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西罗莫司（sirolimus，SRL），又称雷帕霉素，是第三代免疫抑制剂，在临床上常用于抑制肝、肾等器官移植后的免疫排斥反应。SRL属于生物药剂学分类Ⅱ类药物，在水中的溶解度极低，而渗透性良好[1-4]。SRL药理活性高，但因水溶性差，且易被肠壁和肝中的CYP3A4同工酶广泛代谢，致使其口服生物利用度较低。这是临床应用SRL的重要缺陷之一。目前，已上市的SRL制剂主要是纳米结晶片，生物利用度约为17%[5-7]。
通过适当的制剂技术提高SRL在胃肠道中的溶解度，可提高其口服生物利用度。在前期研究中，课题组分别独立进行了含SRL的自微乳（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）、固体分散体（solid dispersion，SD）和纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）的构建，均显著改善了SRL的体外溶出。本实验在前期研究的基础上，新增环糊精衍生物对SRL的增溶研究，结合体外溶出度和体内生物利用度，综合分析和评价各增溶制剂的优势和缺陷，从而为解决口服难溶性药物的研究提供参考。
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Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Starter 2C型pH计(上海奥豪斯仪器公司)；RCZ-6BZ型药物溶出仪(上海黄海药检仪器公司)；真空冷冻干燥箱(北京博医康试验仪器公司)；NS1001L2K高压匀质机(意大利NiroSoavi公司)；UV-2800AH型紫外可见分光光度仪(上海优尼科仪器有限公司)；液相色谱-质谱联用仪(美国AB-SCIEX有限公司)。
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SRL对照品(含量99.9%)、SRL原料药(含量99.6%)，购自福建科瑞药业有限公司；子囊霉素对照品(上海齐奥化工科技有限公司)，Rapamune®(美国惠氏制药)。聚乙二醇6000(PEG 6000）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）均购自国药集团化学试剂有限公司；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer 188)、聚氧乙烯35蓖麻油(Cremophor EL）、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor RH40）均购自德国BASF公司；油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M1944CS)、二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(Precirol ATO5)、月桂酸聚乙二醇甘油酯 (Gelucire 44/14)均购自法国GATTEFOSSE公司；HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD(山东滨州智源生物科技有限公司)。
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采用高效液相色谱仪（HPLC）测定样品中的SRL含量[8]。色谱柱为Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-水（45∶34∶21），流速为1 ml/min，检测波长为278 nm，柱温为50 ℃，进样量为20 μl。配制浓度为2、4、8、12、16、20 μg/ml的SRL对照品溶液，得标准曲线为Y=54.712X+1.221，r=0.999 9，表明在2~20 μg/ml浓度范围内线性关系良好。另外，精密度、回收率符合要求。
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参考前期研究[9]，称取1 g SRL原料药，加入19 g的助乳化剂Transcutol HP，超声至全部溶解后，加入22 g油相Labrafil M1944CS及39 g乳化剂Cremophor EL，涡旋混匀，得到淡黄色澄清溶液，即SRL-SMEDDS。
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参考前期研究[10-11]，取Gelucire44/14和Crodamol GTCC在75 ℃水浴中完全熔融后，加入SRL原料药搅拌均匀成澄明油相，再将同温度吐温−80的水溶液迅速倒入油相，以300 r/min搅拌30 min制备初乳，再经高压匀质机90 MPa乳匀5次，即得SRL-NLC分散液，其中SRL为0.21%，Gelucire44/14:Crodamol GTCC（1∶2.1），脂质总量为10%，吐温−80为7.33%。随后，将SRL-NLC（42.6%）加入微晶纤维素和聚乙烯吡咯烷酮（50%，4∶1）中，研磨混合并放置过夜以充分吸附，加入甘露醇（冻干保护剂，3%），经冷冻干燥过夜后，所得固体粉末中加入低取代羟丙基纤维素（崩解剂，4%）和二氧化硅（助流剂，0.4%）即得固化纳米脂质体。
