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信使 RNA（mRNA）是蛋白质合成中从基因到核糖体的遗传信息的瞬时载体[1]，相对于 DNA 治疗, 有更多优势，例如，无整合到宿主基因组中而导致插入突变的风险、比DNA更能获得持久预测蛋白表达动力学蛋白表达，且体外合成 mRNA 相对容易等。然而，由于mRNA不稳定性，其需要一个递送载体保护，免受核酸酶降解的同时还要使其被细胞吞噬，核酸胞内释放并翻译成蛋白。目前已上市的mRNA疫苗，大多采用的是脂质纳米粒（LNPs）载体[2-4]。LNP有4个重要组成部分：结构性脂质、胆固醇、阳离子脂质（或可电离脂质体）和隐形脂质。其中，阳离子脂质或可电离脂质是将带负电的mRNA能够装载到LNP必不可少的组成部分。Lipo8000是新型的阳离子脂质体转染试剂，转染效率和Lipo3000基本一致，适用于将DNA和RNA转染入真核细胞，对多种细胞具有高转染效率，常作为脂质纳米粒载核酸药物研究的对照试剂 [5-6]。DLin-MC3-DMA被认为是最有效的阳离子脂质体之一，具有“低毒高效”的优势[7]，2018年全球首个上市的siRNA产品Onpattro就是采用DLin-MC3-DMA作为载体[8]。DLin-MC3-DMA在酸性条件下呈正电性，而生理pH条件（pH值为7.4）下呈电中性，现已成为制备肝脏靶向siRNA/LNP系统的“标准”脂质材料。但其递送mRNA的能力尚未见到报道。本研究以DLin-MC3-DMA作为阳离子脂质构建脂质纳米粒，并以Lipo8000为对照对其体外递送mRNA的能力进行考察，为后续肿瘤基因治疗研究提供参考。
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小鼠前列腺癌 RM-1 细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。
MalvernZS90 激光粒径电位测试仪（Malvern公司，英国）；JEM-2010型透射电镜（JEOL公司，日本）；激光共聚焦显微镜 （Olympus公司，日本）；SartoriusBS11os精密电子天平（德国赛多利斯集团）；超净工作台（淀山湖净化设备仪器厂）；MSHPRO磁力搅拌器（大龙兴创实验仪器有限公司）；5804R 低温高速离心机（Eppendorf，美国）；DMIL 荧光显微镜（Leica 公司，德国）；CellmeterMini 全自动细胞计数仪（Nexcelom，美国）；旋转蒸发仪（常州英峪予华仪器有限公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；真空冷冻干燥机（上海精密实验设备有限公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher，美国）；MULTISKAN MK3酶标仪（Thermo公司，美国）。
1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、双抗、胰酶（Gibco公司，美国）；PBS（上海源培生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒、DAPI水溶性封片液（上海碧云天生物技术有限公司）；Lipo8000™ 转染试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；DLin-MC3-DMA(艾伟拓医药科技有限公司）；DEPC（艾伟拓医药科技有限公司）；β-谷甾醇（上海麦克林生化科技有限公司）；PEG2K-DMG（艾伟拓医药科技有限公司）；二氯甲烷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4% 多聚甲醛（武汉塞维尔生物科技有限公司)；EGFP-mRNA（吉玛基因）；琼脂糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TBE（5×）（南京江苑生物科技有限公司）；Gel-red（Biosharp）。
RM-1细胞培养于含10 % 胎牛血清、青霉素 100 U/ml 及链霉素 100 μg/ml 的 1640完全培养基，在 37 ℃、5 % CO２ 孵箱中培养，待细胞生长至 80% 融合时用于实验。
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称取DLin-MC3-DMA、DEPC、β-谷甾醇、PEG2K-DMG（摩尔比为50∶10∶38.5∶1.5）分别为12.5 μl（约10 mg）、2.5 mg、4.6 mg、1.3 mg，加入2 ml二氯甲烷，室温搅拌8 h。旋蒸蒸干有机溶剂后纯水重悬，超声乳化，每超声10 s，间隔5 s，重复3次，得DLin-MC3-DMA 脂质纳米粒（DLin-LNP）。将脂质纳米粒溶液在−80 ℃ 冰箱中预冻，放入冷冻干燥机中，制成 DLin 冻干粉。DLin冻干粉置于−20 ℃环境中储存。待使用时，取适量 DLin-LNP冻干粉溶解稀释，按比例加入适量模型药EGFP-mRNA，室温孵育30 min，制备成载mRNA脂质纳米粒DLin@mRNA。
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取适量制备的DLin@mRNA，用纯水稀释制成1 mg/ml的溶液，使用MalvernZS90 激光粒径电位测试仪检测粒径及Zeta电位，使用透射电镜观察纳米粒的形态及大小并拍照记录。
