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据世界卫生组织最新数据，截至2023年3月7日，全球已报告新型冠状病毒肺炎（COVID-19）确诊病例约7.6亿例，死亡超过686万例[1]。目前，抗病毒治疗可以抑制病毒复制，加快病毒清除，减轻炎症及免疫反应等，被认为是降低COVID-19重症率、住院率及死亡率的重要手段之一[2]。2021年12月，美国食品药品监督管理局批准奈玛特韦片/利托那韦片组合包装（Paxlovid）的紧急使用授权申请，使其成为治疗COVID-19的新型口服药物。2022年2月，国家药品监督管理局附条件批准Paxlovid进口注册[3]，用于成人伴有进展为重症高风险因素的轻至中度COVID-19患者。国外多项研究已经证实，Paxlovid能显著降低COVID-19患者的病毒载量、全因住院率、重症率和死亡率等[4-5]。然而，目前罕见报道中国人群使用Paxlovid的疗效等相关数据。鉴于人种差异及病毒变异，开展此类研究十分必要。本研究旨在探索中国人群中Paxlovid对COVID-19患者早期预后不良的危险因素，并构建预测模型，以期为提高该类患者的救治效果提供参考。
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回顾性分析2023年1月至2023年3月于闽南地区3家军队三甲医院（第九〇九医院、第九一〇医院和陆军第七十三集团军医院）使用Paxlovid的COVID-19住院患者。纳入标准：①COVID-19患者，诊断及临床分型符合《新型冠状病毒感染诊疗方案（试行第10版）》的标准[6]；②年龄≥18岁；③用药时间≥3 d。排除标准：①未使用Paxlovid的患者；②Paxlovid停药28 d内失访的患者；③合并心、肺、肝、肾等重要器官严重损害者；④联合与Paxlovid存在严重相互作用的药物；⑤资料不全者等。本研究经牵头单位第九〇九医院伦理委员会批准通过。
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收集患者的一般资料（性别、年龄、体重）、发病天数、Paxlovid疗程，合用药及辅助治疗情况、用药前的检查指标[血氧饱和度、核酸检测阈值循环数（CT值）、淋巴细胞计数、估算的肾小球滤过率（eGFR）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、肌酸激酶（CK）、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、D-二聚体等]、合并疾病[高血压、动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）、慢性肺病等]；结局指标[6]：Paxlovid停药28 d内若出现死亡或进展为重型、危重型COVID-19者则定义为早期预后不良；若Paxlovid停药28 d内出现COVID-19中型、轻型或痊愈者以及停药超过28 d出现死亡或进展为重型、危重型COVID-19者则定义为非早期预后不良。发病天数定义为患者首次出现临床症状或获得核酸检测阳性结果至第一次使用Paxlovid的日期。
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运用SPSS 21.0软件进行统计分析，连续变量符合正态性分布的数据，采用（
$ \bar{x} $ ±s）表示，组间采用独立Student’s t检验；不符合正态性分布的数据采用中位数（四分位数间距）表示，组间采用Man-Whitney U检验；二分类变量以例数表示，采用χ2检验。单因素分析中P<0.05的变量，以向后LR法进入二元Logistic回归分析。采用受试者工作特征曲线（ROC）计算曲线下面积（AUC）评估模型的预测效能。P<0.05表示差异具有统计学意义。 -
2023年1月至2023年3月于闽南地区3家军队三甲医院使用Paxlovid治疗的COVID-19住院患者共129例，经筛选最终纳入92例进行分析。其中，男69例（75.00%），女23例（25.00%），平均年龄（76.26±15.81）岁，体重（62.86±10.69）kg，发病天数（8.60±5.94）d，核酸检测CT值（27.84±5.52）。
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92例Paxlovid治疗的COVID-19患者中，早期预后不良者有31例（33.70%），其中，死亡11例（35.48%），危重型17例（54.84%），重型3例（9.68%）。
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比较早期预后不良组与非早期预后不良组的患者一般资料、发病天数、检查指标、合并疾病、合用药及辅助治疗等情况，结果显示两组在发病天数、淋巴细胞计数、AST、CRP、PCT、D-二聚体等12项临床指标有相关性（P<0.05)，见表1。
表 1 两组患者临床资料的单因素分析
