下载:
下载:
-
痛风在中医理论中属于“痹证”、“白虎历节”范畴[1]。中医辨证分型主要有湿热蕴结型、寒湿痹阻型、肝肾亏虚型、痰瘀痹阻型、瘀血阻滞型、脾虚湿盛型和寒热错杂型[2]，在治疗上主要以泄浊利湿、通络止痛为主[3]。茵连痛风颗粒为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院自制制剂，是著名夏氏外科传人夏涵教授数十年的经典经验方。该制剂由茵陈、连钱草和伸筋草三味中药组成，用于治疗间歇期痛风性关节炎[4]。茵连痛风颗粒的成分多样，前期研究中发现其不同部位群对痛风模型大鼠均有不同程度的抗炎镇痛作用[5]，但其作用有效成分和疾病靶标的关系尚不明确，抗炎镇痛作用可能与香豆素[6]、黄酮、有机酸[7]、三萜类、生物碱类以及蒽醌类[8]等成分有关。因此，笔者采用网络药理学方法对茵连痛风颗粒的抗炎镇痛作用机制进行分析，预测茵连痛风颗粒的主要活性成分和潜在靶标部位，以期为该制剂建立临床疗效的质量评估体系提供支持。
-
本研究利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[9]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索获得茵连痛风颗粒中三味中药的化学成分，通过TCMSP筛选出化学成分对应的数据，预测成分的口服利用度(OB) 和类药性(DL)[10]，以OB≥30%且DL≥0.18作为筛选条件，筛选出活性成分，再将其依次输入TCMSP，查找得到潜在的靶点蛋白，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）[11]匹配蛋白所对应的基因。
-
将茵连痛风颗粒的活性成分及潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件（http://www.cytoscape.org /），构建并预测茵连痛风颗粒的活性成分及靶点网络。
-
基于OMIM数据库[12]检索抗炎、镇痛相关靶蛋白基因，搜索关键词"pain"、"ache"、"soreness"、"inflammation"、"inflammatory"，所有靶标均通过UniProt数据库获取其UniProt ID信息。
-
将OMIM中获取到的蛋白质信息导入STRNG数据库，筛选出蛋白相互作用分值>0.7的高置信数据[13]，用Cytoscape 3.7.2构建与抗炎镇痛有关的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI) 网络。
-
利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能，将茵连痛风颗粒活性成分-预测靶点网络与抗炎镇痛的PPI网络合并，确定两者共有的潜在作用靶点。通过Cytoscape3.7.2构建茵连痛风颗粒活性成分-潜在靶点网络，并分析茵连痛风颗粒抗炎镇痛的潜在靶点。
-
采用David v6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[14-16]，对与抗炎镇痛相关的茵连痛风颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行基于基因组百科全书(KEGG)的生物通路富集分析，并利用OmicShare对通路进行可视化，采用Davidv6.8数据库，对与抗炎镇痛相关的茵连痛风颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行基因本体GO功能富集分析[13]。
-
在TCMSP数据库中搜索“茵陈”、“连钱草”、“伸筋草”三味中药的化学成分，共得到175个化学成分，以OB≥30%且DL ≥0. 18作为筛选条件，删除无对应靶点的成分，共获得23个潜在有效成分（表1），其中，茵陈和连钱草共有成分为槲皮素和β-谷甾醇[17]（图1）。
表 1 茵连痛风颗粒23个有效活性成分及其OB及DL值
编号 活性成分 OB（%） DL 来源 YC1 异鼠李素 49.60 0.31 茵陈 A1 β-谷甾醇 36.91 0.75 茵陈 YC2 茵陈黄酮 48.96 0.41 茵陈 YC3 芫花素 37.13 0.24 茵陈 YC4 蓟黄素 30.35 0.30 茵陈 YC5 异茵陈黄酮 57.40 0.41 茵陈 YC6 紫杉醇 46.11 0.33 茵陈 YC7 依帕替丁 42.55 0.37 茵陈 YC8 茵陈色原酮 57.56 0.31 茵陈 YC9 4'-甲基茵陈色原酮 72.18 0.35 茵陈 YC10 脱甲氧基姜黄素 52.33 0.25 茵陈 YC11 茵陈黄酮A 68.32 0.24 茵陈 A2 槲皮素 46.43 0.28 茵陈 LQC1 金合欢素 34.97 0.24 连钱草 LQC2 蒙花苷 39.84 0.71 连钱草 LQC3 丁子香萜 55.38 0.78 连钱草 A1 β-谷甾醇 36.91 0.75 连钱草 LQC4 山奈酚 41.88 0.24 连钱草 LQC5 木犀草素 36.16 0.25 连钱草 A2 槲皮素 46.43 0.28 连钱草 SJC1 谷甾醇 36.91 0.75 伸筋草 SJC2 福莫尼汀 69.67 0.21 伸筋草 SJC3 豆甾醇 43.83 0.76 伸筋草 
图 1 茵连痛风颗粒有效活性成分韦恩图
-
将筛选出的23个茵连痛风颗粒潜在有效成分导入到TCMSP，查找相应的靶点，得到686个潜在靶点蛋白，并利用Uniprot数据库匹配对应基因。将结果导入到Cytoscape 3.7.2软件中进行网络构建，得到茵连痛风颗粒活性成分靶点网络（图2）。该网络包含228个节点、686条边，红色六边形表示茵陈特有的活性成分、紫色六边形表示连钱草特有的活性成分、绿色六边形表示伸筋草特有活性成分、黄色箭头表示两个成分共有的活性成分、粉色菱形表示单味药的作用靶点、湖绿色菱形表示两味药共同的作用靶点、蓝色菱形表示三味药共同的作用靶点。如图2所示，23个茵连痛风颗粒的活性成分均具有多靶点，不同靶点可对应相同成分，不同的成分可对应相同的靶点。