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采用溶剂-熔融法制备SRL-SD。称取载体材料，于80 ℃水浴加热熔融，滴入SRL乙醇溶液，充分混匀，待乙醇挥发完全后，迅速将其倾倒于冰浴条件下的不锈钢板上成薄膜，固化，再于−18 ℃放置4 h后，将固体分散体从不锈钢板上刮下，置真空干燥器中干燥，待脆化后研细，过80目筛，即得SRL-SD。以载体种类、药物-载体比例为考察因素，以0.4% SDS中的溶出度为指标，对SRL-SD进行单因素分析。
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称取适量β-环糊精衍生物溶于去离子水中，缓慢滴加SRL乙醇溶液，在一定温度下磁力搅拌至澄清透明，减压挥发4 h，使乙醇挥发完全，再置于4 ℃冰箱冷藏12 h，降低SRL的溶解度，从而使游离的SRL发生结晶。经0.22 μm微孔滤膜过滤除去结晶，滤液冷冻干燥24 h，所得固体研磨细化，过80目筛，即得SRL-IC。
称取一定量的SRL-IC置10 ml容量瓶中，加入50%甲醇水溶液，超声至全部溶解后，定容至刻度，并采用HPLC测定SRL含量，根据公式：包封率（%）=[（SRL投入量-SRL测定量）/ SRL投入量]×100%，进行计算。以环糊精衍生物的种类、浓度、温度、乙醇体积和投药量为考察因素，以包封率为指标，对SRL-IC进行单因素分析。
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参考《中国药典》2015年版四部通则0931项下溶出度与释放度测定法，考察SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的溶出曲线。除市售片外，其余样品均装入硬胶囊中，每个胶囊含1 mg SRL。采用桨法，搅拌速度为100 r/min，溶出介质体积为250 ml，分别以0.4% SDS、水、pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、pH 7.4磷酸盐缓冲液为溶出介质。将两颗胶囊或药片置于沉降篮中，投入溶出介质，在10、30、45、60、90、120 min，吸取2 ml介质，并补充等温等体积的介质，采用HPLC测定样品中的药物含量，绘制溶出曲线。
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选用比格犬为实验动物，采用6周期6交叉实验设计，进行SRL原料药、市售片（Rapamune®）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC及SRL-SD的药代动力学试验。给药剂量为1 mg SRL，实验动物试验开始前12 h禁食不禁水，给药4 h后自由饮水，2次给药间隔2周以上的清洗期。于给药前，0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48及72 h分别经前肢小静脉采血2 ml，置于含肝素和EDTA的抗凝管中，−20 ℃保存备用。血样处理与测定方法参照课题组前期研究[12]。
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如图1A所示，不同载体材料制备的SRL-SD的溶出曲线显示了明显的差异，溶出速率为PEG6000>F68>PVP K30>HPMC606>HPMC-AS-MF。同时，各载体材料的溶出度均不理想（≤50%），因此进一步考察采用二元载体制备SRL-SD。
图 1 单因素考察固体分散体的制备对体外溶出曲线的影响
选择PEG6000联合F68制备二元载体固体分散体[13]，两者比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。随PEG6000/F68比例的增大，则SRL溶出度呈增大趋势，在PEG6000/F68为2∶1时的溶出度达到最大（图1B）。
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在PEG6000/F68=2∶1的基础上，进一步考察药物-载体比例对SRL-SD溶出的影响。药物-PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1、1∶4∶2及1∶6∶3所制的SRL-SD的溶出曲线相似，没有明显差别，2 h的溶出度都接近100%（图1C）。因此优选载药量最大，即药物- PEG6000/F68载体比例为1∶2∶1。
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在其他条件相同的情况下，HP-β-CD、SBE-β-CD和DM-β-CD对SRL的包封率分别为（11.21±3.35）%、（8.24±3.11）%和（31.86±3.26）%，见图2A。因此，优选DM-β-CD制备SRL-IC。