项目 非早期预后不良组（n=61） 早期预后不良组（n=31） 统计量 P值 年龄（岁，$ \bar{x} $±s） 77.16±16.47 74.42±14.52 0.785 0.434 性别[女，n（%）] 16（26.23） 7（22.58） 0.146 0.702 体重（m/kg，$ \bar{x} $±s） 63.99±10.09 60.63±11.63 1.430 0.156 发病天数（t/d，$ \bar{x} $±s） 7.72±5.46 12.48±6.56 −3.693 <0.001 血氧饱和度（%，$ \bar{x} $±s） 94.01±4.97 90.91±10.76 1.894 0.061 核酸检测CT值（$ \bar{x} $±s） 28.31±5.64 26.90±5.24 1.158 0.250 淋巴细胞计数（×109/L，$ \bar{x} $±s） 0.98±0.59 0.62±0.44 2.992 0.040 eGFR[ml/（min·1.73 m2），$ \bar{x} $±s] 68.29±30.56 57.20±38.44 1.505 0.136 ALT[U/L，M（P25,P75）] 22.90（9.00，121.00） 23.00（6.00，237.20） −0.450 0.653a AST[U/L，M（P25,P75）] 31.00（13.50，88.00） 37.40（21.00，306.20） 2.747 0.006a TG（mmol/L，$ \bar{x} $±s） 1.36±0.87 1.50±0.76 −0.782 0.436 TC（mmol/L，$ \bar{x} $±s） 3.95±0.94 3.59±1.19 1.555 0.123 LDL-C（mmol/L，$ \bar{x} $±s） 2.19±0.69 2.01±0.97 0.998 0.321 HDL-C（mmol/L，$ \bar{x} $±s） 1.14±0.32 1.00±0.44 1.664 0.100 CK（U/L，$ \bar{x} $±s） 145.23±253.51 148.21±107.09 −0.062 0.950 CRP（mg/L，$ \bar{x} $±s） 52.41±46.71 118.72±82.74 −4.918 <0.001 PCT[ng/ml，M（P25,P75）] 0.07（0.01，27.60） 1.40（0.01，42.95） 4.366 <0.001a D−二聚体[μg/ml，M（P25,P75）] 0.79（0.19，11.39） 2.17（0.36，41.83） 4.254 <0.001a 用药前已使用其他抗新冠病毒药物治疗[n（%）] 1（1.64） 5（16.13） 7.079 0.008 用药前已行呼吸机辅助通气[n（%）] 10（16.39） 19（61.29） 19.194 <0.001 合并疾病 高血压[n（%）] 39（63.93） 20（64.52） 0.003 0.956 糖尿病[n（%）] 16（26.23） 14（45.16） 3.352 0.067 ASCVD[n（%）] 29（47.54） 15（48.39） 0.006 0.939 慢性肺病[n（%）] 19（31.15） 5（16.13） 2.404 0.121 治疗方案 Paxlovid疗程（t/d，$ \bar{x} $±s） 4.74±0.68 5.26±2.05 −1.805 0.074 联合免疫抑制剂[n（%）] 42（68.85） 29（93.55） 7.116 0.008 联合抗凝药[n（%）] 36（59.02） 29（93.55） 11.821 0.001 联合抗菌药物[n（%）] 46（75.41） 30（96.77） 6.530 0.011 联合俯卧位治疗[n（%）] 8（13.11） 9（29.03） 3.457 0.088 联合呼吸机辅助通气[n（%）] 11（18.03） 25（80.65） 33.831 <0.001 注：a表示Mann-Whitney U检验。 -
采用二元Logistic回归分析，结果显示其中发病天数、淋巴细胞计数、AST、CRP和联合呼吸机辅助通气等5项临床指标是Paxlovid早期预后不良的独立危险因素，见表2。上述5项独立危险因素构建Logistic模型方程，Logit（P）=−8.371+0.126X发病天数+2.019X淋巴细胞计数+0.023XAST+0.016XCRP+3.528X联合呼吸机辅助通气。采用H-L法（Hosmerand-Lemeshow test）对模型的拟合度进行检验，结果显示模型拟合良好（χ2值=10.480，P=0.233），模型的理论准确度为89.10%。
表 2 Paxlovid早期预后不良多因素logistic分析
项目 回归系数B 标准误S.E 卡方值Waldχ2 自由度df 比值比OR 95%CI置信区间 P值 发病天数(t/d) 0.126 0.061 4.237 1 1.135 1.006~1.279 0.040 淋巴细胞计数 2.019 0.892 5.126 1 7.527 1.311~43.208 0.024 AST 0.023 0.009 6.578 1 1.023 1.005~1.041 0.010 CRP 0.016 0.007 5.744 1 1.016 1.003~1.029 0.017 联合呼吸机辅助通气 3.528 1.054 11.194 1 34.051 4.311~268.936 0.001 常量 −8.371 2.080 16.195 1 <0.001 -
将上述回归方程转换后得出联合预测因子的计算公式，Y联合预测因子=7.875X发病天数+126.188X淋巴细胞计数+1.438XAST+XCRP+220.500X联合呼吸机辅助通气，计算92例患者的Y联合预测因子值，绘制ROC曲线，见图1。分别计算发病天数、淋巴细胞计数、AST、CRP和联合呼吸机辅助通气和联合预测因子AUC，其中联合预测因子AUC最大为0.939（P<0.001），预测价值最优。取约登（Youden）指数最大时即0.756，最佳临界值447.920，敏感度0.903，特异性0.852，见表3。
图 1 各独立危险因素及联合预测因子的ROC曲线
表 3 各危险因素对Paxlovid早期预后不良的预测价值
项目 最佳临界值 敏感度 特异性 约登指数 AUC（95%CI） P值 发病天数（t/d） 14.500 0.387 0.951 0.338 0.722（0.614~0.831） 0.001 淋巴细胞计数 1.685 0.355 0.934 0.289 0.582（0.449~0.715） 0.202 AST 31.950 0.839 0.557 0.396 0.676（0.566~0.786） 0.006 CRP 104.500 0.548 0.869 0.417 0.772（0.672~0.871） <0.001 联合呼吸机辅助通气 0.500 0.806 0.820 0.626 0.813（0.715~0.911） <0.001 联合预测因子 447.920 0.903 0.852 0.756 0.939（0.885~0.993） <0.001 -
