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胆汁淤积是以胆汁生成障碍和胆汁排泄受阻为特征的病理性疾病,是一种临床常见的综合征[1]。胆汁淤积由胆管阻塞、肝细胞分泌缺陷等多种原因引起,肝脏和体循环中胆汁酸、胆固醇及胆红素等成分过多堆积,从而造成机体及肝细胞的损伤[2]。由于胆汁淤积的病因和损伤机制复杂,严重制约了其相关新药的开发,因此研究胆汁淤积性肝损伤的病因,寻找有效的治疗药至关重要。目前,经FDA批准用于临床治疗胆汁淤积的药物只有熊去氧胆酸(UDCA)和奥贝胆酸(OCA)[3-4]。我国中草药资源丰富,为中医药的开发和研究提供了物质基础。荣木复肝方是一种用于治疗肝损伤的中药民间验方,主要由醋鳖甲15 g、穿山甲10 g、佛手10 g、芍药10 g、桑葚15 g、三七5 g、黄连6 g、黄芩10 g等13味组成。本课题组在四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型中证实了荣木复肝方具有保肝和治疗肝纤维化等慢性肝损伤的作用[5-7],其作用温和、无毒、无副作用,可以明显降低慢性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平[6-8],并且该作用效果可能与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和CD147的表达增加、基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)的表达降低有关[8-9],在肝病防治领域应用前景广泛。但到目前为止,尚未见荣木复肝方从改善胆汁淤积角度进行肝病防治的研究,更未见其在α--萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的小鼠胆汁淤积型肝损伤模型中的相关报道。为此,本课题组采用ANIT构建小鼠胆汁淤积性肝损伤模型,研究荣木复肝方在防治胆汁淤积肝病方面的研究,探索荣木复肝方在防治肝病领域的理论与实践,进而为研究其在防治慢性肝病的分子机制及其临床应用方面提供理论基础。
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与对照组相比,给予ANIT后,模型组小鼠血清中肝功酶学指标(ALT、AST、AKP)水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,荣木复肝方中、高剂量组和UDCA组小鼠外周血清中ALT、AST、AKP含量明显降低(P<0.01),低剂量组ALT的表达降低(P<0.05),表明荣木复肝方能够改善肝损伤血清生化指标(表1)。
表 1 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中ALT、AST、AKP含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 ALT(U/L) AST(U/L) AKP(金氏单位) 对照组 35.31±3.24 123.58±7.86 3.15±1.14 模型组 69.76±5.33## 186.65±8.25## 12.25±3.46## 复方低剂量组 42.59±2.13* 142.12±10.34** 5.17±2.52** 复方中剂量组 36.22±3.24** 125.73±9.63** 3.25±1.16** 复方高剂量组 40.15±4.33** 136.68±8.45** 4.43±2.45** UDCA组 35.46±3.65** 124.24±7.41** 3.76±1.36** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 -
与对照组相比,给予ANIT后,模型组黄疸特异性指标(TBA、TBIL和γ-GT)的表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组相比,荣木复肝方中、高剂量组和UDCA组能够明显降低小鼠外周血清中TBA、TBIL和γ-GT含量(P<0.01);荣木复肝方低剂量组TBA和TBIL表达降低(P<0.05),γ-GT表达降低(P<0.01),表明荣木复肝方对胆汁淤积型小鼠具有降低黄疸的作用(表2)。
表 2 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中TBA、TBIL、γ-GT含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 TBA(μmol/L) TBIL(μmol/L) γ-GT(U/L) 对照组 2.34±1.64 12.06±4.54 2.27±1.18 模型组 10.87±2.32## 35.17±2.64## 11.37±3.54## 复方低剂量组 4.36±2.25* 18.02±4.62* 3.87±2.02** 复方中剂量组 3.13±1.45** 14.67±2.56** 3.27±2.21** 复方高剂量组 4.36±2.16** 15.37±3.45** 3.23±1.25** UDCA组 4.21±2.58** 13.15±3.26** 3.02±1.45** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 -
与对照组相比,给予ANIT后,模型组肝脏抗氧化因子(SOD、GSH-Px)活性降低明显(P<0.01),而MDA的表达水平上升明显(P<0.01),与模型组相比,荣木复肝方中剂量组、高剂量组和UDCA组SOD和GSH-Px的表达水平显著升高(P<0.01),同时荣木复肝方低、中、高剂量组MDA的表达水平显著降低(P<0.01),荣木复肝方低剂量组SOD和GSH-PX的表达升高(P<0.05),UDCA组MDA的表达降低(P<0.05)。结果提示,荣木复肝方能够通过清除氧化自由基减少炎症反应进而保护肝脏(表3)。