图 2 单因素考察包合物的制备工艺对包合率的影响
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采用DM-β-CD制备SRL-IC，考察不同温度对包封率的影响。结果显示（图2B），温度越低，包封率越高，10 ℃条件下制备的SRL-IC的包封率显著高于30 ℃和50 ℃（P<0.01），为（58.61±4.16）%。因此，优选10 ℃制备SRL-IC。
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DM-β-CD的浓度由200 mg/ml增大至300 mg/ml，SRL的包封率由（52.12±4.17）%增大至（58.61±4.11）%（P<0.05，图2C）。进一步增大DM-β-CD的浓度至600 mg/ml，包封率没有明显变化（P>0.05）。因此，优选DM-β-CD的浓度为300 mg/ml制备SRL-IC。
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乙醇体积由0.5 ml增大至2 ml，包封率呈增大趋势（图2D）。因此，优选乙醇体积为0.5 ml制备SRL-IC。
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SRL的投药量6 mg增大至8 mg，包封率显著降低，6 mg SRL的包封率为（95.21±1.10）%，见图2E。因此，优选SRL的投药量为6 mg。
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考察SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS及SRL-NLC在不同介质中的溶出曲线。如图3所示，在0.4% SDS中，各制剂在2 h的溶出度均超过80%，尤其是SMEDDS和NLC的溶出度接近100%。
图 3 不同增溶制剂的西罗莫司在溶出介质中的溶出曲线图(n=3)
在pH 6.8和水中，SRL-SD的溶出速率减小，2 h的溶出度分别为（65.00±4.90）%和（76.70±1.95）%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，SRL-SD的溶出在1 h达到最大值，分别为（53.20±4.34）%和（55.20±4.34）%，随后溶出度逐渐降低。在pH 1.2的介质中，未检测到SRL。
在水、pH 4.5、pH 6.8和pH 7.4中，SRL-IC在40 min内的溶出速率有所减小，但2 h的累积溶出没有明显变化，均在80%以上。在pH 1.2的介质中，SRL-IC的溶出度在30 min达到最大值，为（49.84±7.21）%，随后溶出度逐渐降低。
SRL-SMEDDS和SRL-NLC显示了与SRL-SD相似的溶出趋势，即在水和pH 6.8中的溶出度低于0.4% SDS，但大于80%。在pH 4.5和pH 7.4的介质中，溶出达到峰值（约80%）后逐渐降低。
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SRL血药浓度-时间曲线见图4，经DAS 3.2.6软件处理后，具体参数见表 1。
表 1 非房室模型体内药动学参数（
$ \bar x$ ±s）参数 SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune® AUC0→72(µg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(µg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13 
图 4 参比制剂与受试试剂平均血药浓度-时间曲线 (n=6)
以原料药为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、Rapamune®的相对生物利用度分别为332.8%、522.9%、1 228.6%、1 537.1%、1 574.3%，表明各增溶方法都显著提高了SRL的生物利用度。
以市售纳米晶片Rapamune®为参比制剂，SRL-SD、SRL-IC、SRL-NLC、SRL-SMEDDS的相对生物利用度分别为18.7%、33.2%、78.0%、97.6%，可见在各增溶方法中，SMEDDS对SRL体内吸收的作用最显著，与市售制剂相当。
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本研究同时制备和比较了SRL的4种增溶制剂，均显示了良好的体外溶出度。同时，各制剂都提高了SRL的生物利用度，但体内吸收程度有较明显的差异。
首先，SRL本身的性质是影响体内吸收的重要因素。在理化性质方面，SRL在电解质溶液中可发生开环水解，特别是在强酸和碱性条件下，降解速率显著增加[14]。在生理因素方面，SRL是肠道内CYP3A4酶和P糖蛋白的底物，对肠道吸收有较大影响[15]。
