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针对非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向药EGFR-TKIs，自第一代问世以来发展迅速，目前第四代已在临床研发阶段。但由于新的耐药突变的不断产生，导致其应用受限。因此如何克服EGFR-TKIs耐药问题和寻找可改善肺癌靶向治疗耐药的药物已成当务之急。植物来源的单体成分种类繁多，应用前景巨大。毒胡萝卜（Thapsia garganica L.，伞形科毒胡萝卜属）是于地中海西部沿海地区发现的一种开花植物，一直被作为止痛剂应用于传统医学。毒胡萝卜素是从该植物中分离的单体化合物，作为内质网应激（ERS）的诱导剂，近年也被用于抗肿瘤和抗病毒研究。吉非替尼作为第一代EGFR-TKIs，副作用小，有效率高。本研究旨在探讨毒胡萝卜素和吉非替尼联合用药对人肺腺癌耐药细胞株PC9/GR耐药性的影响，并探讨其可能的机制。
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吉非替尼（纯度99.94%，HY-50895）、毒胡萝卜素（纯度99.95%，HY-13433）、CCK8试剂（HY-K0301-500T）均购自美国MCE公司；胎牛血清（F8318-500ML）和DMEM培养基（D6429-500ML）购自美国Sigam Aldrich公司；胰酶（25200-072）购自美国Gibco公司；凋亡试剂盒（559763）购自美国BD公司； ATF-6抗体（#65880）、IRE1α抗体（#3294）均购自美国CST公司；羊抗兔二抗（AS003）购自abclonal；PVDF膜购自Millipore；其余试剂均为国产分析纯试剂。人肺腺癌细胞（PC9）由同济医院惠赠，PC9/GR细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司。
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PC9细胞使用DMEM培养基培养，其中含10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中孵育。PC9/GR细胞使用上述培养基维持培养并额外含800 ng/ml的吉非替尼。
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检测细胞对吉非替尼的耐药性：分别取对数生长期的PC9和PC9/GR细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为40 000/ml，接种于96孔板，每孔100 μl细胞悬液，在培养箱中孵育过夜。吸弃96孔板上清液，加入含药培养基（PC9细胞中吉非替尼浓度分别为0、1、5、10、20、40、80、250、500、1 000 nmol/L；PC9/GR细胞中吉非替尼的浓度分别为0、1、10、100、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000、40 000 nmol/L），同时设对照组，每组设4个复孔。72 h时吸弃上清液，再加入含CCK8的DMEM，0.5 h后用酶标仪检测A450。
检测毒胡萝卜素对细胞增殖的影响：分别取对数生长期的PC9和PC9/GR细胞同上述处理铺96孔板，贴壁后加入浓度为0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L的毒胡萝卜素，同时设对照组，每组设4个复孔。72 h时使用CCK8法检测A450。
检测毒胡萝卜素对PC9/GR细胞耐药的逆转：取PC9/GR对数生长期的细胞同上述处理铺96孔板，设12组，加入吉非替尼的浓度分别为0、4.5、4.5、4.5、4.5、4.5、0、9、9、9、9、9 μmol/L，毒胡萝卜素的浓度分别为0、0、0.1、1、10、100、 0、0、0.1、1、10、100 nmol/L。72 h时用CCK8法检测A450。