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取新制备的DLin空白载体（DLin-Blank）和DLin@mRNA 纳米粒重悬于纯水中，配置浓度为1 mg/ml的脂质纳米粒溶液，静置20 d，用粒径电位测试仪检测其粒径和Zeta电位的变化情况。
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采用琼脂糖电泳实验考察DLin-LNP对mRNA的包载能力。取 1 μg EGFP-mRNA，按照DLin-LNP/mRNA质量比为0、0.5、1、2、4、6、8、10 的比例，将各组EGFP-mRNA 和DLin 按比例加入到2 ml的EP管中，涡旋混匀，孵育30 min后可在预制的凝胶板上上样。在电压为100 kV的条件下进行电泳，40 min后取出电泳板，置于紫外光条件下观察显影并拍照记录。
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采用 EGFP-mRNA 为模型药，以RM-1为模型细胞，以 4×105 个/ml的密度铺48孔板，每孔加入250 μl含FBS的DMEM培养基，在培养箱中培养24 h。以质量比（载体/mRNA)为2、4、6、8分别配置 Lipo8000@mRNA 和 DLin@mRNA，每组复3孔， PBS组为对照组。室温孵育30 min后可加入孔板中。每孔加入 DMEM空白培养基 250 μl，加入样品溶液，培养4 h。吸除原培养液，换上含FBS的DMEM培养基。继续培养，20 h后荧光显微镜下观察mRNA的表达情况。
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为了考察DLin-Blank载体本身的安全性，采用CCK-8法考察对RM-1细胞的细胞毒性作用，具体方法如下：以4×105 个/ml铺于96孔板，培养箱中培养24 h。分别加入不同浓度的Lipo8000-Blank、DLin-Blank，使终质量浓度分别为0、10、20、50、100、200 μg/ml，每组重复6孔，同时设置无细胞的孔为空白孔，PBS组为对照组，于细胞培养箱中孵育24 h。孵育结束后，吸除培养基，每孔加入10 μl CCK-8溶液，并用1640空白培养基补至100 μl，置于培养箱孵育2 h。使用酶标仪检测每孔450 nm波长处的吸光度。
计算每孔的细胞活力公式如下：
细胞活力=[（A加药−A空白 ）/（A对照−A空白）]×100 %
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采用RM-1细胞为模型，以 4×105 个/ml密度铺24孔板，每孔500 μl。将其放于 37 ℃、5 % CO2 的孵箱中培养24 h。弃去旧培养液，PBS 洗2次，分别加入含游离EGFP-mRNA、Lipo8000@mRNA、DLin@mRNA 的纳米粒溶液(Lipo8000组和DLin组的脂质体/mRNA分别为2和6），补充无血清培养基，使 EGFP-mRNA终含量为 1 μg/孔，在孵箱中培养 24 h。吸去培养液，PBS 洗 1 次，用预冷的4 %多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗2次。取8 μl含有DAPI的封片液滴于载玻片上，将盖玻片含有细胞的一面贴于含有封片液的载玻片上，玻片两侧用指甲油固定。利用激光扫描共聚焦显微镜观察脂质纳米粒在RM-1细胞内的分布情况，并拍照记录。
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实验数据采用软件GraphPad Prism 7进行分析。正态分布数据以（
$\bar{{x}}\pm \mathrm{s}$ ） 表示，组间比较使用ANOVA分析法，以P<0.05和P<0.01为差别有显著性和极显著性。 -
使用激光粒度仪检测DLin-Blank和DLin@mRNA的平均粒径分别为（151.10±2.10） nm（图1A）和（164.75±1.85） nm（图1B），显示载mRNA后的脂质纳米粒平均粒径略有增大。DLin-Blank和DLin@mRNA的Zeta电位结果分别为（23.70±0.50） mV（图1C）和（2.6±0.2） mV（图1D）。使用透射电镜观察脂质纳米粒的形态，DLin-Blank和DLin@mRNA 纳米粒均为类球形（图2），纳米粒载药前后形态无明显变化，粒径在150 nm 左右，大小与粒度仪检测结果一致。
图 1 DLin-Blank和DLin@mRNA的电位和粒径检测结果图
图 2 DLin-Blank（左）和DLin@mRNA（右）在透射电镜下的形态
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为了评价各纳米粒的稳定性，进行了稳定性考察，结果如图3所示。实验期间，各纳米粒粒径和电位保持基本稳定，证明其具有较好的稳定性。
图 3 脂质纳米粒稳定性考察结果 （n=3）A. 粒径稳定性;B. Zeta电位稳定性
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脂质纳米粒的包载作用保护mRNA 免受酶解，是基因能够有效转染的关键。将DLin-LNP与mRNA以不同的质量比共同孵育结合，进行琼脂糖电泳实验。紫外光线下的显影结果显示，当质量比为 >1 时，脂质纳米粒可以通过静电作用将mRNA完全包裹，阻止mRNA在电泳板上的迁移 (图4)。