其次，制剂本身的特点对体内吸收有重要影响。SMEDDS和NLC均可形成纳米级的脂质微粒，在胃肠道消化后可形成乳糜胶束[16-17]均减轻了胃肠液的pH对SRL的降解作用，因此SMEDDS和NLC对脂质微粒中的SRL有一定的保护作用。相比之下，SD中的SRL快速释放后，载体材料失去了对药物的隔离保护作用，导致SRL在极短的时间内发生降解。另外，环糊精的空腔可以容纳药物分子[18]，不仅提高了SRL的溶解度，而且降低了H+和OH-对SRL的作用概率，减缓了SRL的降解。本研究的体外溶出试验也证实了不同增溶制剂中SRL稳定性的差异。
同时，SMEDDS的辅料Labrafil M1944 CS和Cremophor EL[9, 19-21]和NLC中的脂质及其代谢产物能够抑制CYP3A4酶的代谢和P糖蛋白外排，消化后形成的乳糜胶束还可通过淋巴途径吸收[22]，从而提高了生物利用度[10-11]。
另外，由于SRL分子量较大，分子结构可能仅有部分插入环糊精的空腔中。因此，尽管环糊精提高了SRL的溶出度，但包合物的稳定性较差，进入胃肠道后，药物可被胃肠液中的成分替换[23]，导致SRL加速降解或发生重结晶，进而生物利用度下降。
Study on sirolimus solubilization technology based on in vitro dissolution and in vivo bioavailability
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摘要:
目的 评价不同增溶技术对西罗莫司（sirolimus，SRL）的体外溶出与体内吸收的影响。 方法 选取固体分散体（SD）、包合物（IC）、自微乳（SMEDDS）和纳米结构脂质载体（NLC）为SRL的增溶技术。SRL-SMEDDS和SRL-NLC已在前期研究中获得最优处方。另外，以包封率、体外溶出度等为指标，筛选SRL-SD和SRL-IC的处方工艺。分别采用0.4% SDS，水，及pH 1.2、pH 4.5、pH 6.8、pH 7.4缓冲液为溶出介质，考察市售制剂Rapamune®，以及自制的各增溶制剂的溶出曲线。采用比格犬体内药动学试验，考察上述制剂的体内吸收度。 结果 在0.4% 十二烷基硫酸钠（SDS）中，各制剂在2 h的溶出度均超过80%。在pH 1.2的介质中，无法测得SRL-SD的溶出度，而IC、SMEDDS和NLC的溶出度呈先增大后减小的趋势。在其他介质中，SRL的溶出度均有所降低，而SRL-IC显示了最佳的溶出度，未出现明显的降低趋势。体内药动学试验结果显示，原料药、SRL-SD、SRL-IC、SRL-NLC和SRL-SMEDDS的相对生物利用度分别为9.1%、18.7%、33.2%、78.0%、97.6%。 结论 SD、SMEDDS、NLC、IC均可提高SRL的体外溶出度和体内吸收度，其中，SMEDDS对SRL的生物利用度改善最为明显。 Abstract:Objective To evaluate the effects of different solubilizing techniques on the in vitro dissolution and in vivo pharmacokinetics of Sirolimus (SRL). Methods Solid dispersions (SD), inclusion complex (IC), self-micro emulsifying drug delivery system (SMEDDS) and nano-structured lipid carrier (NLC) were selected as the solubilization technology for SRL. SRL-SMEDDS and SRL-NLC have obtained the optimal prescription in the previous studies. Additionally, the formulation process of SRL-SD and SRL-IC was screened by using inclusion rate and dissolution profiles as indicators. 0.4% SDS, water and buffer solutions with pH 1.2, 4.5, 6.8, 7.4 were used as dissolution media. The dissolution profile of the commercially available formulation Rapamune® and the lab-made solubilized preparations were investigated. The in vivo absorption of the above preparations was examined using a pharmacokinetic test in Beagle dogs. Results In 0.4% SDS, the dissolution of each