检测毒胡萝卜素对PC9/GR细胞耐药的逆转：取PC9/GR对数生长期的细胞同上述处理铺96孔板，设两组，为吉非替尼单药组和联合用药组：其中单药组设7个小组，加入吉非替尼的浓度分别为0、1、10、102、103、104、105 μmol/L；联合用药组设7个小组，每小组加入10 nmol/L的毒胡萝卜素，同时加入浓度分别为0、1、10、102、103、104、105 nmol/L的吉非替尼。72 h时用CCK8法检测A450。逆转倍数（RF）=逆转前的IC50值/逆转后的IC50值。
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取对数生长期的PC9/GR铺6孔板，每孔3×105个细胞，孵育过夜，吸弃上清液，加入含药培养基（对照组为9 μmol/L的吉非替尼组，实验组为9 μmol/L的吉非替尼组+10 nmol/L的毒胡萝卜素联合用药组），孵育72 h后，收集上清液及贴壁细胞，按说明书加入膜联蛋白（Annexin V-PE），室温孵育20 min后，再加入7-AAD，5 min后，收集细胞，流式细胞仪上机检测。
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取对数生长期的PC9/GR铺6孔板，每孔3×105个细胞，孵育过夜，吸弃上清液，加入含药培养基（每孔吉非替尼浓度依次为0、0、4.5、4.5、9、9 μmol/L，毒胡萝卜素浓度依次为0、10、0、10、0、10 nmol/L），培养72 h，去上清液，收集细胞蛋白，BCA法测量样品中总蛋白浓度。蛋白变性后取蛋白样品，使用蛋白印迹法检测IRE1α、ATF-6蛋白表达。
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数据采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析，计量资料用（
$ \bar x $ ±s）表示，符合正态分布和方差齐性者采用单因素方差分析的单向分类方差分析（ANOVA），对取得的数据两两比较使用 LSD 检验。以P<0.05 为有统计学意义。 -
吉非替尼对人肺腺癌细胞株PC9和PC9/GR的IC50值经计算分别为0.1019 μmol/L（图1A）和8.912 μmol/L（图1B），按公式计算耐药倍数为87.5（本课题中PC9和PC9/GR细胞株的IC50值分别以0.1 μmol/L和9 μmol/L进行实验）。
图 1 吉非替尼对PC9和PC9/GR细胞增殖率的影响
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毒胡萝卜素对人肺腺癌细胞株PC9和PC9/GR的增殖均有抑制作用，呈剂量依赖性。当毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L时，对PC9和PC9/GR的抑制率分别为14.7%（图2A）和4.11%（图2B）。毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L时对PC9细胞的增殖显示较弱的抑制作用，而对PCR/GR细胞增殖的作用与对照组相比无统计学差异。抑制率（IR）＝（1−药物组A值/对照组A值）×100%。本课题中，毒胡萝卜素的工作浓度选择10 nmol/L或者围绕10 nmol/L进行设计。
图 2 毒胡萝卜素对PC9和PC9/GR细胞增殖的影响
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相比于吉非替尼单独用药，毒胡萝卜素（浓度依次为0、0.1、1、10、100 nmol/L）和吉非替尼（4.5 μmol/L或9 μmol/L）联合用药72 h时，PC9/GR的细胞增殖率在10 nmol/L和100 nmol/L时显著下降，并且具有统计学差异性（图3A、B）。
图 3 不同浓度的毒胡萝卜素联合吉非替尼对PC9/GR增殖的影响
在不同浓度（0、1、10、102、103、104、105 nmol/L）的吉非替尼联合10 nmol/L的毒胡萝卜素作用后，PC9/GR的细胞增殖率相比吉非替尼单独用药（吉非替尼组浓度依次为0、1、10、102、103、104、105 nmol/L）也出现了下降，具有统计学差异（图4）。计算得出吉非替尼单独用药的IC50值为11.039 μmol/L，联合用药后其IC50值为3.584 μmol/L，其RF为3.15。
图 4 不同浓度的吉非替尼与毒胡萝卜素联合用药对PC9/GR增殖的影响
