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胃康颗粒由黄芪、三七等九味中药经微粉化制粒而成,具有通降气机、和胃健运的功效[1],在临床上主要用于治疗慢性胃炎、溃疡性结肠炎、术后残胃炎、胃癌合并上消化道出血等疾病[2-3]。方中黄芪可以补气健脾、固表、利尿脱毒[4],三七可以散瘀止血,消肿定痛[5]。黄芪中所含的黄芪甲苷以及三七中所含的人参皂苷Rb1是胃康颗粒的主要活性成分,也是其含量测定的重要检测指标。《中国药典》2015版中采用HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量,用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)法测定三七中人参皂苷Rb1的含量,无法按药典方法同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷。有关文献[6-9]采用HPLC-ELSD法同时测定制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量,该方法简便、准确、分离好,灵敏度高,重复性好,无干扰,对建立三七药材及其制剂的质量控制方法有参考价值。陈骁勇[10]、王银[11]等采用HPLC-ELSD分别测定参芪五味子片、益肺清化颗粒中的有效成分的含量,该方法可以同时测定皂苷类成分和黄芪甲苷的含量,简便快捷、结果准确、重复性好。因此,本研究参考相关文献,优化胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取方法,并建立同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的方法,作为控制胃康颗粒质量的方法之一。
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色谱柱:XBridge ®Shield RP18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(32:68,V/V);流速:1.0 ml/min;柱温:30 ℃;进样量:20 μl;蒸发光检测器,漂移管温度为60 ℃,雾化室温度为33 ℃,载气流量为1.7 SLM。
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综合相关文献及2015版《中国药典》关于测定芪参胶囊中三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的方法,初步拟定胃康颗粒的提取方法:取装量差异项下的本品内容物,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇,密塞,称定重量,超声处理,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液,回收溶剂至干,残渣加水使溶解,加水饱和的正丁醇振摇提取,合并正丁醇提取液,用浓氨试液洗涤,弃去洗涤液,正丁醇提取液回收溶剂至干,残渣加甲醇使溶解并转移至量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。本研究筛选并优化该提取工艺中的提取方式、提取溶剂、提取料液比、提取时间、正丁醇提取次数和氨水洗涤次数。
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实验时曾采用相关文献[9]中供试品处理的方法,发现供试品溶液的HPLC图谱在黄芪甲苷处峰形较小,故本研究在保证人参皂苷Rb1含量的前提下,采用相关文献中甲醇超声提取和回流提取两种方式,结果如表1所示,可知回流提取人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量较高,故综合考虑认为选择回流提取较为适宜。
表 1 不同提取方式对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取方式 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 超声 1.4443±0.0182 0.1849±0.0049 回流 2.4407±0.0032 0.2463±0.0696 -
皂苷类成分常采用水、甲醇、乙醇作为提取溶剂,因此分别用上述3种提取溶剂,对供试品进行提取并测定含量,结果如表2所示,水的提取效果较差,而以甲醇提取时,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量最高,故选择甲醇为提取溶剂。
表 2 不同提取溶剂对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取溶剂 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 水 0.4566±0.0029 ND 甲醇 2.3946±0.0164 0.2336±0.0397 乙醇 1.3876±0.0158 0.1049±0.0263 -
参照相关文献分别选取1∶3、1∶6、1∶10、1∶20、1∶50的5种料液比进行提取,并测定提取液中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量,考察结果如表3所示,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量在料液比1∶6时达到峰值,且从节省溶剂的角度考虑,选择料液比1∶6提取较为适宜。
表 3 不同提取料液比对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取料液比(V∶V) 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 1∶3 2.4385±0.0179 0.1971±0.0065 1∶6 3.1305±0.0354 0.3647±0.0083 1∶10 2.6230±0.0261 0.2259±0.0146 1∶20 1.8379±0.0010 ND 1∶50 0.6474±0.0273 ND -
分别采用0.5、1、1.5、2 h的4种提取时间,对供试品进行提取并测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量,结果如表4所示,随着提取时间的延长,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量也随之逐渐上升,不过1.5 h后,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量不增反降,考虑可能是因为浸提液受热时间长,破坏了药材成分,从而导致人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量不增反降,故提取时间选择1.5 h较为适宜。
表 4 不同提取时间对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取时间(h) 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 0.5 1.9815±0.0591 0.1764±0.0107 1 2.2053±0.0154 0.1951±0.0026 1.5 2.2086±0.0377 0.2184±0.0032 2 0.0806±0.0015 ND -
分别采用正丁醇提取3、4、5、6次,并对提取液测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量,结果如表5所示,正丁醇提取5次时,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量较高,但是继续增加正丁醇提取次数,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量的增幅不大。综合考虑后续试验及成本等因素,选择正丁醇提取5次较为适宜。
表 5 正丁醇提取次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
正丁醇提取次数 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 3次 1.6452±0.0234 0.1459±0.0214 4次 1.9642±0.0063 0.1874±0.0209 5次 2.5756±0.0213 0.2379±0.0030 6次 2.4577±0.0178 0.2384±0.0081 -
分别采用氨水洗涤1、2、3次,对供试品进行提取并测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量,结果如表6所示,氨水洗涤2次时,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量最高,故选择氨水洗涤2次较为适宜。
表 6 氨水洗涤次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
氨水洗涤次数 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 1次 2.3970±0.0851 0.2776±0.0201 2次 2.4393±0.0236 0.2875±0.0050 3次 2.1734±0.0009 0.2766±0.0024 -