preparation exceeded 80% in 2 h. In the medium of pH 1.2, the dissolution of SRL-SD could not be measured while the dissolution of IC, SMEDDS and NLC increased first and then decreased. In other media, the dissolution of the SRL was reduced. The SRL-IC showed the best dissolution without a significant decrease. The relative bioavailability of APIs, SRL-SD, SRL-IC, SRL-NLC and SRL-SMEDDS were 9.1%, 18.7%, 33.2%, 78.0%, and 97.6% respectively in vivo pharmacokinetic tests. Conclusion SD, SMEDDS, NLC, and IC can improve the in vitro dissolution and in vivo absorption of SRL. Among them, SMEDDS has the most significant improvement in the bioavailability of SRL. -
Key words:
- sirolimus /
- solid dispersion /
- inclusion complex /
- SMEDDS /
- nano-structured lipid carrier /
- dissolution /
- bioavailability
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赶黄草（Penthori Chinensis Herba）在民间又名水泽兰、水杨柳等，以其为原料制成的单味成方制剂肝苏颗粒现收载于《中华人民共和国卫生部部颁标准中药成方制剂十三册》附录[1]。赶黄草是苗族的传统药物，主产于四川古蔺，具有清热、利湿、解毒、活血、平肝、健脾等功效[2]，可用于酒精性、非酒精性脂肪肝，淤积性、酒精性及其他诱导因素引起的肝损伤的保护和治疗[3-13]。赶黄草中化学成分类型众多，以黄酮类、萜类、酚酸类为其主要活性成分[14]。其中，具有以黄酮苷连接没食子酰基结构的大环多酚类化合物（图1）乔松素-7-O-[4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PHG）、乔松素-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[3''-O-galloyl-4",6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PGHG）、乔松素二氢查耳酮-7-O-[3''-O-没食子酰基-4'', 6''-(S)-六羟基二苯甲酰基]-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3''-O-galloyl-4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose or thonningianin A，THA）的肝保护及抗肝纤维化活性较强[15-17]，同时也具有较好的降糖活性[18]，有较高的开发价值，故本实验建立HPLC法同时测定该3种化合物的含量，并通过正交试验优选其提取工艺，为该类成分的进一步开发研究提供前期基础。
1. 仪器与试剂
1.1 药材来源
从四川收集3批赶黄草药材（表1），药材经课题组孙连娜副教授鉴定为虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinense Pursh）的干燥地上部分。各批次药材均留样于上海中医药大学中药资源与生物技术研究中心。
表 1 赶黄草药材来源信息表样品编号 采集地区 批号 提供单位 S1 四川古蔺 18110803 四川古蔺肝苏药业有限公司 S2 四川古蔺 18110804 四川古蔺肝苏药业有限公司 S3 四川古蔺 19050701 四川新荷花中药饮片有限公司 1.2 仪器与试剂
XS105DU 电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XS104 电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HDM-10000B 数显电热套（上海利闻科学仪器有限公司）；N-1300旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；1200型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）；Centrifuge 5810R高速台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。