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与对照组（图5A）、吉非替尼单独作用（图5B）、毒胡萝卜素单独作用（图5）相比，联合用药（图5）后PC9/GR细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均相应增加，并且具有统计学差异（图5）。说明毒胡萝卜素在一定程度上可以改善PC9/GR细胞的耐药性。
图 5 吉非替尼、毒胡萝卜素及两者联合用药对PC9/GR细胞凋亡的影响
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结果显示，与吉非替尼组1或2相比，药物作用后联合用药组1或联合用药组2中PC9/GR细胞的ATF-6及IRE1α蛋白表达均上调（图6A），并且有统计学差异（图6B、C）。ATF-6和IRE1α均是ERS的指标蛋白，说明PC9/GR细胞在药物联合作用后发生了ERS。
图 6 毒胡萝卜素、吉非替尼及两者联合用药对PC9/GR细胞中ATF-6和IRE1α蛋白表达的影响
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肺癌是当今世界最常见、致死率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康[1]。NSCLC是最常见的病理类型，约占所有比例的85%[2]。约70%的NSCLC患者在确诊时已处于晚期，失去了手术的机会。近年来，NSCLC的分子靶向治疗发展迅速，靶向药EGFR-TKIs不断更新，成为放化疗和免疫治疗之外的重要治疗手段之一。
截止目前，EGFR-TKIs已从第1代发展至第3代[3]，且有多款第4代靶向药已进入临床实验阶段。然而由于抗肿瘤耐药性，患者使用靶向药一定时间后不可避免的会出现耐药[4]。于是寻找能够克服肿瘤耐药的药物及方法已经成为肿瘤治疗领域中亟待解决的问题。由于中草药植物的毒副作用小且疗效明确，故从中寻找能够克服肿瘤耐药的成分已经成为一种趋势。毒胡萝卜素是从地中海菊属植物中提取的单体成分[5]，作为常用的ERS的诱导剂，毒胡萝卜素在科研中有着广泛的应用[6]。也有文献报道其有抗肿瘤活性[7]，同时对冠状病毒、合胞病毒、甲型流感病毒等有较强的抑制作用[8]。本研究中使用的吉非替尼耐药细胞株PC9/GR经CCK8实验证明其对吉非替尼具有耐药性。实验结果显示，吉非替尼对PC9的IC50值为0.1019 μmol/L（图1A），对PC9/GR的IC50值为8.912 μmol/L（图1B），耐药倍数为87.6。当毒胡萝卜素浓度为 10 nmol/L时，对PCR/GR细胞增殖的作用与对照组相比无统计学差异，故该浓度的毒胡萝卜素未显示出对PCR/GR的细胞增殖的抑制作用（图2B），故本课题中毒胡萝卜素选择10 nmol/L作为实验浓度。而提高毒胡萝卜素的浓度，其对PC9/GR细胞抑制率也增加，表明毒胡萝卜素本身对于肺腺癌细胞PC9/GR具有抑制作用。实验发现联合用药中当毒胡萝卜素浓度为大于或等于10 nmol/L时，PCR/GR细胞的增殖相比吉非替尼单独用药受到了更强的抑制，并具有显著性差异（图3A、B）。本课题同时使用不同浓度的吉非替尼联合10 nmol/L的毒胡萝卜素共同作用于PC9/GR细胞，结果发现所有联合用药组相比于吉非替尼单独用药组，均对PC9/GR细胞的生长产生抑制作用。分别计算吉非替尼单药和联合用药对PC9/GR细胞的IC50值，发现联合用药的IC50值降低（图4），逆转倍数为3.15。说明10 nmol/L的毒胡萝卜素可以有效改善PC9/GR对吉非替尼的耐药。
肿瘤细胞的耐药性严重影响着患者的预后。耐药突变、自噬、肿瘤免疫微环境都是肿瘤细胞产生耐药的因素[9]。由于耐药突变，EGFR-TKIs治疗已经陷入了研究人员开发新药物与肿瘤细胞产生新耐药突变的循环之中。近年来，因自噬异常与肿瘤发生和进展、细胞死亡及抗肿瘤治疗疗效相联系而受到广泛关注[10]。但是抑制自噬只能延缓EGFR-TKI耐药的产生，并不能有效解决耐药的问题[11]。因此，耐药问题亟待找到新的解决方法。体内低氧、低糖等恶劣环境会导致肿瘤细胞发生ERS，并启动未折叠蛋白反应从而让细胞重新恢复稳态。ERS过度可启动细胞凋亡。因此，ERS也与肺癌治疗息息相关[12]。毒胡萝卜素作为研究ERS常用的激动剂，是一种特异性的肌浆/内质网Ca2+-ATP酶抑制剂，能够使内质网中Ca2+量减少、未折叠蛋白增多，引起ERS[13]。本研究中通过细胞凋亡实验发现，和单独用药相比，毒胡萝卜素联合吉非替尼联合用药可以进一步促进PC9/GR细胞的凋亡（图5B、D和E）。通过蛋白印迹实验证实，联合用药相比吉非替尼单独用药，PC9/GR细胞中ATF-6（图6A、B）和IRE1α蛋白（图6A、C）的表达均上调，表明联合用药后PC9/GR细胞处于ERS状态。这是毒胡萝卜素有效改善PC9/GR对吉非替尼耐药的可能原因之一。