精密称定黄芪甲苷5 mg和人参皂苷Rb1 4 mg,置10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。
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取本品5 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇30 ml,称定重量,回流提取1.5 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液20 ml,蒸干,残渣加水20 ml使溶解,加水饱和的正丁醇提取5次,每次20 ml,合并正丁醇提取液,用浓氨试液洗涤2次,每次30 ml,弃去洗涤液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
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分别按处方比例取除黄芪和三七的其余中药饮片,照胃康颗粒的制法制成黄芪阴性样品和三七阴性样品,取黄芪阴性样品4.09 g和三七阴性样品4.55 g,照供试品溶液的制备方法分别制成缺黄芪和缺三七的阴性对照溶液。
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取对照品、供试品和阴性对照品溶液各20 μl,注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,人参皂苷Rb1的保留时间约为8 min,黄芪甲苷的保留时间约为12 min,峰形对称尖锐,基线平稳,与其他色谱峰分离良好,阴性样品无干扰,详见图1。
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精密吸取混合对照品溶液1、3、9、12、15、18、21、24 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积积分值。分别以人参皂苷Rb1和黄芪甲苷对照品进样量的对数值为横坐标(X1和X2),峰面积积分值的对数值为纵坐标(Y1和Y2),绘制标准曲线,计算回归方程。得人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的回归方程分别为:
Y1 = 1.4444X1 + 4.3621,r=0.9995
Y2 = 1.5656X2 + 3.9467,r=0.9999
结果表明,人参皂苷Rb1在1.70~40.80 μg/ml的浓度范围内、黄芪甲苷在5.03~120.72 μg/ml的浓度范围内,与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。
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取同一供试品溶液,精密吸取20 μl,按上述色谱条件,重复进样6次,记录色谱峰面积,计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷色谱峰面积积分对数值的RSD值分别为0.21%、0.39%,表明该方法日内精密度良好。
取同一供试品溶液,精密吸取20 μl,按上述色谱条件,重复进样2次,连续3 d,记录色谱峰面积,计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷色谱峰的峰面积积分对数值的RSD值分别为0.22%和0.36%,表明该方法日间精密度良好。
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取本品同一供试品(批号20200112)约5.0 g,共6份,精密称定,照供试品溶液的制备方法制成供试液。按“2.1”项下色谱条件,测定峰面积并计算含量,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的平均含量分别为2.8609和0.2530 mg/g,RSD分别为1.97%和2.89%,表明此法重复性良好。
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取已知含量的同一批胃康颗粒约5.0 g,共6份,精密称定,分别精密加入一定量的人参皂苷Rb1对照品和黄芪甲苷对照品,按供试品溶液制备方法制备,按“2.1”项下色谱条件测定含量,计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的加样回收率分别为95.65%和 100.57%,RSD分别为1.06%和0.62%。
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取3批样品,按建立的方法测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量。分别精密吸取对照品溶液10、20 μl,供试品溶液20 μl,注入液相色谱仪测定,以外标两点法对数方程计算,即得。结果如表7所示,胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的平均含量分别为2.8630和0.2576 mg/g,RSD分别为0.62%和1.51%。
表 7 3批胃康颗粒的含量测定结果
批号 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 20200112 2.8534 0.2594 20200115 2.8521 0.2531 20200118 2.8836 0.2602 平均值 2.8630±0.0178 0.2576±0.0039 RSD(%) 0.62 1.51
Detectione of the contents of ginsenoside Rb1 and astragaloside IV in Weikang granules by HPLC-ELSD
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摘要:
目的 优化胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取方法,并建立其含量测定方法。 方法 以人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量作为指标,采用单因素考察法对提取工艺进行优化;采用高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD),XBridge®Shield RP18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;乙腈-水(32:68)为流动相;柱温为30 ℃;漂移管温度为60 ℃,载气流量为1.7 SLM,建立测定胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的方法。 结果 当采用甲醇回流提取1.5 h,正丁醇提取5次,氨水洗涤2次时,人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取含量较高;建立的HPLC-ELSD法测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量,线性关系良好(r > 0.9997),日内日间精密度均小于1%,加样回收率分别为95.65%和100.57%,稳定性和重复性的RSD均小于3%,含量分别为2.8630 mg/g和0.2576 mg/g,RSD分别为0.62%和1.51%。 结论 优化了胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取方法,建立了可靠、准确、重现性好的测定胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的HPLC-ELSD方法。 -
关键词:
- 胃康颗粒 /
- 黄芪甲苷 /
- 人参皂苷Rb1 /
- 含量测定 /
- 高效液相色谱-蒸发光散射法
