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拉莫三嗪是一种苯基三嗪类药物,化学名为6-(2,3-二氯苯基)-1,2,4-三嗪-3,5-二胺,属于第二代抗癫痫药物,临床上常被用于治疗部分性发作癫痫、难治性癫痫、青少年肌阵挛癫痫、癫痫持续状态等[1-4]。拉莫三嗪不经细胞色素P450酶代谢,主要由尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)作用,与葡萄糖醛酸键合,生成无药理活性的代谢物[5]。同其他抗癫痫类药物一样,拉莫三嗪治疗范围(3~14 μg/ml)较窄,易发生中毒反应。
研究拉莫三嗪治疗的446例患者中有20.88%发生不良反应,最常见的有头痛、皮疹、乏力等,严重不良反应有DIC、Lyell综合征、Stevens-Johnson综合征等,研究认为这可能与拉莫三嗪的血药浓度有关[6-7]。因此,随着拉莫三嗪在临床上的广泛应用,治疗药物监测(TDM)成为指导拉莫三嗪合理用药的一种安全有效的手段。本研究旨在通过中心切割二维液相色谱法,建立测定人血浆中拉莫三嗪药物浓度的方法,便于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作,为临床个体化用药指导提供监测数据支持。
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第一维色谱系统中,一维色谱柱:SNCB(T)-1A(硅胶,4.6 mm×50 mm, 5 µm),流动相A:VCV-1D移动相[甲醇-乙腈-磷酸铵水溶液(V/V/V=1∶3∶3,氨水调pH至7.0)],流速:0.4 ml/min;流动相B:水,流速:1.0 ml/min。第二维色谱系统中,二维色谱柱:Symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 µm),流动相:乙腈:10 mmol/L乙酸铵溶液(25∶75),流速:1.0 ml/min;中间色谱柱:SBX4-MA(树脂,3.0 mm×10 mm,5 µm)。柱温:45 ℃,紫外检测波长:306 nm,进样量:200 μl。时间程序:0~2 min样品进样和第一维色谱分离;2~4 min目标物通过中间色谱柱转移至第二维色谱;4~10 min目标物在第二维色谱中分离分析。
二维液相色谱将分离原理不同的两支色谱柱经一定接口和柱切换技术耦合在一起,通过加入不同的流动相进行选择性分离。样品在第一维色谱进行初步富集分离,经过纯化后将目标组分利用柱切换技术由中间柱转移系统转移到第二维中,最后目标组分在第二维色谱中分离分析。当目标组分在第二维色谱中分离分析时,纯化柱已经逐渐开始清洗,以备样品的再次进入,由此间隔不断地运行。二维液相色谱系统结构见图1;工作原理示意图见图2。
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精密称取拉莫三嗪标准品7.90 mg,置于100 ml容量瓶中,用甲醇稀释到刻度,摇匀,配制成浓度为79.00 μg/ml的拉莫三嗪标准品储备液,存放在−80 ℃冰箱中备用。
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精密吸取含药血浆样品200 μl至1.5 ml EP管中,再精密加入甲醇600 μl沉淀蛋白,涡旋混合1 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取上清液,进样分析。
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制备空白血浆、空白血浆+拉莫三嗪对照品溶液(浓度为7.90 μg/ml),按照“2.3”项下方法处理,将空白血浆、拉莫三嗪对照品、空白血浆+拉莫三嗪对照品按“2.1”项下色谱条件进样测定,观察有无内源性干扰,如图3所示。结果表明,拉莫三嗪出峰时间为8.506 min左右。血浆中的内源性物质对拉莫三嗪的出峰时间和峰面积无明显干扰(理论踏板数为8 843,对称因子为1.13)。
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用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成系列浓度梯度溶液(39.50、19.75、9.88、4.94、2.47、1.24 μg/ml),按照“2.3”项下方法处理后,按“2.1”项下色谱条件进样测定。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性拟合。得到线性回归方程:Y=146 470X-36 830,r=0.999 9,表明拉莫三嗪血药浓度在1.24~39.50 μg/ml时,线性关系良好,定量下限浓度为1.24 μg/ml(S/N=10),检测限为0.02 μg/ml(S/N=3)。
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用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成浓度为高、中、低(31.60、7.90 、1.98 μg/ml)以及定量下限(1.24 μg/ml)4个浓度的含药血浆样品,每个浓度设置5组平行,按照“2.3”项下方法处理后,按“2.1”项下色谱条件进样测定。1 d内不同时间测定5次及3 d内每天进样1次,考察其日内和日间精密度/准确度。结果如表1~2所示,高、中、低3个浓度的日内RSD均小于5%,日间RSD均小于10%;日内准确度范围为102.17%~111.17%,日间准确度范围为99.80%~107.31%;定量下限浓度的日内、日间RSD均小于5%,日内准确度为100.65%,日间准确度为100.50%。
表 1 日内精密度/准确度测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD/准确度
(%)31.60 32.28 0.65 2.02/102.17 7.90 8.27 0.24 2.93/104.66 1.98 2.20 0.06 2.74/111.17 1.24 1.25 0.01 0.58/100.65 表 2 日间精密度测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD/准确度
(%)31.60 31.57 1.34 4.23/99.92 7.90 7.88 0.67 8.54/99.80 1.98 2.12 0.19 9.15/107.31 1.24 1.25 0.01 0.52/100.50 -
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低(31.60、7.90、1.98 μg/ml)3个浓度的含药血浆样品,每个浓度设置5组平行,按照“2.3”项下方法处理后,按“2.1”项下色谱条件进样测定,计算回收率。结果如表3所示,回收率RSD均小于5%,其变化范围在89.95%~96.15%之间。
表 3 回收率测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD
(%)回收率
(%)31.60 30.03 0.58 1.92 95.04 7.90 7.11 0.30 4.19 89.95 1.98 1.90 0.02 0.90 96.15 -
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低(31.60、7.90、1.98 μg/ml)3个浓度的含药血浆样品,每个浓度设置5组平行,按照“2.3”项下方法处理后,按“2.1”项下色谱条件进样测定,分别考察血浆样品室温放置24 h、反复冻融3次以及−40 ℃保存2周的稳定性。结果如表4所示,测定浓度/标准浓度比值范围在87.01%~115.88%。符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则中,9012生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。
表 4 稳定性测定结果(n=5)
检测条件 药物浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)测定浓度/标示浓度