综上所述，体外实验证实毒胡萝卜素低浓度下可以有效促进PC9/GR的ERS，高浓度下对肺癌细胞具有直接杀伤作用，说明毒胡萝卜素本身具有抗肿瘤活性，本课题同时证实，毒胡萝卜素能增强吉非替尼对PC9/GR的杀伤作用。其可能的机制是，在抗肿瘤药物和ERS状态的双重压力下，肺腺癌耐药细胞株PC9/GR对靶向药吉非替尼的敏感性增加。因此，毒胡萝卜素有望成为解决非小细胞肺癌靶向治疗耐药的潜在药物之一，但其中的机制仍需进一步的探索。
Improvement of gefitinib-resistance of PC9/GR by thapsigargin combined with gefitinib
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摘要:
目的 研究毒胡萝卜素（thapsigargin）联合吉非替尼（gefitinib）对人肺腺癌耐药细胞株PC9/GR增殖的影响并探讨可能的机制。 方法 吉非替尼单独用药或吉非替尼与毒胡萝卜素联合应用，通过CCK8实验检测上述两组药物对PC9/GR细胞增殖的影响；应用流式细胞术鉴定两组药物对PC9/GR细胞凋亡的影响；应用Western blotting法检测两组药物对PC9/GR细胞蛋白ATF-6和IRE1α表达的影响。 结果 细胞增殖实验显示，与吉非替尼单独用药相比，联合用药组中PC9/GR的增殖受到更强的抑制作用；凋亡实验显示，相较于吉非替尼单独用药，联合用药能够进一步促进细胞的凋亡；Western blotting法显示，与吉非替尼单独用药相比，联合用药后PC9/GR中ATF-6和IRE1α蛋白（内质网应激标志物）表达上调，其差异具有统计学意义。 结论 在毒胡萝卜素诱导下，PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性增加，其中机制可能与内质网应激有关。 Abstract:Objective To study the effect and mechanism of the thapsigargin combined with gefitinib on the proliferation of human lung adenocarcinoma gefitinib resistance cell line PC9/GR. Methods The cell viability of PC9/GR treated with gefitinib alone or gefitinib combined with thapsigargin was evaluated by CCK8 assay. The flow cytometry was used to analyze the PC9/GR cell apoptosis indued by the two group drugs. The ATF-6 and IRE1α protein expression of PC9/GR cells treated with the two group drugs were detected by Western blotting. Results The group of drug combination exhibited enhanced ability to inhibit cell proliferation, promote cell apoptosis and upregulate the ATF-6 and IRE1α protein expression of the PC9/GR compared with the group gefitinib used alone. Conclusion The sensitivity of PC9/GR to gefitinib was increased when the cells were treated by thapsigargin, which may be related with the state of endoplasmic reticulum stress（ERS） induced by thapsigargin. -