Paxlovid是奈玛特韦片150 mg和利托那韦片100 mg组成的组合包装。奈玛特韦是一种SARS-CoV-2主要蛋白酶Mpro3C-样蛋白酶（3CLpro）的拟肽类抑制剂，能抑制病毒复制。利托那韦是HIV-1蛋白酶抑制剂，对新冠病毒SARS-CoV-2 Mpro无活性，但可以通过抑制肝药酶CYP3A介导的奈玛特韦代谢，升高奈玛特韦血药浓度，而发挥协同作用[7]。本研究中，33.70%使用Paxlovid治疗的COVID-19患者出现早期预后不良，其原因可能与药物特点和患者因素有关。据文献报道[8]，大量Mpro突变可能诱导对Paxlovid的抗药性，从而导致治疗失败影响患者预后，但另有研究表明，在对731份样本进行分析后，并未发现Mpro突变和Paxlovid治疗失败之间存在显著的联系[9]。同时，有文献报道Paxlovid治疗后7 d和30 d的COVID-19复发率分别为3.53%和5.40%[10]，通常患者的病情较轻，但仍有1.35%的患者出现呼吸衰竭需入住ICU[11]。
患者的发病天数是影响Paxlovid早期预后不良的独立危险因素之一。《新型冠状病毒感染诊疗方案（试行第10版）》推荐Paxlovid用于发病5 d以内的轻、中型且伴有进展为重症高风险因素的成年患者[6]。有文献报道发病时间超过5 d，核酸检测CT值<30者也可使用Paxlovid[12]。但在变异毒株奥密克戎感染的情况下，绝大多数二次传播发生在症状出现后5 d之内，在症状出现后8 d未检测到传染性病毒[13-14]。因此，Paxlovid治疗发病5 d后患者的有效性和安全性目前尚不明确。本研究结果显示，患者发病时间越长，Paxlovid治疗的预后越差。
一项针对国内125例COVID-19住院患者临床特征的研究显示，1/3的患者出现淋巴细胞计数降低，约20%患者存在不同程度的ALT和AST升高，70.4%患者的CRP高于正常范围，且与非危重患者相比，危重患者的淋巴细胞水平更低，CRP、IL-6等炎症指标更高，差异具有统计学意义（P<0.05）[15]。从本研究结果同样可以看出，较低的淋巴细胞计数和较高的AST、CRP均提示COVID-19患者进展为危重型的风险高，故使用Paxlovid治疗的预后效果较差。
联合呼吸机辅助通气仅适用于出现呼吸衰竭的危重型COVID-19患者。本研究结果显示，Paxlovid联合呼吸机辅助通气治疗时早期预后不良的风险高，推测可能与重型、危重型COVID-19患者使用Paxlovid抗病毒治疗效果不佳有关。Paxlovid说明书及第10版诊疗方案仅推荐Paxlovid用于有重症高风险因素的轻至中度COVID-19患者。Paxlovid在国外获批上市主要基于一项EPIC-HR研究，该研究纳入的人群同样是重症高风险因素、轻至中度成年的COVID-19患者[9]。因此，对于重型、危重型COVID-19患者使用Paxlovid的循证依据不足。
目前仍缺乏构建预测模型以评估Paxlovid治疗后早期预后不良的风险。根据本研究所构建方程发现，当Y联合预测因子值大于447.920时，提示Paxlovid治疗后早期预后不良的风险高，建议采取更积极的治疗措施包括联合其他抗COVID-19药物等。本研究可能存在不足之处，未来可通过大规模的临床应用和更多临床研究数据提供足够的循证依据。
Risk factors of poor early prognosis in the treatment of COVID-19 with nematevir and ritonavir tablets and the establishment of prediction model
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摘要:
目的 探讨奈玛特韦片/利托那韦片（Paxlovid）对新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者早期预后不良的危险因素并构建预测模型，以期为提高该类患者的救治效果提供参考。 方法 回顾性分析2023年1月至2023年3月于闽南地区3家军队三甲医院使用Paxlovid治疗的COVID-19住院患者92例，收集临床指标进行单因素和多因素分析，筛选出Paxlovid早期预后不良的独立危险因素，对Logistic模型方程进行转换建立联合预测因子，采用ROC曲线确定联合预测因子的曲线下面积（AUC）及最佳临界值。 结果 92例患者中，早期预后不良者31例（33.70%），其中，死亡11例（35.48%），危重型17例（54.84%），重型3例（9.68%）。多因素Logistic回归分析结果显示，发病天数、淋巴细胞计数、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、C反应蛋白（CRP）和联合呼吸机辅助通气是使用Paxlovid早期预后不良的独立危险因素。以上述独立危险因素构建联合预测因子（Y）的计算公式，Y联合预测因子=7.875X发病天数+126.188X淋巴细胞计数+1.438XAST+XCRP+220.500X联合呼吸机辅助通气，绘制ROC曲线，联合预测因子的ROC曲线下面积最大为0.939，预测价值最优，约登指数（Youden）最大时（0.756）对应ROC曲线最佳临界值为447.920，模型的理论准确度为89.10%。 结论 发病天数、淋巴细胞计数、AST、CRP和联合呼吸机辅助通气是使用Paxlovid早期预后不良的独立危险因素，用药前可通过上述各危险因素计算联合预测因子，当预测结果大于447.920时，应采取更积极的治疗措施包括联合其他抗COVID-19药物等，以提高患者的救治效果。 