以上高原时,通常会出现头痛、全身乏力等急性高原反应[1]。高原低压性缺氧能够诱导活性氧自由基(ROS)的快速积累,导致机体氧化应激水平升高,从而造成机体损伤。心脏是机体最重要的器官之一,对高原急性低压缺氧条件十分敏感[2]。当机体长期处于缺氧状态下,心率、血压发生改变,心脏负荷增加,心脏能量供应不足,最终导致机体损伤。高原低压性缺氧严重地限制了初到高海拔地区人们的生活和工作,甚至危及生命。
雪莲是我国高山地区常用的名贵中草药,近年来,国内对雪莲药理作用的研究主要集中于提高机体免疫力、抗氧化及抗辐射等作用[3],而关于抗高原缺氧作用的研究较少。本课题组前期对20多种青藏高原植物进行筛选,发现大苞雪莲具有显著的抗缺氧活性,并通过最佳提取工艺研究[4]、质量标准研究[5],研制出用于高原缺氧防治的医院制剂——雪莲黄酮胶囊。在本课题组前期研究中确定了最佳给药剂量为500 mg/kg[6]。本实验使用低压低氧动物实验舱模拟海拔8 000 m高原缺氧环境,通过检测急性高原缺氧小鼠心脏的组织学、缺氧相关生化指标和基因蛋白的变化情况,研究雪莲黄酮胶囊对于缺氧小鼠心脏的保护作用及机制。
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SPF级雄性Balb/c小鼠64只,体重18~22 g,购自空军军医大学实验动物中心,许可证号:SCXK(陕)2019-001,伦理审批编号:2021KYLL170。饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科。
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乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司, 59-66-5);雪莲黄酮胶囊(中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院制剂); 乳酸(LD)、乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、BCA蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所,A003-1-2);RNAiso试剂、TakaRa Prime ScriptTM试剂盒、PCR扩增试剂盒(大连宝生物公司,引物委托宝生物工程公司合成);缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抗体、血管内皮生长因子(VEGF)抗体、超氧化物歧化酶(SOD)抗体(Abcom,英国);抗体(BD,美国);Western BrightTM ECL(Advansta,美国)。
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Delta 320电子pH计(梅特勒托利多公司);IEC-Micromax高速离心机(美国ThermoElectron公司);Tissuelyser 快速研磨仪(上海净信科技公司);BP210S电子天平(赛多利斯有限公司);HP-8453紫外分光光度计(美国惠普公司);SpectraMax i3全自动荧光酶标仪(美国Molecular Devices公司);FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱(中航贵州风雷航空军械有限责任公司)。
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取SPF级健康雄性Balb/c小鼠64只,饲养适应3 d后随机分为正常组(N)、模型组(M)、乙酰唑胺阳性对照组(ACZ,250 mg/kg)、雪莲黄酮胶囊组(XLJN,500 mg/kg)4组,每组16只,单次灌胃给药,除正常组小鼠外,其余各组小鼠给药50 min后放入低压低氧动物实验舱,模拟8 000 m海拔缺氧环境。以10 m/s的速度升至8 000 m海拔,维持缺氧9 h,完成减压缺氧后以20 m/s的速度降至海拔1 450 m。小鼠完成减压后立即脱臼处死,取心肌组织,−80 ℃冰箱冻存备用。
实验过程严格按照“3R”原则进行,实验废弃物及动物尸体等按照《医疗废物管理条例》要求进行无害化处理,严格遵守国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》,尽可能减少对动物的伤害。
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每组随机取3只小鼠心脏组织标本,置于甲醛中固定。标本送至联勤保障部队第九四〇医院病理科进行石蜡包埋、组织切片、染色以及观察。
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每组随机取3只小鼠心脏标本,切成1 mm×1 mm×3 mm的小块,置于2.5%戊二醛中固定,之后对标本进行浸透包埋以及电镜观察。
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取各组剩余10只小鼠的心肌组织50 mg,加入9倍质量的0 ℃生理盐水,匀浆并离心,取上清,−20 ℃冷冻,用于LD、LDH、T-AOC指标测定。以上操作均按试剂盒说明书要求进行。
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取各组剩余10只小鼠心肌组织标本30 mg,向低压低氧处理的小鼠心肌组织中加入1 ml RNAiso Plus试剂进行研磨,加入200 μl氯仿,混匀后离心,弃上清液,取75%乙醇溶液纯化总RNA沉淀,再次离心弃上清液,将所得RNA于−80 ℃保存。紫外分光光度计检测总RNA的浓度及纯度,并使用1 %甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。将提取的总RNA进行逆转录,具体步骤参考PrimeScriptTM RT试剂盒说明书。实时PCR检测:步骤参考Applied Biosystems公司7300仪器说明。反应条件如下:两步法PCR扩增,95 ℃预变性30 s;95 ℃反应5 s,60 ℃退火31 s,40个循环。引物及序列见表1。
表 1 Real Time RT- PCR引物序列
基因引物 序列 HIF-1α Forward5′-GGACGATGAACATCAAGTCAGCA-3′
Reverse 5′-AGGAATGGGTTCACAAATCAGCA-3′VEGF Forward5′-ACATTGGCTCACTTCCAGAAACAC-3′
Reverse 5′-TGGTTGGAACCGGCATCTTTA-3′SOD Forward5′-GGCCTGAAATACCAAGTCAGGAA-3′
Reverse 5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′CAT Forward5′-CCAGTGCGCGTAGATGTGAAAC-3′