表 3 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中SOD、MDA、GSH-PX含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) GSH-PX[nmol·
(min·g)−1]对照组 305.65±8.21 7.75±3.24 139.58±8.02 模型组 210.46±8.96## 20.65±2.86## 86.05±9.78## 复方低剂量组 257.32±5.42* 13.31±4.21** 118.87±6.52* 复方中剂量组 297.35±5.64** 8.76±3.46** 130.35±4.15** 复方高剂量组 275.34±6.54** 11.75±5.12** 126.48±6.06** UDCA组 300.02±7.38** 8.52±3.35* 132.34±5.47** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 -
对照组小鼠肝脏病理切片显示肝细胞胞浆丰富,肝细胞圆润饱满,小叶结构完整清晰,无纤维组织,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,无炎症细胞浸润(图1A)。与对照组相比,模型组小鼠肝脏病理切片显示肝脏细胞呈现空泡变性,中央静脉周围汇管区炎症细胞浸润,部分肝细胞排列紊乱,出现点状坏死(图1B)。与模型组相比,荣木复肝方低剂量组(图1C)、高剂量组(图1E)肝脏细胞炎症浸润稍微减轻,较模型组好转。荣木复肝方中剂量组(图1D)肝脏细胞空泡变性显著减少,肝脏细胞排列紊乱恢复,炎症细胞浸润现象较模型组改善明显,肝小叶结构完整。UDCA组部分肝细胞水变性,中央静脉周围有少量散在炎症细胞浸润,逐渐恢复整齐排列(图1F)。
The protective effect of Rongmu Fugan Formula on ANIT induced liver injury in mice with cholestasis
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摘要:
目的 探讨荣木复肝方对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的小鼠胆汁淤积肝损伤的保护作用。 方法 取8周龄SPF级昆明小鼠,随机分成6组,每组10只,分别为空白对照组(灌胃生理盐水),模型对照组(灌胃生理盐水),荣木复肝方低(灌胃剂量5.25 g/kg)、中(11.25 g/kg)、高(20.25 g/kg)剂量组,阳性对照(熊去氧胆酸,UDCA,0.1 g/kg)组,每日1次,连续灌胃药7 d。第5天,空白对照组灌胃给予等量橄榄油,其他各组灌胃ANIT(65 mg/kg)造模。造模48 h后,各组小鼠末次药后30 min,收集小鼠血液和肝组织样本,进行各项指标的检测。采用试剂盒检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)含量。采用HE染色观察小鼠肝脏病理学变化。 结果 与模型组相比,荣木复肝方各剂量组能够明显降低小鼠外周血清中ALT、AST、AKP、TBA、TBTL、γ-GT和MDA含量(P<0.05),显著提高SOD和GSH-PX水平(P<0.05)。与模型组相比,荣木复肝方低剂量组、高剂量组肝细胞空泡变性减少,炎症浸润减轻;中剂量组肝脏细胞空泡变性显著减少,炎症浸润现象明显改善,肝细胞呈索状排列,肝小叶结构完整。 结论 荣木复肝方能够改善肝损伤血清生化学指标、降低黄疸和清除氧化自由基,从而发挥对ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用。 Abstract:Objective To explore the protective effect of Rongmu Fugan Formula on ANIT induced cholestasis liver injury in mice. Methods 8-week old SPF Kunming mice were randomly divided into 6 groups, 10 mice in each group which were the blank control group (normal saline gavage), the model control group (normal saline gavage), the low (gavage dose:5.25 g/kg ) group, the medium (11.25 g/kg) group and the high (20.25 g/kg) group of Rongmu Fugan Formula, the positive control (Ursodeoxycholic acid, UDCA,0.1 g/kg). Mice were administered with continuous gavage once a day, for 7 consecutive days. On the 5th day, the blank normal control group was given an equal amount of olive oil by gavage, all other groups were given ANIT (65 mg/kg) by gavage for modeling. After 48 hours of modeling, 30 minutes after the last administration of each group of mice, blood and liver tissue samples were collected for testing of various indicators. The corresponding kits were used to detect the content of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total