图 4 脂质纳米粒与mRNA以不同质量比结合的琼脂糖电泳实验图
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以质量比（脂质体/mRNA)分别为2、4、6、8的Lipo8000@mRNA和DLin@mRNA 考察RM-1细胞中的转染情况，同时设置PBS组为对照组，每组复3孔。用荧光显微镜下观察细胞转染后的荧光强度，拍照记录，并使用Image J统计各组荧光强度。结果如图5所示，DLin纳米粒在质量比为6时转染效果最好，DLin组在各质量比时的荧光强度均较Lipo8000组的更强，显示出更佳的转染效果。
图 5 核酸转染实验结果
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使用CCK-8法检测细胞活力，结果如图6所示，DLin-Blank的毒性远低于Lipo8000-Blank，当浓度达到100 μg/ml时Lipo8000-Blank组的RM-1细胞存活率降到50 %以下。DLin-Blank 组的细胞存活率在所检测浓度范围内均保持在80 %以上。DLin-LNP较Lipo8000-LNP具有更低的细胞毒性。
图 6 DLin和Lipo8000脂质纳米粒对RM-1细胞的细胞毒性分析结果 （n=6）
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制备DLin@mRNA和Lipo8000@mRNA分别与RM-1细胞共同孵育3 h，并以PBS作为对照，使用激光共聚焦显微镜观察RM-1细胞对纳米粒的分布情况。结果显示，在细胞质部分可观察到绿色荧光蛋白（EGFP-mRNA），说明纳米粒被肿瘤细胞摄取后主要分布在胞质内，且DLin@EGFP组的荧光强度略高于Lipo8000@EGFP组，与转染实验中的结果保持基本一致 （图7）。
图 7 激光共聚焦显微镜观察纳米粒在RM-1细胞中的分布
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LNP 作为目前 mRNA 主流的递送载体之一，目前已常用于肿瘤治疗和疫苗[9-10]。DLin-MC3-DMA是新型阳离子脂质，为了探究DLin-MC3-DMA包载mRNA的效果，本研究以DLin-MC3-DMA作为纳米粒的重要组成制备了DLin@mRNA，并以此为基础进行了体外研究。结果显示，阳离子脂质所制备的LNP形成了正电位效果，对带负电mRNA的装载具有较好的包载效果。DLin-LNP的纳米粒为类球形，粒径为（151.10±2.10） nm，空载电位为（23.7±0.5） mV，载药前后形态无明显变化。DLin@mRNA 溶液在20 d内仍具有较好的溶液稳定性，可有效装载mRNA并保护其不受分解。此外，DLin较市售Lipo8000具有更高的转染效率且细胞毒性更低，显示出良好的优势。
LNP的均匀性和核酸负载效率影响最终药效的两个重要的因素。LNP的制备取决于脂质成分发生分子间相互作用而自组装。脂质体的多样性、核酸的独特性以及两者混合的时间特性均会对纳米粒最终的特性造成影响。LNP制备方法很多，脂质体挤出法、纳米沉淀法、微流控等都是常见的制备方法，其中微流控技术备受研究者的喜爱，但鉴于微流控通量小，在中试生产中可能受到限制[11]。因此，在载药纳米材料不断发展的同时，对于如何生产稳定、载量高、载药效果好的LNP的制备工艺，还需要进一步深入研究[12]。
综上所述，本实验成功构建了DLin@mRNA纳米粒，并进行了载药比例、膜包覆条件及相关体外特性的考察，该仿生纳米体系具有成为安全、 高效的体内靶向给药递送系统的潜力。后期我们将开展体外细胞学评价及体内的靶向性、药效学评价，并进一步探索其抗肿瘤作用的机制。
Construction and in vitro evaluation of an LNP system for mRNA delivery
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摘要:
目的 构建脂质纳米粒DLin-LNP，以EGFP-mRNA为模型药，考察DLin-LNP对于mRNA的体外递送能力。 方法 采用薄膜水化法制备DLin-LNP, 并进一步制备 DLin@mRNA，对纳米粒进行表征，使用激光扫描共聚焦显微镜观察脂质纳米粒胞内的分布情况，以RM-1细胞为模型考察胞内转染情况。 结果 成功制备了脂质纳米粒DLin-LNP，其粒径为（151.1±2.1） nm，空载电位为（23.7±0.5） mV。DLin-LNP在RM-1细胞中转染mRNA效率较高，其毒性远低于市售脂质体Lipo8000，且 DLin-LNP脂质纳米粒稳定性好。 结论 DLin-LNP具有高转染效率和安全性，且稳定性好，可作为mRNA递送载体，为后续脂质纳米粒肿瘤治疗中的应用提供依据。 -
关键词:
- 脂质纳米粒 /
- DLin-MC3-DMA /
- 信使核糖核酸 /
- 药物递送