Key words:
- gefitinib /
- thapsigargin /
- tumor drug resisdance /
- apoptosis /
- endoplasmic reticulum stress
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免疫介导的炎性眼前段疾病（immune-mediated inflammatory anterior ocular diseases，IIAODs）如春季结膜炎、前葡萄膜炎等是临床上较常见的眼科疾病。局部或全身性使用类固醇是控制这类疾病炎症的主要手段。然而，长期使用类固醇可能会导致白内障、青光眼等，从而存在失明的可能。因此，眼科临床越来越频繁地局部使用免疫抑制剂来治疗这类疾病。
他克莫司（tacrolimus，FK506）作为第二代免疫抑制剂代表性药物，是治疗IIAODs的主要方式之一[1-3]。目前国内上市的FK506眼用制剂为日本千寿药业生产的Talymus®，其药效容易受到泪液冲刷的影响而降低。因此，本研究研制了他克莫司阳离子微乳凝胶（FK506-loaded cationic nanoemulsion-based in-situ gel, FK506 CNE GEL），旨在利用该剂型的特性，延长药物在眼部的滞留时间，提高生物利用度，减少给药频次。本文通过HE染色处理的兔眼组织病理切片观察FK506 CNE GEL的眼部刺激性，并通过建立HPLC-MS测定兔眼房水药物浓度的方法，考察其房水药动学。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱系统（美国安捷伦公司）；AL204 电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海精密试验设备有限公司）；NS1001L型高压均质机（意大利Niro Soavi公司）；85-1型磁力搅拌器（上海志成电器有限公司）；CX31光学显微镜（Olympus Corporation）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SCIEX QTRAP® 5500 型高压快速液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）。
1.2 药物与试剂
他克莫司对照品（含量99.3%，福建科瑞药业有限公司）；子囊霉素对照品（含量99.5%，上海齐奥化工有限公司）；蓖麻油（湖南宏康制药股份有限公司）；中链脂肪酸甘油酯（铁岭北亚药用油有限公司）；吐温-80（四川金山制药有限公司）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（德国BASF提供）；西他氯胺（Sigma-Aldrich）；甘油（湖南尔康制药有限公司）；注射用水（明澈D24UV）；甲醇（上海科丰实业有限公司）；他克莫司滴眼液（Talymus®，日本千寿制药株式会社）；0.9%氯化钠注射液（国药集团化学试剂有限公司）；戊巴比妥钠（Merck 分装）；盐酸丙美卡因滴眼液（爱尔凯因®，美国爱尔康眼药厂比利时分厂）；其他药品和试剂均为药用规格或分析纯。
1.3 动物
新西兰白兔，雌雄兼用，2.5～3.0 kg，上海斯莱克实验动物有限公司。实验前24 h自由进食、饮水，进行眼部检查以确保无任何眼病。
2. 方法与结果
2.1 FK506 CNE GEL的配制
根据本研究前期报道制备FK506 CNE GEL[4]。首先以蓖麻油（4 %，W/V）、中链脂肪酸甘油酯（6 %，W/V）作为混合油相，西他氯胺（0.02 %，W/V）作为阳离子表面活性剂，吐温−80（1 %，W/V）、泊洛沙姆188（0.1 %，W/V）作为非离子表面活性剂，甘油（2.2 %，W/V）作为渗透压调节剂，通过高压均质制得FK506 CNE（0.1 %，W/V）。而后以26 %泊洛沙姆407和12 %泊洛沙姆188共同作为凝胶基质，将FK506 CNE进一步制备成FK506 CNE GEL（0.1 %，W/V）。