Abstract:Objective To explore risk factors of poor early prognosis in the treatment of COVID-19 by nematevir and ritonavir tablets Paxlovid and establish the prediction model to provide reference for improving the effect of such patients. Methods 92 inpatients of COVID-19 treated with Paxlovid in three military tertiary hospital in southern Fujian from January 2023 to March 2023 were retrospectively analyzed. The clinical indicators of 92 inpatients were collected for univariate and multivariate analysis by single factor and multiple factors and the independent risk factors of poor early prognosis in Paxlovid were screened out. Logistic model equation was transformed to construct the combined predictors, and ROC curve was used to determine the area under the curve (AUC) and the optimal critical value of the combined predictors. Results Among 92 patients, 31 (33.70%) developed poor early prognosis, including 11 deaths (35.48%), 17 critical cases (54.84%) and 3 severe cases (9.68%). Multi-factor Logistic regression analysis showed that the disease days, lymphocyte count, aspartate aminotransferase(AST), C reactive protein(CRP) and ventilator-assisted ventilation were independent risk factors for poor early prognosis in Paxlovid. A formula for calculating the combined predictors (Y) was established as Ycombinedpredictors=7.875Xdisease days+126.188Xlymphocyte count+1.438XAST+XCRP+220.500Xventilator-assisted ventilation based on the above independent risk factors, and the ROC curve was drawn. With the maximum area under the ROC curve of the combined predictors being 0.939, the prediction value was best, and the optimal critical value of the ROC curve corresponding to the maximum Youden index (0.756) was 447.920.Theoretical accuracy of the model was 89.10%. Conclusion The disease days, lymphocyte count, AST, CRP and ventilator-assisted ventilation were independent risk factors for poor early prognosis in Paxlovid. Combined predictors could be calculated by the above risk factors before medication. The efficiency should be improved by taking more active treatment, including combining with other anti-COVID-19 drugs when the prediction result exceeds 447.920. -
Key words:
- Naimatwe/Litonavir /
- COVID-19 /
- poor prognosis /
- risk factor /
- prediction model
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水合氯醛，又称水合三氯乙醛，具有镇静、催眠、抗惊厥等作用，临床上以溶液口服或灌肠方式给药。但水合氯醛稳定性较差，临床使用制成溶液制剂有效期很短，其主要的杂质有三氯甲烷、甲酸、氯乙酸等，其中三氯甲烷是原料生产与储存过程中比较重要的降解杂质[1]。国内较多数的文献对水合氯醛及其制剂的稳定性研究采用滴定法或紫外法[2-3]，此方法准确度差，专属性不足，不能准确评估水合氯醛及其制剂的质量状况。目前，《中国药典》以及国外各国药典收载的水合氯醛及其制剂的质量标准中有关的检查方法专属性均较低[4-7]。