Abstract:Objective To construct lipid nanoparticles DLin-LNP for mRNA delivery. Methods DLin-LNP was prepared by thin film hydration method, and DLin-LNP/mRNA was further constructed by using EGFP-mRNA as model drug. The particle size, zeta potential, and appearance morphology were measured. Furthermore, the intracellular distribution and transfection of DLin-LNP/mRNA in RM-1 cells was investigated by laser scanning confocal microscope. Results DLin-LNP was successfully prepared. The average particle size was about (151.1±2.1) nm, the no-load potential was (23.7±0.5) mV. The cytotoxicity of DLin-LNP was far lower than that of the commercially available liposomal Lipo8000. The results of transfection experiment indicated that DLin-LNP has high transfection efficiency for mRNA delivery with low cytotoxicity and good stability. Conclusion DLin-LNP could become a potential mRNA vector for gene therapy. -
Key words:
- LNP /
- DLin-MC3-DMA /
- mRNA /
- drug delivery
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骨质疏松症和阿尔茨海默病均为退行性疾病，越来越多的研究表明它们的发病机制具有关联[1]。骨质疏松症往往伴随着认知缺陷，Aβ沉积是阿尔茨海默病的典型症状，而阿尔兹海默病小鼠（APPswe/PS1dE9）的骨组织中也会出现Aβ沉积，并出现骨密度降低，骨强度减弱等骨质疏松症状[2]。另有研究表明，氧化应激会导致 Aβ沉积，这种氧化损伤状态可被抗氧化剂改善[3]。因此， Aβ沉积偶联氧化损伤可视为阿尔茨海默病及骨质疏松症的共同发病机制。巴戟天丸收载于明代《古今医统大全》，由君药巴戟天，臣药远志、石菖蒲、茯苓、人参以及地骨皮、茯神组成[4]。前期课题组研究已证实，巴戟天丸组方可以从体内外水平上改善D-半乳糖（D-gal）引发的骨丢失，但巴戟天丸组方治疗Aβ沉积所致的骨丢失及具体作用机制有待进一步阐明[4, 5]。因此，本研究拟以Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞模型，对巴戟天丸组方的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究，并通过网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。
1. 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 巴戟天丸水提物的制备
取质量比为5∶10∶10∶10∶10∶10∶3的巴戟天、茯苓、茯神、地骨皮、远志、石菖蒲、人参粉末，混合均匀。按照料液比1∶10加入去离子水，浸泡1 h后，加热煎煮，回流提取2次，每次1 h，所得药液过滤，合并两次的滤液。将收集到的滤液减压浓缩成浓度为2.6 g（生药量）/ml的巴戟天丸水提物母液。-20°C保存备用。
1.1.2 成骨细胞
新生 24 h Wistar 大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（以色列BI）；MTT（上海碧云天）；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（上海碧云天）、ALP、CAT、SOD、GSH 、MDA 试剂盒（南京建成）；PBS（天津灏洋）；DMSO（上海博光）；α-MEM 培养基（上海富衡）； BMP2、RUNX-2、OPG、GAPDH抗体（美国Abcam）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
采用二次消化法从新生 24 h Wistar 大鼠的颅盖骨中分离得到原代成骨细胞，将成骨细胞培养于 α-MEM 培养基中（10% 胎牛血清），置于 37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，取第 3～5 代成骨细胞进行后续实验。
1.2.2 细胞增殖情况测定
将成骨细胞以 2×104个/孔接种于无菌 96 孔板中，孵育过夜。空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.008、0.04、0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到 20 mmol/L。培养 48 h 后，采用 MTT 法测定细胞增殖水平。
1.2.3 成骨细胞 ALP 活性检测及染色
ALP 活性检测：按照“1.4.2”项的方法进行给药，培养 48 h 后，取上清液，根据说明书进行 ALP 活性测定。将成骨细胞以 1×105 个/孔接种于无菌6孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后进行染色，室温下避光孵育 48 h，洗去工作液后置于显微镜下拍照。