2.2 FK506 CNE GEL的眼部刺激性考察[5-6]
2.2.1 分组给药设计
取实验兔8只，随机分为A、B两组。采用动物同体左右侧自身对比法，A组实验兔左眼滴入FK506 CNEGEL 50 μl，右眼滴入生理盐水50 μl作为对照。B组实验兔左眼滴入市售Talymus® 50 μl，右眼滴入生理盐水50 μl作为对照。给药后使兔眼被动闭合10 s，使药液与局部有充分接触。每日给药3次，连续给药2周。
2.2.2 眼球组织病理切片
通过耳缘静脉注入空气处死实验兔后取出眼球，进行病理组织切片，详细步骤如下：① 10 %中性福尔马林固定；② 流水冲洗；③ 组织修切平面；④ 组织脱水、石蜡包埋；⑤ 石蜡组织切片；⑥ 二甲苯-无水乙醇脱蜡；⑦ 苏木素-伊红染色；⑧ 小浓度氨水返蓝；⑨ 脱水、复染、洗涤；⑩ 继续脱水后封片。光学显微镜下观察兔眼角膜，虹膜，结膜并拍照，试验结果见图1。
一般情况下，兔眼较人眼对刺激反应更为敏感。图1为显微镜下滴入FK506 CNE GEL、Talymus®及生理盐水后的兔眼角膜、虹膜及结膜结构。对比可见，滴入FK506 CNE GEL后兔眼角膜组织排列规则有序、纹理清晰；虹膜各层组织结构清晰，无明显异常；结膜组织清晰可见，未见坏死及炎性细胞浸润，与生理盐水组及Talymus®组对比无明显差异。结果表明，FK506 CNE GEL对兔眼角膜、虹膜及结膜均无明显刺激性。
2.3 FK506 CNE GEL房水药动学研究[7-10]
2.3.1 色谱条件
采用Agilent 1100型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2.1 mm×50 mm, 2.7 μm)，流动相为甲醇-水（2 mmol/L醋酸铵）（90∶10, v/v），柱温为40 ℃，流速为0.3 ml/min，进样量为1 μl。
2.3.2 质谱条件
采用SCIEX QTRAP® 5500 型高压快速液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪以ESI正离子电离方式检测，扫描方式为多反应监测（MRM），扫描时间为100 ms，离子源电离电压为5 500 V，离子源温度为550 ℃，雾化气流流速为7 L/min。以上述质谱条件对FK506及子囊霉素（ascomycin ，FK520）进行离子扫描，结果如表1所示。根据扫描结果，选择m/z 821.5→768.4 作为 FK506 定量分析离子对，m/z 821.5→576.3 作为其定性分析离子对；选择m/z 809.5→756.5作为FK520定量分析离子对，m/z 809.5→564.3 作为其定性分析离子对。
表 1 FK506和FK520的质谱行为分析参数 FK506 FK520 分子量 804.2 792.4 定性分析的离子反应（m/z） 821.5→576.3 809.5→564.3 碎裂能量（CE, V） 31.2 29.0 定量分析的离子反应（m/z） 821.5→768.4 809.5→756.5 碎裂能量（CE, V） 28.0 26.1 解簇电压（DP, V） 120 45 2.3.3 房水样品的制备
精密移取房水样品30 μl置于2 ml离心管中，加入50 μl FK520内标液（100 ng/ml）及120 μl甲醇，涡旋混合，12 000 r/min离心15 min，取上清液进样分析。
2.3.4 方法专属性考察
取空白房水30 μl，将一定浓度的FK506和FK520标准溶液分别加入空白房水中，按照“2.3.3”项下方法处理，记录谱图。结果如图2所示，表明房水中内源性物质对FK506的测定无干扰，方法专属性良好。
2.3.5 标准曲线和定量限
精密移取空白房水 30 μl置于2 ml离心管中，加入不同量的100 ng/ml FK506标准溶液及50 μl FK520内标液（100 ng/ml），加入甲醇使总量达200 μl制成系列浓度50、25、10、5、2.5、1、0.5 ng/ml的FK506溶液，12 000 r/min离心15 min，液质联用仪进样分析，记录对应图谱。以FK506峰面积Ai与FK520峰面积As的比值Ai/As作为纵坐标，以FK506浓度C（ng/ml）为横坐标进行线性回归，得线性回归方程：A=0.324 75C+0.05577，r=0.999 96。结果表明FK506在0.5～50 ng/ml浓度范围内线性关系良好，定量限为0.5 ng/ml。