(%)室温放置24 h 31.60 33.50 106.02 7.90 8.39 106.25 1.98 2.29 115.88 反复冻融3次 31.60 29.29 92.67 7.90 6.87 87.01 1.98 2.04 103.00 −40 ℃保存2周 31.60 31.05 98.25 7.90 7.80 98.70 1.98 2.11 106.73
Determination of Lamotrigine in Human Plasma by Central cutting two-dimensional liquid Chromatography
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摘要:
目的 建立中心切割二维液相色谱法测定人血浆中拉莫三嗪药物浓度。 方法 采用外标法定量,第一维色谱柱:SNCB(T)-1A(硅胶,4.6 mm×50 mm, 5 µm),流动相A:VCV-1D移动相,流速:0.4 ml/min;流动相B:水,流速:1.0 ml/min;第二维色谱柱:Symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 µm),流动相:乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(V/V=25∶75),流速:1.0 ml/min;中间色谱柱:SBX4-MA(树脂,3.0 mm×10 mm, 5 µm);紫外检测波长306 nm,柱温:45 ℃,进样量:200 µl。 结果 拉莫三嗪在1.24~39.50 µg/ml血药浓度范围内线性关系良好(r = 0.999 9),定量下限为1.24 µg/ml,检测限为0.02 µg/ml;日内精密度RSD均小于5%,日间精密度RSD均小于10%;日内准确度范围为102.17%~111.17%,日间准确度范围为99.80%~107.31%;回收率RSD均小于5%,其变化范围在89.95%~96.16%;经室温保存24 h、反复冻融3次和-40 ℃保存2周等稳定性考察,其测定值/标示值比值范围在87.01%~115.88%。 结论 本研究建立的方法操作简单、稳定性好、灵敏度高、重现性好,适用于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作,为临床个体化用药指导提供可靠的监测数据支持。 Abstract: Objective To establish a central cutting two-dimensional liquid chromatography for the determination of lamotrigine in human plasma. Methods External standard method was used. The first dimensional chromatographic column: SNCB(T)-1A(silica gel, 4.6 mm×50 mm, 5 μm), mobile phase A:VCV-1D mobile phase, flow rate: 0.4 ml/min; mobile phase B: water, flow rate: 1.0 ml/min; second dimensional chromatographic column: Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm), mobile phase: acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate solution(V/V=25∶75), flow rate: 1.0 ml/min; Intermediate column: SBX 4-MA(resin, 3.0 mm×10 mm, 5µm). The UV detection wavelength: 306 nm, the column temperature: 45 ℃, and the injection volume: 200 μl. Results The linear range of lamotrigine was 1.24-39.50 μg/ml, the lower limit of quantification was 1.24 μg/ml, the detection limit was 0.02 μg/ml, the intra-day precision RSD was less than 5%, the day-to-day precision RSD was less than 10%, the variation of intra-day accuracy ranged from 102.17% to 111.17%, and the daytime accuracy variation ranged from 99.80% to 107.31% the recovery RSD was less than 5%, and the variation range was 89.95% -96.16%. After 24 hours storage at room temperature, repeated freezing and thawing for 3 times and storage at-40 ℃ for 2 weeks, the ratio of the measured value / labeled value ranged from 87.01% to 115.88%. Conclusion In this study, a method with simple operation, good stability, high sensitivity and good reproducibility was established, which could be suitable for clinical monitoring of blood concentration of lamotrigine and provides reliable monitoring data support for clinical individualized medication guidance. -
表 1 日内精密度/准确度测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD/准确度
(%)31.60 32.28 0.65 2.02/102.17 7.90 8.27 0.24 2.93/104.66 1.98 2.20 0.06 2.74/111.17 1.24 1.25 0.01 0.58/100.65 表 2 日间精密度测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD/准确度
(%)31.60 31.57 1.34 4.23/99.92 7.90 7.88 0.67 8.54/99.80 1.98 2.12 0.19 9.15/107.31 1.24 1.25 0.01 0.52/100.50 表 3 回收率测定结果(n=5)
理论浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)标准差 RSD
(%)回收率
(%)31.60 30.03 0.58 1.92 95.04 7.90 7.11 0.30 4.19 89.95 1.98 1.90 0.02 0.90 96.15 表 4 稳定性测定结果(n=5)
检测条件 药物浓度
(μg/ml)测定浓度平均值
(μg/ml)测定浓度/标示浓度
(%)室温放置24 h 31.60 33.50 106.02 7.90 8.39 106.25 1.98 2.29 115.88 反复冻融3次 31.60 29.29 92.67 7.90 6.87 87.01 1.98 2.04 103.00 −40 ℃保存2周 31.60 31.05 98.25 7.90 7.80 98.70 1.98 2.11 106.73 -
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