各国药典中鉴别、酸度、炽灼残渣与溶液澄清度是水合氯醛药物的基本理化分析项，醇合三氯乙醛则为控制本品合成过程中产生的一种杂质。水合氯醛在生产、运输过程中可能产生的降解杂质有甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等，现有的法定标准对此部分降解产物未进行控制，有关物质项存在缺失。本文旨在对主要降解产物进行定量检测，如甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸进行检测方法开发，其中，水合氯醛通过碳碳键断裂降解成等比例甲酸、三氯甲烷，检测甲酸或检测三氯甲烷均可。
三氯甲烷主要采用气相、气质色谱法[8-10]进行检查，氯乙酸等卤代羧酸可采用液相色谱法和离子色谱法[11-13]分析，水合氯醛专属性较强的检测方法为气相色谱法[10-14]。因卤代羧酸具有沸点高、强极性特点，不易气化，无法直接进样进行气相色谱分析，需进行衍生化处理，故本文将卤代羧酸检测方法与三氯甲烷检测方法分别开发建立。
1. 实验部分
1.1 仪器与试剂
Thermo trace 1300 GC（赛默飞气相色谱仪）；电子天平 ME-204E（梅特勒科技）；三氯甲烷 （北京通广试剂公司）；氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸（标准品，CATO）；正庚烷（fisher）；甲醇、硫酸、硫酸钠；水合氯醛（青岛宇龙海藻药业，批号20190403）。
1.2 色谱条件
色谱柱温：40 ℃保持3 min；以5 ℃/min的速度升至80 ℃，以20 ℃/min升至160 ℃，再以30 ℃/min升至250 ℃；进样口温度：150 ℃；检测器：ECD，温度280 ℃；色谱柱：DB-5.625 30 m×0.25 mm，0.25 μm；进样体积1 μl。
1.3 供试品与对照品溶液配制
分别确定水合氯醛检测三氯甲烷和卤代羧酸的样品处理方法，详见表1。
表 1 三氯甲烷与卤代羧酸检测样品前处理方法溶液名称 前处理1 前处理2 供试品溶液（测定卤代羧酸） / 称取水合氯醛约10 mg，置50 ml具塞试管中，精密加入甲醇2 ml，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入
20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得。卤代羧酸对照品溶液 / 分别称取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸适量，分别用甲醇配制成浓度为100 μg/ml的储备液，取1 ml置10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度即得；取上述溶液各1 ml，置50 ml具塞试管中，精密加入1 ml甲醇，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热
40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得各对照品溶液。供试品溶液（测定三氯甲烷） 称取水合氯醛约10 mg，置10 ml具塞试管中，加甲醇溶液完全，定容后过滤取续滤液即得。 称取水合氯醛约100 mg，置10 ml具塞试管中，加入饱和氯化钠溶液
0.35 ml，氯化钠0.5 g，正己烷5 ml，密塞，振摇提取，静置20 min，取正己烷层，取续滤液即得。三氯甲烷对照品溶液 称取三氯甲烷适量，甲醇溶解至
60 μg/ml即得。称取三氯甲烷适量，用正己烷配置成浓度为20 μg/ml的储备液；取1 ml置10 ml量瓶中，用正己烷定容至刻度即得。 2. 结果与讨论
2.1 卤代羧酸检测分析方法验证
2.1.1 系统适用性试验
按照图1方法，配制用于氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸检测的对照品溶液，并按照“1.2色谱条件”进样检测，结果如下。
对照品溶液浓度分别为氯乙酸 9.95 μg/ml，二氯乙酸 13.49 μg/ml，三氯乙酸9.45 μg/ml，连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的保留时间分别为4.33、5.89和7.38 min，各峰面积RSD分别为0.75%、1.00%、1.00%，满足系统适用性要求。衍生化转化目标物更容易被气化，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸经衍生化后分别以氯乙酸乙酯、二氯乙酸乙酯、三氯乙酸乙酯形式被检测。
2.1.2 线性关系考察
分别取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸对照品适量，加甲醇溶解稀释制成浓度为10 μg/ml的储备液，分别取储备液适量置具塞试管中，按照表1衍生化处理后，取正庚烷层，即得各自的工作曲线样品溶液，按照“1.2色谱条件”进样检测，以峰面积为纵坐标，相应卤代羧酸浓度为横坐标，进行线性回归。结果见表2，并按照信噪比大于3和大于10分别规定检测限和定量限。
表 2 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸线性试验结果样品名称 线性方程 回归系数 r 线性范围(μg/ml) 检测限(μg/ml) 定量限(μg/ml) 氯乙酸 Y=0.0042X+0.0002 0.9997 0.25~5 0.025 0.05 二氯乙酸 Y=0.1106X+0.005 0.9998 0.125~2.5 0.05 0.125 三氯乙酸 Y=0.32X+0.0164 0.9998 0.0625~2.5 0.01 0.0625 将上述信噪比满足定量限的各对照品溶液连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD为别为5.27%、1.94%、1.15%，显示各目标物的定量限浓度下检测精密度满足要求（RSD<15%）。