1.2.4 成骨细胞CAT、SOD、GSH 、MDA活性检测
将成骨细胞以2×104个/孔和5×104 个/孔分别接种于接种于无菌96孔和24孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组、阳性药组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后根据说明书进行检测。
1.2.5 Western Blot实验
将细胞以 2×105 个/孔接种于 6 孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组加入Aβ1-42寡聚体，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。48 h 后，吸去培养基，PBS 洗涤 3 次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至 PVDF 膜进行转膜，室温封闭1 h后，加入相应的一抗，4 ℃过夜，1×TBST洗涤 3 次，加二抗于室温孵育 50 min，1×TBST洗涤 3 次，采用 ECL 化学发光试剂盒检测。
1.3 统计学分析
使用 SPSS Staistics 24 统计分析软件进行统计学分析。计量数据均采用（
$\bar{x} $ ±s）表示，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。使用 Graphpad prism 9.0 软件进行统计及绘图。以P<0.05 为差异有显著性意义。1.4 网络药理学研究
1.4.1 巴戟天丸组方活性成分筛选
通过TCMSP（http://tcmsow.com/tcmsp.php）和ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php），查找巴戟天、地骨皮、茯苓、人参、石菖蒲和远志6味中药的成分。在TCMSP数据库中，选择药物口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的成分，在ETCM数据库中根据DrugLikeness Grading评分，选择评分为Moderate和Good的成分[6]。
1.4.2 构建巴戟天丸组方成分靶点图
通过Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库，将靶点映射成基因，利用Cytoscape 3.6.0软件绘制成分靶点图。
1.4.3 阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建
通过Disgenet数据库（http://www.disgenet.org/）和Genecards数据库（https://www.genecards.org/）查找阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点，绘制PPI蛋白相互作用网络图，整合两大数据库中的靶点基因，去除重复的靶点。利用Venny2.1，将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析。
1.4.4 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建
利用Venny2.1，将阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方相关靶点进行交集分析。将药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。
1.4.5 GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析
采用Metascape数据库，对关键靶点进行GO基因富集分析（http://geneontology.org/）和KEGG代谢通路分析（http://www.genome.jp/kegg/），分析巴戟天丸中的主要分子生物过程和信号通路。
2. 结果
2.1 巴戟天丸组方促进 Aβ损伤成骨细胞骨形成
Aβ1-42寡聚体可显著抑制成骨细胞的增殖；巴戟天丸组方在 0.04、0.2、1、5 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的增殖水平（图1A）。Aβ1-42寡聚体会显著抑制成骨细胞中骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达；给予巴戟天丸组方干预后，BMP2、RUNX-2、OPG的表达显著提高，提示巴戟天丸组方可显著促进Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞的骨形成（图1B）。与空白组相比，Aβ1-42寡聚体可以显著降低成骨细胞的 ALP 活性，而巴戟天丸组方显著逆转了 Aβ 损伤成骨细胞的 ALP 活性，促进成骨细胞的分化（图1C、D）。
图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，##P<0.01与空白组比较。2.2 巴戟天丸组方改善Aβ损伤成骨细胞氧化应激
如图2 所示，Aβ1-42寡聚体显著降低了成骨细胞CAT（图2A）、SOD（图2B）、GSH（图2D）的活性，提高MDA的活性（图2C），导致成骨细胞的氧化损伤，而巴戟天丸组方低、中、高剂量均可以显著改善Aβ1-42寡聚体导致的氧化损伤。