2.3.6 方法精密度考察
配制浓度为1、10、30 ng/ml的FK506样品，按照“2.3.3”项下方法处理，于1 d内重复测定5次，连续测定5 d，考察方法的日内、日间精密度。根据测得浓度与理论浓度比值计算方法回收率，结果见表2。结果表明，日内、日间精密度RSD<2%，精密度良好。
表 2 方法精密度试验结果时间 浓度
(ng/ml)序号 平均值 RSD
(%)1 2 3 4 5 日内 1 1.00 0.97 0.98 0.98 0.96 0.98 1.52 10 9.91 9.98 9.92 9.97 9.94 9.94 0.31 30 29.96 29.95 29.96 29.87 29.98 29.94 0.09 日间 1 0.99 0.98 1.97 0.96 1.01 1.18 0.37 10 9.96 9.98 9.95 9.97 9.98 9.97 0.13 30 29.98 29.96 29.96 30.01 29.95 29.97 0.05 2.3.7 方法重复性考察
配制浓度为1、10、30 ng/ml的房水样品各3份，按照“2.3.3”项下方法处理，1 d内测定。结果见表3，表明3个样品浓度RSD<2%，重复性良好。
表 3 方法重复性试验结果浓度
(ng/ml)序号 平均值 RSD
(%)1 2 3 1 0.98 0.96 0.97 0.97 1.03 10 9.97 9.93 9.96 9.95 0.21 30 29.93 29.98 29.92 29.94 0.06 2.3.8 回收率试验
取FK506浓度为1、10、30 ng/ml样品各3份，按照“2.3.3”项下方法处理并测定，记录FK506峰面积为A1；取空白房水同法萃取，于分离的上清液中加入对应浓度等量的FK506和FK520，测定并记录FK506峰面积A2。按提取回收率公式（A1/A2）×100 %算得FK506的提取回收率。结果表明，FK506在各个浓度的提取回收率分别为（78.14±4.21）%、（78.32±4.55）%、（76.56±4.35）%，符合体内药动学研究的相关指标。
2.3.9 分组给药设计
将实验兔随机分成A、B两组，每组6只，共12只。A组实验兔（A1～A6）左眼给予Talymus®，右眼给予自制FK506 CNE；B组实验兔（B1～B6）左眼给予FK506 CNE GEL，右眼给予FK506 CNE。实验前24 h自由进食、饮水，并进行眼部检查，以确保无任何疾病。于给药点用开睑器撑开实验兔眼睑，使用移液枪往实验兔左、右眼分别滴入等量药液50 μl，按压实验兔眼睑使之被动闭合约10 s使药物分布均匀。
2.3.10 统计学分析
采用SPSS统计软件进行独立样本t检验分析，当P<0.05时，统计学有显著性差异。实验数据均以（
$ \bar x \pm s $ ）表示。2.3.11 样品采集
提前给予实验兔1 %戊巴比妥钠（0.6 ml/kg）进行耳缘静脉麻醉，并于采样前使用盐酸丙美卡因滴眼液进行局麻。接着，用镊子固定眼球后采用角膜穿刺术抽取房水，分别于给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h时间点采样。A1～A3实验兔于给药后0.5、1.5、2.5、4、8 h各抽取房水30 μl，A4～A6实验兔于给药后1、2、3、6、10 h各抽取房水30 μl。B1～B3实验兔于给药后0.5、1.5、2.5、4、8 h各抽取房水30 μl，B4～B6实验兔于给药后1、2、3、6、10 h各抽取房水30 μl。
2.3.12 数据处理分析
以房水样品中FK506浓度C（ng/ml）为纵坐标，以时间T（h）为横坐标作图，得药-时曲线图3及对应药动学参数表4。