bile acid (TBA),γ-glutamyl transpeptidase(γ-GT), total bilirubin (TBIL), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX) and malondialdehyde (MDA) in peripheral blood of mice, respectively. HE staining was used to observe the pathological changes in the liver of mice. Results Compared with the model group, each dose group of Rongmu Fugan Formula reduced the levels of ALT, AST, AKP, TBA, TBIL,γ-GT and MDA (P<0.05) significantly, markedly increased the levels of SOD and GSH-PX (P<0.05). Compared with the model group, the low-dose and high-dose groups of Rongmu Fugan Formula showed a decrease in liver cell vacuolar degeneration and reduction in inflammatory infiltration. In the medium dose group, the vacuolar degeneration of liver cells was significantly reduced, the inflammatory infiltration was significantly improved, the liver cells were arranged in cords, and the structure of lobules of liver was intact. Conclusion Rongmu Fugan Formula could improve serum biochemical indicators of liver injury, reduce jaundice and eliminate oxidative free radicals, thereby exerting a protective effect against ANIT-induced cholestatic liver injury in mice. -
表 1 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中ALT、AST、AKP含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 ALT(U/L) AST(U/L) AKP(金氏单位) 对照组 35.31±3.24 123.58±7.86 3.15±1.14 模型组 69.76±5.33## 186.65±8.25## 12.25±3.46## 复方低剂量组 42.59±2.13* 142.12±10.34** 5.17±2.52** 复方中剂量组 36.22±3.24** 125.73±9.63** 3.25±1.16** 复方高剂量组 40.15±4.33** 136.68±8.45** 4.43±2.45** UDCA组 35.46±3.65** 124.24±7.41** 3.76±1.36** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 表 2 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中TBA、TBIL、γ-GT含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 TBA(μmol/L) TBIL(μmol/L) γ-GT(U/L) 对照组 2.34±1.64 12.06±4.54 2.27±1.18 模型组 10.87±2.32## 35.17±2.64## 11.37±3.54## 复方低剂量组 4.36±2.25* 18.02±4.62* 3.87±2.02** 复方中剂量组 3.13±1.45** 14.67±2.56** 3.27±2.21** 复方高剂量组 4.36±2.16** 15.37±3.45** 3.23±1.25** UDCA组 4.21±2.58** 13.15±3.26** 3.02±1.45** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 表 3 荣木复肝方对胆汁淤积性肝损伤小鼠外周血中SOD、MDA、GSH-PX含量影响(
$ \overline x \pm s $ ,n=10)组别 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) GSH-PX[nmol·
(min·g)−1]对照组 305.65±8.21 7.75±3.24 139.58±8.02 模型组 210.46±8.96## 20.65±2.86## 86.05±9.78## 复方低剂量组 257.32±5.42* 13.31±4.21** 118.87±6.52* 复方中剂量组 297.35±5.64** 8.76±3.46** 130.35±4.15** 复方高剂量组 275.34±6.54** 11.75±5.12** 126.48±6.06** UDCA组 300.02±7.38** 8.52±3.35* 132.34±5.47** *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;##P<0.01,与对照组比较。 -
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