2.1.3 重复性试验
按表1前处理方法进行配制供试品溶液和对照品溶液，平行取6份供试品溶液，连续采集，记录并计算各供试品溶液中氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的含量，氯乙酸均未检出，二氯乙酸含量RSD为4.43%，三氯乙酸含量结果RSD为4.56%，按照本方法进行卤代羧酸含量检测，含量结果RSD均小于6%。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求[15]，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）重复性要求RSD小于6%。本方法重复性满足要求。
2.1.4 准确度试验
采用加样回收率进行方法准确度考察，精密称取10 mg水合氯醛原料药10份，分别置10个50 ml锥形瓶中，编号1~3加入混合对照品溶液1.2 ml，编号4~6加入混合对照品溶液1 ml，编号7~9加入混合对照品溶液0.8 ml，上述混合对照品溶液中，氯乙酸浓度为 9.95 μg/ml，二氯乙酸 浓度为13.49 μg/ml，三氯乙酸浓度为9.45 μg/ml，第10份不加混合对照品溶液，同步取样混合对照品1 ml置50 ml锥形瓶中，得到11份样品，按照表2衍生化处理，取正庚烷层进样检测，结果如表3。
表 3 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸准确度试验结果编号 原有量（m/mg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 1 10.23 3.00 3.00 3.00 3.14 2.88 3.11 104.5 95.45 95.82 2 10.17 3.00 3.00 3.00 2.72 2.85 2.99 90.64 94.35 91.75 3 9.97 3.00 3.00 3.00 2.61 2.70 3.35 86.99 89.44 103.7 4 10.00 2.50 2.50 2.50 2.46 2.38 2.51 98.25 94.44 91.13 5 9.95 2.50 2.50 2.50 2.13 2.44 2.50 85.09 96.70 90.44 6 10.08 2.50 2.50 2.50 2.52 2.35 2.48 100.9 93.22 89.86 7 10.11 2.00 2.00 2.00 1.71 1.89 2.03 85.53 93.40 89.49 8 9.88 2.00 2.00 2.00 1.82 1.86 2.05 91.01 91.88 90.83 9 10.01 2.00 2.00 2.00 1.78 1.88 2.09 88.82 92.87 92.85 按照本方法进行卤代羧酸含量检测准确度试验，回收率结果符合相关要求。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）回收率限度要求为80%~115%。本方法准确度满足要求。
2.1.5 稳定性试验
取“2.1.1”项下的各对照品溶液，分别于24 h内不同时间进样检测，结果显示氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD分别为4.0%、2.1%、1.6%，表明本方法样品溶液24 h内稳定性良好。
2.2 三氯甲烷检测方法学验证
2.2.1 专属性考察
分别按照表1中两种前处理方式配制对照品溶液、供试品溶液。前处理1测定色谱图见图2，前处理2测定色谱图见图3。在上述色谱条件下，两种前处理使用的正己烷和甲醇均不干扰三氯甲烷的测定，三氯甲烷保留时间约为2.5 min。
2.2.2 重复性与系统适用性试验
分别按照前处理1和前处理2方法制备6份供试品；另取三氯甲烷对照品适量，分别用甲醇溶解稀释至60 μg/ml；用正己烷溶解稀释至2 μg/ml。将以上供试品与对照品，按照“1.2 色谱条件”进样检测，结果见表4。
表 4 三氯甲烷检测方法重复性试验样品名称 前处理方法1 前处理方法2 峰面积 含量（%） 峰面积 含量（%） 对照品溶液 1.5129 / 0.2863 / 供试品1 0.7824 3.19 0.0608 0.00212 供试品2 1.4486 5.91 0.0616 0.00215 供试品3 1.6091 6.56 0.0596 0.00208 供试品4 0.6147 2.51 0.0582 0.00203 供试品5 0.8345 3.40 0.0653 0.00228 供试品6 1.0321 4.21 0.0679 0.00237 RSD（%） 37.46 5.89 因水合氯醛对热不稳定，熔点低57 ℃，在高温条件下碳碳键断裂产生三氯甲烷和甲酸，直接进样或顶空进样均可导致水合氯醛降解而使检测结果偏高，不能反映其实际三氯甲烷含量。而且依据ICH Q3C（R6）残留溶剂指导原则，三氯甲烷属于药品生产中应限制使用的溶剂（二类溶剂），其限度要求是60 ppm（即残留上限0.006%），结合本品原料药检测结果与重复性结果，前处理方法2检测结果准确真实。
连续进样5针正己烷配制的三氯甲烷对照品溶液，峰面积RSD为2.45%，表明本法的系统适用性试验结果良好。
2.2.3 线性与范围