PHG对照品（批号：20181117）、PGHG对照品（批号：20181103）、THA对照品（批号：20181103）均由本实验室制备，且经HPLC归一化法检测表明纯度均在98%以上；水为超纯水；甲酸（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；乙醇、甲醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司 ）。
2. 方法与结果
2.1 大环多酚类成分的含量测定
2.1.1 对照品储备液的制备
精密称定PHG、PGHG、THA对照品，加80%甲醇分别制成对照品储备液，质量浓度分别为0.610 4、0.604 4、0.485 2 mg/ml。
2.1.2 供试品溶液的制备
取赶黄草药材粉末（过3号筛）1 g，精密称定后转移至250 ml锥形瓶中，精密移取并加入80%甲醇水溶液100 ml，称重确定初始重量，回流提取1 h，放至常温，加溶剂补至初始重量，摇匀，取样，过膜，取续滤液作供试品溶液。
2.1.3 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；洗脱条件：梯度洗脱（0～20 min，32%→50% A，20～25 min，50%→90% A，25～30 min：90%→32% A）；其他参数：流速为1 ml/min，柱温为30℃，检测波长为280 nm，进样量为10 μl。在此色谱条件下，供试品溶液（图2）中PHG、PGHG、THA与其他成分均达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数以PHG计不低于20 000。
2.1.4 线性关系考察
取“2.1.1”项方法制备的混合对照品溶液，依次稀释2、4、10、50、100倍，分别按“2.1.3”项色谱条件进样测定，以3种成分的进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，分别进行HPLC检测，线性拟合得回归方程。PHG、PGHG、THA的回归方程分别为：Y=18 575.798X+5.091 9（r=0.999 9），Y=21 923.382X+29.293 3（r=0.999 9），Y=21 544.589X−13.093 6（r=0.999 9），线性范围依次是6.10～610.40、6.04～604.40、4.85～485.20 μg/ml，以上表明3种化合物线性关系良好。
2.1.5 精密度考察
取对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进行HPLC检测，连续进样分析6次，记录峰面积。结果显示PHG峰面积的RSD为1.15%，PGHG峰面积的RSD为0.18%，THA峰面积的RSD为0.12%，表明所用仪器精密度良好。
2.1.6 重复性考察
取赶黄草药材（S3，过3号筛）6份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，再分别按“2.1.3”项色谱条件进行HPLC检测，记录峰面积，计算含量。结果显示样品中PHG的平均含量为5.83 mg/g，RSD为1.03%；PGHG平均含量为9.99 mg/g，RSD为0.91%；THA平均含量为1.31 mg/g，RSD为0.50%，表明本方法重复性良好。
2.1.7 稳定性考察
取赶黄草药材（S3，过3号筛）1份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，分别放置0、4、8、12、24 h后取样，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示样品中PHG、PGHG、THA峰面积的RSD分别为1.72%、2.44%和4.06%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.8 加样回收率考察
取同一批赶黄草药材（S3，过3号筛）6份，每份约0.5 g，精密称定，按照药材含有量1∶1的比例，分别精密加入PHG、PGHG、THA对照品，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项条件进行HPLC分析，记录峰面积，计算回收率。结果显示PHG、PGHG、THA加样回收率分别为102.04%、100.90%、101.55%，对应的RSD值分别为0.88%、0.82%、1.43%，表明该方法可靠。
2.1.9 赶黄草药材的含量测定
取各批次赶黄草药材（S1～S3，过3号筛）各3份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液后按“2.1.3”项条件进行HPLC分析，记录峰面积并计算含量（表2）。
表 2 赶黄草中3种化合物的含量（n=3）样品编号 PHG/
（mg/g）PGHG/
（mg/g）THA/
（mg/g）总含量/