表 4 给予FK506三种制剂后的房水药动学参数（n=3）药动学参数 FK506 CNE Talymus® FK506 CNE GEL AUC(ng·h /ml) 113.61±12.36* 68.25±10.82 128.34±13.09*# c max (ng/ml) 28.02±4.07 21.34±3.31 24.14±3.10 t max (t/h) 1.50±0.20* 2.00±0.17 2.50±0.25*# ka (h-1) 2.16±0.51* 1.14±0.90 0.94±0.08*# ke (h-1) 0.34±0.02* 0.41±0.05 0.32±0.02*# MRT (t/h) 3.46±0.28* 3.23±0.24 4.23±0.34*# *P<0.05，与Talymus®比较；#P<0.05，与FK 506 CNE比较 由表4可见，MRT(CNE GEL)>MRT(CNE)>MRT(Talymus®)，即FK506 CNE GEL的平均滞留时间最长，表明FK506 CNE GEL在角膜的滞留时间最长。此外，AUC(Talymus®)为（68.25±10.82） ng·h /ml，AUC(CNE)为（113.61±12.36）ng·h /ml，AUC(CNE GEL)为（128.34±13.09）ng·h /ml。三者对比得AUC(CNE GEL)是AUC(CNE)的1.13倍，是AUC(Talymus®)的1.88倍，说明FK506 CNE GEL的生物利用度较高。
3. 讨论
3.1 FK506 CNE GEL的辅料
FK506 CNE GEL所采用的辅料都是安全、无刺激的，例如采用的阳离子材料为阳离子表面活性剂西他氯胺（CKC）。CKC作为眼药水中常用的防腐剂苯扎氯胺的一个组分，其安全性已得到保证，且CKC在市售产品空白阳离子纳米乳Cationorm®和口腔软膏Bonjela®中广泛使用，其临床安全性得到进一步证实。此外，采用的凝胶基质为P407/P188。由于非离子型表面活性剂泊洛沙姆无毒、无刺激，不仅可以通过空间位阻效应稳定纳米乳而且具有模拟黏膜的性质，是温敏型原位凝胶最常用的凝胶基质，同样安全性也能得到保证。其他辅料如蓖麻油、MCT、吐温-80和甘油均是常用的眼用制剂辅料之一。
3.2 FK506 CNE GEL的药动学参数
药动学参数t max (CNE GEL)>t max (Talymus®)>t max (CNE)，说明FK506 CNE GEL的达峰时间最长。这是因为FK506 CNE GEL在角膜表面形成一层凝胶且其所带正电荷能与带负电荷的角膜发生静电吸引作用，从而延长其在眼部的滞留时间，缓慢而持续地释放药物，使药物作用时间延长，达峰时间延迟。而ka (CNE)>ka (Talymus®)>ka (CNE GEL)同样证实了这一点，由于FK506 CNE和Talymus®是水溶性滴眼液，相较于FK506 CNE GEL，释放药物透过角膜被吸收的速度相对较快，故FK506 CNE GEL被吸收的速度最慢。而Talymus®的粒径（1671.5±66.3）nm较FK506 CNE的粒径（178.8±2.7）nm大，故FK506 CNE相较而言吸收快、达峰时间短。
由于泪液冲刷及鼻泪管排泄，房水药物浓度随时间延长而降低。由药时曲线可见，在给药后2～4 h，Talymus®的消除曲线下降趋势最为陡峭，FK506 CNE次之，而FK506 CNE GEL的消除曲线最为平缓。ke (Talymus®)>ke (CNE)>ke (CNE GEL)同样说明FK506 CNE GEL在眼部被消除的速度最慢，相较另外两种制剂而言，明显延缓了药物从前房的消除。
综上所述，FK506 CNE GEL对兔眼无明显刺激性，给药后能黏附于黏膜表面，延长药物作用时间，提高药物生物利用度，减少给药频次。有望成为一种眼部安全性高、滞留时间长的FK506眼用制剂，其研发成功将为眼科临床提供更多选择，为IIAODs患者的临床治疗提供帮助。
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图 3 不同浓度的毒胡萝卜素联合吉非替尼对PC9/GR增殖的影响
A. 吉非替尼取0.5倍的IC50值的浓度与毒胡萝卜素联合作用对PC9/GR细胞增殖的影响；B. 吉非替尼取IC50值的浓度与毒胡萝卜素联合作用对PC9/GR细胞增殖的影响*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,与吉非替尼组比较。
图 5 吉非替尼、毒胡萝卜素及两者联合用药对PC9/GR细胞凋亡的影响
A. 对照组；B. 吉非替尼组（9 μmol/L）；C. 毒胡萝卜素组（10 nmol/L）；D. 联合用药组，吉非替尼浓度为9 μmol/L，毒胡萝卜素浓度为10 nmol/L；E. 凋亡数据统计图**P<0.01,与吉非替尼组比较。
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