精密称取三氯甲烷对照品，用正己烷溶解稀释至20 μg/ml，分别取其中0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 ml置10 ml量瓶，用正己烷稀释至刻度即得工作曲线样品，按照“1.2 色谱条件”进样，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程Y=0.1094X+0.0222, r =0.9998，表明三氯甲烷在浓度0.2408~3.011 μg/ml范围内线性良好。将三氯甲烷对照品溶液逐级稀释，得0.02、0.001 μg/ml进样分析，信噪比分别为14和4，分别为定量限和检测限。
2.2.4 三氯甲烷检测准确度试验
取水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2配制，平行9份，编号1~3加入0.6 ml对照品溶液，编号4~6加入对照品储备液0.5 ml，编号7~9加入对照品储备液0.6 ml，分别置10 ml离心管中，加入饱和氯化钠0.5 ml，氯化钠0.5 g，4.4 ml正己烷，振摇溶解，静置30 min，分别取正己烷层进样检测，结果见表5。
表 5 三氯甲烷检测准确度试验样品编号 加入量（m/μg） 检测值（m/μg） 本底值（m/μg） 回收率（%） 供试品1 1.2042 2.30 1.19 91.53 供试品2 1.2042 2.18 1.19 81.70 供试品3 1.2042 2.39 1.19 99.71 供试品4 10.79 11.77 1.81 92.32 供试品5 10.79 11.60 1.81 90.71 供试品6 10.79 11.79 1.81 92.46 供试品7 12.948 13.25 1.81 88.29 供试品8 12.948 12.81 1.81 84.94 供试品9 12.948 14.04 1.81 94.41 按照本方法进行三氯甲烷含量检测的准确度试验，回收率符合《中国药典》相关要求。
2.2.5 三氯甲烷检测溶液稳定性
取三氯甲烷对照品、水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2进行配制对照品溶液、供试品溶液，按“1.2色谱条件”进样检测，考察24 h内不同时间样品的稳定性，结果显示供试品与对照品稳定性均小于5.0%，稳定性良好。
2.3 水合氯醛稳定性试验
水合氯醛具有较强的挥发性与引湿性，在高温条件下挥发与降解性能均增强，结合《中国药典》2020年版药品稳定性试验技术要求，对本品进行影响因素试验与加速试验考察。将水合氯醛置样品瓶（封口）中，分别置温度25 ℃/湿度75%，温度40 ℃/湿度75%，温度60 ℃/湿度60%以及温度25 ℃/湿度60%、光照强度4500 lx条件下考察，并于不同时间点检测杂质含量变化，结果见表6。
表 6 水合氯醛稳定性试验结果放置条件 时间（t/d） 检测结果（%） 三氯乙酸 二氯乙酸 三氯甲烷 氯乙酸 温度25 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.004 未检出 30 0.001 0.003 0.004 未检出 温度40 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.152 未检出 30 0.001 0.003 0.323 未检出 温度60 ℃/湿度60% 10 0.001 0.004 0.546 未检出 30 0.001 0.004 0.871 未检出 温度25 ℃/湿度60%、
光照强度4500 lx10 0.001 0.003 0.045 未检出 30 0.001 0.003 0.151 未检出 以上数据显示，水合氯醛原料受温度和光照影响较大，主要的降解产物为碳碳键断裂的水解产物三氯甲烷，卤代羧酸未有明显的改变。三氯甲烷是主要的降解产物，其中三氯甲烷为二类毒性溶剂，但目前水合氯醛的国内外法定标准中均无三氯甲烷的含量检测和限度要求，且水合氯醛本身具有较大的毒性，则其降解产物的限度仍需结合长期稳定性结果和临床使用的安全性、有效性进行综合评估。另本次试验采用称量瓶封口存放，密封性不佳，会加速水合氯醛的挥发水解，本品应室温避光密封保存；在制剂研发和存储运输过程中，应严格控制温度与光照影响。
3. 结论
本文建立了气相色谱法测定水合氯醛原料药中杂质三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。利用检测目标物的理化性质，采用不同前处理方法进行三氯甲烷、卤代羧酸的检测，色谱峰形良好，方法简单、准确度高、重复性良好，可避免水合氯醛检测过程中的自身降解，准确高效的检测药物中杂质含量，满足目前市售原料及其制剂的检测需求。
本法中，三氯甲烷检测限浓度为供试品浓度的万分之0.005（0.5 ppm）；氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.1（10 ppm）；二氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.2（20 ppm）；三氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.04（4 ppm）。本品多次检测以及稳定性试验中均未出现氯乙酸，说明本品中确无高于检出限的残留，也不易降解产生。
通过水合氯醛的稳定性实验发现，本品在温度、光照条件下均会发生降解，三氯甲烷为主要的降解产物，故进行本品相关制剂的研发、检测、生产和运输过程中需要严格控制生产工艺与储存条件，保证产品的质量稳定，保障用药安全性。
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表 1 两组患者临床资料的单因素分析