Reverse5′-GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTG-3GAPDH Forward5′-AGCATTCCATCATTGGCCGTA-3′
Reverse5′-TACTGCGCAATCCCAATCACTC-3′ -
取各组剩余10只小鼠心肌组织标本50 mg,加入高效裂解液,匀浆,于冰上裂解30 min,低温离心后吸取部分上清液,用于BCA法对总蛋白浓度进行定量。向剩余上清液中加入3倍量上样缓冲液,95 ℃加热10 min,取等量蛋白样品上样,采用SDS-PAGE进行分离,电泳完成后将蛋白转至PVDF膜,将PVDF膜浸泡于5%脱脂牛奶室温封闭2 h,分别加入小鼠抗β-actin单抗抗体(1∶1 000)、HIF-1α兔多克隆抗体(1∶500)、VEGF兔多克隆抗体(1∶1 000)、SOD兔多克隆抗体(1∶1 500),4 ℃孵育过夜,TBST缓冲液漂洗。加入二抗,室温孵育2 h,TBST缓冲液漂洗。配制ECL发光液,按照A液和B液1∶1进行配制,加入发光液,使用ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析。
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采用统计软件SPSS 13. 0处理,实验数据以(
$ \bar x \pm s $ )表示。多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。实时PCR结果采用△△Ct法处理数据。 -
结果如图1所示,N组心肌组织结构正常,细胞形态结构完好;M组心肌细胞肿胀,心肌纤维增粗,排列不整齐,胞核增大淡染;ACZ组与XLJN组的肌纤维肿胀、排列不齐现象,其程度有所减轻;心肌收缩舒张功能损伤减轻。
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如图2所示,N组心肌组织肌纤维排列整齐且紧密。肌节分明,肌线清晰,线粒体形状规则,膜光滑,内嵴清晰可见。M组肌丝溶解、破裂,肌丝排列疏松,基膜下肿胀、变形。线粒体肿胀,产生空泡,双层膜结构溶解。ACZ组肌丝排列疏松,线粒体基本正常,肌丝连接处部分溶解,连接不整齐。XLJN组,肌纤维与线粒体形态良好,远优于模型组。综上所述,雪莲黄酮胶囊对心肌的超显微结构具有明显的保护作用。
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如表2所示,缺氧后,M组LD含量升高(P<0.01),T-AOC活性显著降低(P<0.01),LDH活性无显著变化(P>0.05)。与M组相比,ACZ组与XLJN组的小鼠心肌组织LD活性降低(P<0.01),LDH活性无明显变化(P>0.05),T-AOC活性升高(P<0.01)。
表 2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响(
$ \bar x \pm s $ ,n=10)组别 例数(n) 剂量(mg/kg) LD含量(mmol/g蛋白) LDH活性(U/g蛋白) T-AOC活性(U/mg蛋白) N组 10 — 0.405±0.050 1919.8±143.1 1.58±0.23 M组 10 — 0.579±0.032## 1871.0±95.9 1.11±0.10## ACZ组 10 300 0.513±0.059* 1925.9±141.4 1.30±0.21** XLJN组 10 500 0.524±0.057** 1916.8±129.1 1.34±0.19** *P<0.05,**P<0.01,与M组比较;#P<0.05,##P<0.01,与N组比较。 -
如表3所示,与N组相比,M组小鼠心肌组织HIF-1α和VEGF的mRNA水平显著提高,SOD、过氧化氢酶(CAT)mRNA水平显著降低(P<0.01);与M组相比,ACZ组、XLJN组心肌组织HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平均有所下降(P<0.05),SOD、CAT 的mRNA表达水平显著提高(P<0.01)。
表 3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA的影响(
$ \bar x \pm s $ ,n=10)组别 例数(n) 剂量 (mg/kg) HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N组 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M组 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07# ACZ组 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16** XLJN组 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**# *P<0.05,**P<0.01,与M组比较;#P<0.05,##P<0.01,与N组比较。 -
如图3、图4所示,与N组相比,M组小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01),SOD蛋白表达显著降低(P<0.01)。与M组相比,XLJN组和ACZ小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01),SOD蛋白表达显著升高(P<0.01)。
Protective effect of Saussurea involucrata flavone capsule on myocardial injury induced by hypoxia at high altitude in mice
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摘要:
目的 研究雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧环境小鼠心肌组织的保护作用及其机制。 方法 将64只Balb/c小鼠随机分为正常对照组、缺氧模型组、阳性对照组和雪莲黄酮胶囊组,以500 mg/kg剂量进行单次灌胃给药后,在模拟海拔8 000 m环境停留9 h,对心肌组织进行显微与超微结构观察,并检测缺氧相关指标的变化。通过RT-PCR法检测缺氧相关基因转录水平的变化,并通过蛋白质印迹法检测缺氧相关基因蛋白表达的变化,研究雪莲黄酮胶囊的作用机制。 结果 雪莲黄酮胶囊可明显缓解模拟高原缺氧环境对小鼠心肌的病理学损伤,提高心肌组织T-AOC活力,降低LD累积,还可以降低心肌组织HIF-1α、VEGF mRNA的表达水平,提高SOD、CAT mRNA及蛋白的表达水平。 结论 雪莲黄酮胶囊具有良好的抗高原缺氧作用,可保护心肌组织结构和功能,调节能量代谢和提高抗氧化能力。其机制可能与提高高原缺氧小鼠抗氧化能力、调节能量代谢以及影响HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA的蛋白表达有关。 