Abstract:Objective To optimize the extraction method and develop the detection method of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules. Methods The extraction process of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules were optimized by single factor investigation, with the contents of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ as optimization indicators. The HPLC-ELSD method was developed for the detection of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules. Separation was carried out on an XBridge®Shield RP18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile-water(32:68)at the flow rate of 1 ml/min. The column temperature was maintained at 30 ℃. The drift tube temperature was set at 60 ℃, and the carrier gas flow rate was 1.7 SLM. Results The optimized extraction methods of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules were as the following: methanol reflux extraction for 1.5 h, and n-butanol extraction and ammonia washed for 5 and 2 times, respectively. The HPLC-ELSD method was established to detect the contents of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ. The linear relationship was good (r > 0.9997). The intra-day and inter-day precision was less than 1%. The recovery rates were 95.65% and 100.57%. The stability and repeatability RSD were less than 3%. The contents were 2.8630 mg/g and 0.2576 mg/g. The RSDs were 0.62% and 1.51%, respectively. Conclusion The extraction method of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules is optimized, and a reliable, accurate and reproducible HPLC-ELSD method for the detection of the contents of ginsenoside Rb1 and astragaloside Ⅳ in Weikang granules is established. -
Key words:
- Weikang granules /
- astragaloside Ⅳ /
- ginsenoside Rb1 /
- content determination /
- HPLC-ELSD
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表 1 不同提取方式对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取方式 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 超声 1.4443±0.0182 0.1849±0.0049 回流 2.4407±0.0032 0.2463±0.0696 表 2 不同提取溶剂对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取溶剂 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 水 0.4566±0.0029 ND 甲醇 2.3946±0.0164 0.2336±0.0397 乙醇 1.3876±0.0158 0.1049±0.0263 表 3 不同提取料液比对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取料液比(V∶V) 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 1∶3 2.4385±0.0179 0.1971±0.0065 1∶6 3.1305±0.0354 0.3647±0.0083 1∶10 2.6230±0.0261 0.2259±0.0146 1∶20 1.8379±0.0010 ND 1∶50 0.6474±0.0273 ND 表 4 不同提取时间对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
提取时间(h) 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 0.5 1.9815±0.0591 0.1764±0.0107 1 2.2053±0.0154 0.1951±0.0026 1.5 2.2086±0.0377 0.2184±0.0032 2 0.0806±0.0015 ND 表 5 正丁醇提取次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
正丁醇提取次数 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 3次 1.6452±0.0234 0.1459±0.0214 4次 1.9642±0.0063 0.1874±0.0209 5次 2.5756±0.0213 0.2379±0.0030 6次 2.4577±0.0178 0.2384±0.0081 表 6 氨水洗涤次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响
氨水洗涤次数 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 1次 2.3970±0.0851 0.2776±0.0201 2次 2.4393±0.0236 0.2875±0.0050 3次 2.1734±0.0009 0.2766±0.0024 表 7 3批胃康颗粒的含量测定结果
批号 人参皂苷Rb1(mg/g) 黄芪甲苷(mg/g) 20200112 2.8534 0.2594 20200115 2.8521 0.2531 20200118 2.8836 0.2602 平均值 2.8630±0.0178 0.2576±0.0039 RSD(%) 0.62 1.51 -
[1] 李美丽, 朱西杰, 李卫强, 等. 朱西杰教授治疗残胃炎的临床经验总结[C]//中华中医药学会脾胃病分会第二十五届全国脾胃病学术交流会论文集. 贵阳, 2013: 252. [2] 乔伊娜, 朱西杰, 李卫强. 朱西杰教授治疗溃疡性结肠炎经验总结[J]. 中国民族民间医药, 2017, 26(11):86-88. [3] 安婷婷, 叶景阳, 孔娟, 等. 慢性萎缩性胃炎胃黏膜修复方法临床研究[J]. 山东中医杂志, 2016, 35(11):977-980. [4] 段立军, 孙博航. 黄芪甲苷的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报, 2011, 28(5):410-416. [5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 11-12. [6] 杜志谦, 张利静, 夏华玲, 等. HPLC-ELSD法测定特制接骨丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re的含量[J]. 中医药导报, 2017, 23(7):77-79. [7] 徐鹏, 冯素香, 赵迪, 等. HPLC-ELSD法测定血塞通注射液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd[J]. 中成药, 2013, 35(3):521-524. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2013.03.021 [8] 付娟, 李家春, 张海弢, 等. HPLC-ELSD法同时测定益心舒片中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量[J]. 广东药学院学报, 2015, 31(1):62-65. doi: 10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.014 [9] 张春辉, 王友兰, 傅超. HPLC-ELSD同时测定跌打丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量[J]. 中国现代应用药学, 2016, 33(1):91-93. [10] 陈骁勇, 葛玉松. HPLC-ELDS法测定参芪五味子片中黄芪甲苷和酸枣仁皂苷A的含量[J]. 中国药师, 2012, 15(12):1743-1745. doi: 10.3969/j.issn.1008-049X.2012.12.028 [11] 王银, 邱连建. HPLC-ELSD法同时测定益肺清化颗粒中的黄芪甲苷、桔梗皂苷D和麦冬皂苷D的含量[J]. 天津药学, 2018, 30(5):11-13. doi: 10.3969/j.issn.1006-5687.2018.05.004