项目 非早期预后不良组（n=61） 早期预后不良组（n=31） 统计量 P值 年龄（岁， $ \bar{x} $ ±s）77.16±16.47 74.42±14.52 0.785 0.434 性别[女，n（%）] 16（26.23） 7（22.58） 0.146 0.702 体重（m/kg， $ \bar{x} $ ±s）63.99±10.09 60.63±11.63 1.430 0.156 发病天数（t/d， $ \bar{x} $ ±s）7.72±5.46 12.48±6.56 −3.693 <0.001 血氧饱和度（%， $ \bar{x} $ ±s）94.01±4.97 90.91±10.76 1.894 0.061 核酸检测CT值（ $ \bar{x} $ ±s）28.31±5.64 26.90±5.24 1.158 0.250 淋巴细胞计数（×109/L， $ \bar{x} $ ±s）0.98±0.59 0.62±0.44 2.992 0.040 eGFR[ml/（min·1.73 m2）， $ \bar{x} $ ±s]68.29±30.56 57.20±38.44 1.505 0.136 ALT[U/L，M（P25,P75）] 22.90（9.00，121.00） 23.00（6.00，237.20） −0.450 0.653a AST[U/L，M（P25,P75）] 31.00（13.50，88.00） 37.40（21.00，306.20） 2.747 0.006a TG（mmol/L， $ \bar{x} $ ±s）1.36±0.87 1.50±0.76 −0.782 0.436 TC（mmol/L， $ \bar{x} $ ±s）3.95±0.94 3.59±1.19 1.555 0.123 LDL-C（mmol/L， $ \bar{x} $ ±s）2.19±0.69 2.01±0.97 0.998 0.321 HDL-C（mmol/L， $ \bar{x} $ ±s）1.14±0.32 1.00±0.44 1.664 0.100 CK（U/L， $ \bar{x} $ ±s）145.23±253.51 148.21±107.09 −0.062 0.950 CRP（mg/L， $ \bar{x} $ ±s）52.41±46.71 118.72±82.74 −4.918 <0.001 PCT[ng/ml，M（P25,P75）] 0.07（0.01，27.60） 1.40（0.01，42.95） 4.366 <0.001a D−二聚体[μg/ml，M（P25,P75）] 0.79（0.19，11.39） 2.17（0.36，41.83） 4.254 <0.001a 用药前已使用其他抗新冠病毒药物治疗[n（%）] 1（1.64） 5（16.13） 7.079 0.008 用药前已行呼吸机辅助通气[n（%）] 10（16.39） 19（61.29） 19.194 <0.001 合并疾病 高血压[n（%）] 39（63.93） 20（64.52） 0.003 0.956 糖尿病[n（%）] 16（26.23） 14（45.16） 3.352 0.067 ASCVD[n（%）] 29（47.54） 15（48.39） 0.006 0.939 慢性肺病[n（%）] 19（31.15） 5（16.13） 2.404 0.121 治疗方案 Paxlovid疗程（t/d， $ \bar{x} $ ±s）4.74±0.68 5.26±2.05 −1.805 0.074 联合免疫抑制剂[n（%）] 42（68.85） 29（93.55） 7.116 0.008 联合抗凝药[n（%）] 36（59.02） 29（93.55） 11.821 0.001 联合抗菌药物[n（%）] 46（75.41） 30（96.77） 6.530 0.011 联合俯卧位治疗[n（%）] 8（13.11） 9（29.03） 3.457 0.088 联合呼吸机辅助通气[n（%）] 11（18.03） 25（80.65） 33.831 <0.001 注：a表示Mann-Whitney U检验。 
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表 2 Paxlovid早期预后不良多因素logistic分析
项目 回归系数B 标准误S.E 卡方值Waldχ2 自由度df 比值比OR 95%CI置信区间 P值 发病天数(t/d) 0.126 0.061 4.237 1 1.135 1.006~1.279 0.040 淋巴细胞计数 2.019 0.892 5.126 1 7.527 1.311~43.208 0.024 AST 0.023 0.009 6.578 1 1.023 1.005~1.041 0.010 CRP 0.016 0.007 5.744 1 1.016 1.003~1.029 0.017 联合呼吸机辅助通气 3.528 1.054 11.194 1 34.051 4.311~268.936 0.001 常量 −8.371 2.080 16.195 1 <0.001
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表 3 各危险因素对Paxlovid早期预后不良的预测价值
项目 最佳临界值 敏感度 特异性 约登指数 AUC（95%CI） P值 发病天数（t/d） 14.500 0.387 0.951 0.338 0.722（0.614~0.831） 0.001 淋巴细胞计数 1.685 0.355 0.934 0.289 0.582（0.449~0.715） 0.202 AST 31.950 0.839 0.557 0.396 0.676（0.566~0.786） 0.006 CRP 104.500 0.548 0.869 0.417 0.772（0.672~0.871） <0.001 联合呼吸机辅助通气 0.500 0.806 0.820 0.626 0.813（0.715~0.911） <0.001 联合预测因子 447.920 0.903 0.852 0.756 0.939（0.885~0.993） <0.001
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