Abstract:Objective To study the protective effect and mechanism of Saussurea involucrata flavone capsule on the myocardial tissue of mice in simulated plateau hypoxia environment. Methods 64 Balb/c mice were randomly divided into normal control group, hypoxia model group, positive control group and Xuelian flavonoid capsule group. Myocardial tissue was observed microscopically and ultra-structurally, and the changes of hypoxia-related indexes were detected. The changes in the transcription levels of hypoxia-related genes were detected by RT-PCR, and the changes in the protein expressions of hypoxia-related genes were detected by Western blotting to study the mechanism of action of Xuelian flavone capsules. Results Saussurea involucrata flavone capsule had significantly alleviated the pathological damage to the myocardium of mice caused by simulated altitude hypoxia, increased the activity of T-AOC in myocardial tissue, reduced the accumulation of LD, and also reduced the expression levels of HIF-1α and VEGF mRNA in myocardial tissue, increased the SOD, CAT mRNA and protein expression levels. Conclusion Saussurea involucrata flavone capsule have good anti-altitude hypoxia effect, which could protect myocardial tissue structure and function, regulate energy metabolism, and improve antioxidant capacity. The mechanism might be related to improving the antioxidant capacity, regulating energy metabolism, and affecting the protein expression of HIF-1α, VEGF, SOD and CAT mRNA in high altitude hypoxic mice. -
Key words:
- Saussurea involucrata /
- plateau /
- anti-hypoxia /
- hypoxia-inducible factor 1α /
- epidermal growth factor
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表 1 Real Time RT- PCR引物序列
基因引物 序列 HIF-1α Forward5′-GGACGATGAACATCAAGTCAGCA-3′
Reverse 5′-AGGAATGGGTTCACAAATCAGCA-3′VEGF Forward5′-ACATTGGCTCACTTCCAGAAACAC-3′
Reverse 5′-TGGTTGGAACCGGCATCTTTA-3′SOD Forward5′-GGCCTGAAATACCAAGTCAGGAA-3′
Reverse 5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′CAT Forward5′-CCAGTGCGCGTAGATGTGAAAC-3′
Reverse5′-GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTG-3GAPDH Forward5′-AGCATTCCATCATTGGCCGTA-3′
Reverse5′-TACTGCGCAATCCCAATCACTC-3′表 2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响(
$ \bar x \pm s $ ,n=10)组别 例数(n) 剂量(mg/kg) LD含量(mmol/g蛋白) LDH活性(U/g蛋白) T-AOC活性(U/mg蛋白) N组 10 — 0.405±0.050 1919.8±143.1 1.58±0.23 M组 10 — 0.579±0.032## 1871.0±95.9 1.11±0.10## ACZ组 10 300 0.513±0.059* 1925.9±141.4 1.30±0.21** XLJN组 10 500 0.524±0.057** 1916.8±129.1 1.34±0.19** *P<0.05,**P<0.01,与M组比较;#P<0.05,##P<0.01,与N组比较。 表 3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA的影响(
$ \bar x \pm s $ ,n=10)组别 例数(n) 剂量 (mg/kg) HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N组 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M组 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07# ACZ组 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16** XLJN组 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**# *P<0.05,**P<0.01,与M组比较;#P<0.05,##P<0.01,与N组比较。 -
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