图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01与空白组比较。2.3 网络药理学研究
2.3.1 巴戟天丸组方活性成分筛选
根据条件筛选后，其中，巴戟天成分为20种，地骨皮成分为12种，茯苓成分为10种，人参成分为18种，石菖蒲成分为10种，远志成分为5种，茯神成分0种，共计成分75种。
2.3.2 构建巴戟天丸组方成分靶点图
通过TCMSP和ETCM数据库查找满足筛选条件的化学成分对应的靶点，得到151个预测靶点。删除重复靶点后，通过Uniprot数据库映射成基因ID，剔除重复靶点后，得到143个基因symbol（图3）。
2.3.3 阿尔兹海默病和骨质疏松症靶点构建
通过Disgenet数据库和Genecards数据库查找得到阿尔兹海默病相关疾病靶点10 362个，骨质疏松症相关疾病靶点4 582个，并将所得靶点进行蛋白相互作用网络分析（图4A、B）。将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析，得到共有靶点2 674个（图4C）。
2.3.4 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点构建
将2 674个疾病交集靶点基因和143个药物成分靶点基因再次进行交集分析，得到共有靶点95个（图5A），将95个药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。将单独节点去除后，图中共有94个节点，871条边，意味着它们间有特殊的关联，即蛋白质共同贡献一个共同的功能，每个靶点的平均节点度为18.3，说明交集靶点间关系密切而且存在很强的相互作用关系（图5B）。
2.3.5 GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析
GO富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC），将每个结果前 10 的条目可视化为条形图（图6A）。巴戟天丸活性物质参与的BP主要包括对脂多糖的反应、对氧含量的反应、细胞凋亡信号途径、活性氧代谢过程。MF主要包括G蛋白偶合胺受体的活性、神经递质受体的活性、氧化还原酶活性、参与凋亡信号通路的半胱氨酸型内肽酶活性、泛素类蛋白连接酶结合。CC主要包括膜筏、突触膜的整体组成部分、浆膜筏等。 KEGG 通路富集分析中主要涉及与阿尔兹海默症、骨质疏松症相关的通路有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等（图6B）。
3. 讨论
骨骼重塑是一个重要的生理过程，其主要包括两个阶段，成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收[7]。其中，成骨细胞的增殖能力反映骨形成的强弱，其分泌的 ALP 是分化阶段的关键酶，可促进骨组织矿化[8]。本研究中，各剂量巴戟天丸均可显著改善Aβ损伤成骨细胞的增殖抑制，且0.2 μg/ml效果最好，5 μg/ml的效果优于0.04 μg/ml，故选择0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml作为巴戟天丸给药剂量进行后续实验，并发现其可显著提高Aβ损伤成骨细胞的ALP活性和骨形成相关蛋白 BMP2、RUNX-2、OPG的表达，促进骨形成。GSH是细胞抗氧化系统的一个重要成员，高水平的GSH对于清除过多的活性氧（ROS）和解毒异物是不可缺少的[9]。MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，自由基的增加会导致MDA的过度生产，加剧氧化损伤[10]。SOD和CAT是重要的酶类抗氧化剂，二者活性的降低会导致氧化损伤[11,12]。本实验中巴戟天丸组方可逆转Aβ损伤成骨细胞GSH、SOD、CAT活性的降低， MDA活性的升高，结果所表现的剂量依赖与增殖实验相吻合，表明巴戟天丸组方可作为抗氧化剂改善成骨细胞的氧化损伤。后采用网络药理学方法进一步探究巴戟天丸干预Aβ损伤成骨细胞的作用机制，结果显示，巴戟天丸促进Aβ损伤状态下成骨细胞骨形成的作用可能与AGE-RAGE、PI3K-Akt及MAPK等信号通路有关。其中，AGE-RAGE信号通路的激活会扰乱细胞的氧化还原平衡并调节各种细胞死亡途径 [13]。作为AGE-RAGE信号通路的下游， PI3K-Akt信号通路的激活会增强细胞的抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激[14]。此外，MAPK通路的激活同样可以减轻氧化应激状态[15]，故网络药理学研究结果同样提示巴戟天丸组方可通过缓解氧化损伤发挥干预Aβ沉积损伤成骨细胞的作用。
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图 1 DLin-Blank和DLin@mRNA的电位和粒径检测结果图
A. DLin@mRNA的粒径;B. DLin-Blank的粒径C.DLin@mRNA的Zeta 电位;D. DLin-Blank的Zeta 电位
图 5 核酸转染实验结果
A. RM-1细胞使用各载体转染EGFP-mRNA结果图（标尺为50 μm）；B. RM-1细胞使用各载体转染EGFP-mRNA荧光统计结果（n=3)；*P<0.05，与Lipo8000组比较
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