（mg/g）S1 3.66 5.12 1.99 10.77 S2 7.06 8.26 1.77 17.09 S3 5.69 9.73 1.25 16.67 2.2 提取工艺的优化
2.2.1 提取方法考察
取赶黄草药材（S2）切成3～5 cm小段，称取50 g，加入60%乙醇溶液500 ml，分别采用浸渍法（浸渍24 h）、渗漉法（浸泡24 h后以5 ml/min的流速收集渗漉液）、回流法（加热回流1 h）提取。结果表明，浸渍法平均总提取率为36.67%，渗漉法平均总提取率为36.82%，回流法平均总提取率为71.99%。考察结果为回流法提取效果最佳，因此选择回流法作为提取方法。
2.2.2 正交试验[19-21]
在确定提取方法为回流法的基础上，取赶黄草药材（S2），选择常规回流提取中对提取效果影响较大的因素：溶媒浓度（A）、提取时间（B）、溶媒用量（C）、提取次数（D）作为影响因素，每个因素各取3个水平，在平行操作条件下，设计L9（34）正交试验（表3）。
表 3 正交试验因素水平表水平 A因素 B因素 C因素 D因素 溶媒浓度（%） 提取时间（t/h） 溶媒用量（倍） 提取次数（次） 1 40 1 10 1 2 60 2 20 2 3 80 3 30 3 以PHG、PGHG、THA的总提取率作为考察指标得正交试验结果（表4），根据极差大小可以看出各因素对赶黄草中大环多酚类成分的影响大小为A>B>D>C；进一步方差分析（表5）结果表明，溶媒浓度（A）对提取效果有显著影响（P<0.05），而其他3个因素无显著影响（P>0.05）。因此，根据正交试验得出的最佳组合为A3B1C3D2。
表 4 正交试验结果表试验号 A因素 B因素 C因素 D因素 总提取率（%） 溶媒浓度（%） 提取时间（t/h） 溶媒用量（倍） 提取次数（次） 1 1 1 1 1 32.27 2 1 2 2 2 46.67 3 1 3 3 3 50.47 4 2 1 2 3 50.40 5 2 2 3 1 70.53 6 2 3 1 2 80.07 7 3 1 3 2 92.86 8 3 2 1 3 89.79 9 3 3 2 1 87.56 K1 129.41 175.54 202.15 190.37 K2 201.01 206.99 184.63 219.61 K3 270.21 218.11 213.86 190.66 极差R 46.93 14.19 9.74 9.75 表 5 方差分析表因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 P A 3303.955 2 22.901 F0.05 (2,2)=19
F0.10 (2,2)=9<0.05 B 324.996 2 2.253 >0.10 C 144.274 2 1.000 >0.10 D 188.129 2 1.304 >0.10 误差 144.274 2 − − − 3. 讨论与结论
本实验比较并优化了供试品溶液制备方法，并考察了不同型号色谱柱、不同检测波长、不同流动相组成，在此基础上建立了赶黄草中PHG、PGHG、THA的HPLC检测方法，该法能使样品中测定成分与其他成分达到有效分离，峰型好，可简便快速分析样品，检测结果准确可靠。
在建立含量测定方法的基础上进行提取工艺优化。从毒性大小、常用性角度选择乙醇为溶媒，单因素实验结果显示回流法提取效果最佳，因此选择乙醇热回流法作为提取方法，对常规热回流法影响较大的4个因素进行3个水平设置，建立L9（34）正交试验组，以便考察不同参数设定值对赶黄草中大环多酚成分提取率的影响。通过极差及方差分析发现溶媒浓度（A）即乙醇浓度对提取率有显著性影响，而其他3个因素（B、C、D）均无显著性影响。经正交试验优选后的最佳提取工艺为A3B1C3D2，结合生产实际，从节约原料降低成本的角度，对无明显影响的3个因素进行适当调整，调整后的提取工艺为A3B2C1D2，即取赶黄草干药材，切3～5cm小段，加入10倍体积、浓度为80%的乙醇溶液，回流2次，每次2 h。按照该工艺，取3批药材各5 kg，进行3次放大验证试验，提取率均在90%以上，且RSD值为3.73%，说明该工艺稳定可行，可为赶黄草中该类成分的进一步开发研究打下基础。
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图 2 单因素考察包合物的制备工艺对包合率的影响
A.β-环糊精衍生物种类的影响，**P<0.01，与DM-β-CD比较；B. 温度的影响，**P<0.01，与10 ℃比较；C. 环糊精衍生物浓度的影响，*P<0.05，与200 mg/ml比较；D. 乙醇体积的影响；E. SRL投药量的影响
表 1 非房室模型体内药动学参数（
$ \bar x$ ±s）参数 SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune® AUC0→72(µg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(µg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13 
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