图 2 茵连痛风颗粒主要活性成分-靶点网络
-
在OMIM数据库检索与抗炎镇痛相关的基因，共检索到286个相关基因靶点。与茵陈活性成分共有32个共同靶基因，与连钱草活性成分共有35个共同靶基因，与伸筋草活性成分共有7个共同靶基因（图3）。
图 3 茵连痛风颗粒活性成分相关基因与抗炎镇痛相关基因
-
将茵连痛风颗粒预测所得的基因与抗炎镇痛相关基因进行映射后得到共有靶基因，输入STRNG数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析过程中，选取物种为Homosapiens，并将蛋白-蛋白互作得分>0.7的基因输入Cytoscape 3.7.2进行网络可视化，共有37个节点，285个连线。应用软件中的NetworkAnalysis plugin对网络图中节点进行统计，分析其在图中的作用，自由度越大，该节点在网络中的生物功能则越多。同时，颜色越深代表该节点自由度较大、生物功能较多（图4）。进一步对与抗炎镇痛潜在靶点网络进行分析，网络中有17个靶点的自由度值大于平均度值15.41，预测可能为茵连痛风颗粒活性成分发挥抗炎镇痛疗效的潜在靶点。
图 4 茵连痛风颗粒抗炎镇痛蛋白-蛋白相互作用图
-
利用David平台进行GO功能富集分析，得到了293个GO条目，根据P<0.05筛选出211个GO条目，针对前10条BP分析、CC分析、MF分析绘制直方图（图5）。其中，生物过程条目170条，主要包括炎症反应、基因表达的正调控、IL -6的正调控等；细胞组成条目16个，主要包括I-kappaB/NF-kappaB复合体、细胞质核周区域、GABA-A受体复合物等；分子功能条目25条，主要包括细胞因子活性、酶结合、蛋白质异二聚活性等。
图 5 茵连痛风颗粒抗炎镇痛靶点的GO富集
利用David平台的KEGG通路富集分析功能，得到79条信号通路，根据P<0.001筛选出50条信号通路（图6）；包括TNF信号通路、NOD受体信号通路、NAFLD、MAPK信号通路、Ras 信号通路、核转录因子B信号通路等。
图 6 茵连痛风颗粒抗炎镇痛关键靶基因KEGG通路富集
-
基于上述信息，构建活性成分-靶点-通路图，以全面阐述茵连痛风颗粒抗炎镇痛的作用机制（图7）; 图中有112个节点和462条边，绿色菱形代表茵连痛风颗粒活性成分，红色圆形代表潜在靶点，黄色箭头代表信号通路，边代表三者之间的相互作用，节点越大表示其抗炎镇痛的作用越大。
图 7 茵连痛风颗粒抗炎镇痛活性成分-靶点-信号通路网络
-
茵连痛风颗粒由茵陈、连钱草和伸筋草三味中药组成，茵陈具有清利湿热、利胆退黄的功效；连钱草具有利湿通淋，清热解毒，散瘀消肿的功效；伸筋草具有祛风除湿、舒筋活络的功效。三者合用增强了清热利湿，通络止痛的作用[18]。
本研究通过TCMSP、Uniprot数据库筛选潜在的抗炎镇痛活性成分，得出槲皮素、β-谷甾醇、茵陈色原酮、异鼠李素等23个黄酮类、甾体类成分。这些成分与现有文献报道中关于抗炎镇痛的活性成分相符[19-22]。其中，共有成分槲皮素为黄酮类化合物，有研究表明槲皮素对炎症反应具有良好的抑制作用，对化学刺激疼痛模型和热刺激疼痛模型均有显著的镇痛作用[23]。共有成分β-谷甾醇为甾体类化合物，具有类似于氢化可的松的抗炎活性，其抗炎机制主要是通过局部免疫调节来发挥抗炎作用[24]。
通过OMIM数据库、STRNG数据库及Cytoscape软件构建抗炎镇痛靶标蛋白-蛋白交互网络，揭示茵连痛风颗粒通过多靶点起到抗炎镇痛的作用。本研究共得到PTGS2、TNF、IL-6、IL-10等37个茵连痛风颗粒抗炎镇痛的关键靶点。前列腺素内过氧化物合酶PTGS），又称为环氧合酶（COX），存在两个亚型，即COX-1和COX-2[25]。PTGS2产生炎症性前列腺素，参与炎症的发生，同时与其他预测所得出的靶点都有密切联系[26-27]。TNF[28]、IL-6有致痛和痛觉增敏的作用，IL-10有活性较强的抗炎作用，除具抑制促炎细胞因子的产生外，还能促进其他抗炎因子的产生、下调促炎因子受体的表达[29]。PTGS2等靶点是抗炎镇痛的关键靶点，在炎症反应、基因表达等生物过程中起着至关重要的作用。
KEGG富集结果表明，茵连痛风颗粒抗炎镇痛关键靶点基因显著富集在TNF信号通路、MAPK信号通路、核转录因子B信号通路等。茵陈中的黄酮类成分具有重要的抗炎活性，其潜在的抗炎机制可能与其对NF-κB和MAPK信号通路的抑制有关[6]。研究表明[30]，茵陈色原酮通过JNK途径激活转录因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游靶标血红素加氧酶1（HO-1）水平，减弱LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，也可有效抑制MyD88和Toll/IL-1接头蛋白（TIRAP）介导的信号通路，进而抑制LPS诱导的NF-κB、蛋白激酶B（Akt）和MAPK激活的炎症基因活化，从而发挥抗炎作用。
综上所述，本研究基于网络药理学，对茵连痛风颗粒抗炎镇痛的多成分、多靶点和多信号通路进行相关性研究，初步揭示了茵连痛风颗粒中三味中药的抗炎镇痛分子机制，为进一步开展和实验验证茵连痛风颗粒抗炎镇痛作用机制提供理论依据。
Anti-inflammatory and analgesic activity analysis of Yinlian Tongfeng granules based on network Pharmacology
-
摘要:
目的 通过网络药理学的研究方法探讨茵连痛风颗粒抗炎镇痛作用的可能作用机制。 方法 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)收集茵连痛风颗粒主要活性成分，预测其作用靶点；利用蛋白质互作网络信息建立药物与抗炎镇痛相关靶基因之间的相互作用关系，进行KEGG与GO功能富集分析。 结果 茵连痛风颗粒中与抗炎镇痛密切相关的靶点共有37个，主要包括前列腺素过氧化物合酶 2（PTGS2）、白介素-6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）等潜在作用靶点，这些靶点的作用机制主要与调节核转录因子B信号(NF-κB) 等通路相关。 结论 该研究从多维度预测了茵连痛风颗粒多靶点抗炎镇痛的作用机制，为进一步验证该制剂临床作用机制提供理论依据。 Abstract:Objective To explore the anti-inflammatory and analgesic mechanism of Yinlian Tongfeng granules by network pharmacology. Methods Three main active components of Yinlian Tongfeng granules were collected from TCMSP database to predict its effective targets. Based on the network information of active components and targets, the anti-inflammatory and analgesic related targets were established by using protein-protein interaction information. The enrichment analysis of KEGG biological pathway and go function enrichment were carried out to construct the active component-target-signal pathway network and explain the main mechanism of anti-inflammatory and analgesic. Results 37 targets were closely related to anti-inflammation and analgesic effects of Yinlian Tongfeng granules, mainly on Prostaglandin endoperoxide synthase 2(PTGS2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factors (TNF). The mechanism of action may relate to the regulation of nuclear transcription factor B signaling pathway(NF-κB). Conclusion The study predicted the anti-inflammatory and analgesic mechanism of Yinlian Tongfeng granules, and provided theoretical basis for further verification and interpretation of its mechanism. -
Wentilactone A（WA）是从海洋微生物中分离得到的去甲二萜类小分子化合物，对小细胞肺癌细胞系NCI-H460和NCI-H446细胞的增殖具有抑制作用，可诱导小细胞肺癌细胞系NCI-H446和NCT-H1688细胞凋亡[1]。对小细胞肺癌细胞系NCT-H1688细胞的细胞迁移和集落形成具有抑制作用[2]。WA作为一种有效抗肿瘤候选物，已从制备工艺、理化性质、急性毒性、生殖毒性等方面证明其良好的成药性[3]。遗传毒性安全性实验更是对其临床前研究全面性的补充，为提高临床用药的安全性，为了验证其是否具有遗传毒性，本实验应用微生物回复突变试验（Ames试验）、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法对WA的遗传毒性进行了系统的研究，为WA的临床前毒性评价提供资料[4]。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化合物WA
Ames试验用WA（含量：99.9%，批号：20121115，黄色粉末）、体外培养CHO细胞染色体畸变试验用（规格：10 ml，含量：50.8 mg/ml，批号：20130506，黄色澄明溶液）、小鼠骨髓微核试验用WA（规格：10 ml/支：100mg，含量：10.2 mg/ml，批号：20130407，黄色澄明溶液），均由海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室提供。WA的化学结构见图1。
1.1.2 菌株
组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株，复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予。实验前对其进行鉴定（R因子和自发回变数鉴定），均符合规定标准。
1.1.3 细胞
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。
1.1.4 动物
ICR小鼠（SPF级）共60只，每组10只，雌雄各半，5～6周龄，购入时体重16.5～20.8 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：2008001629237。自购入起3天进行检疫，给药时体重20.3～23.6 g。
1.2 试验方法
按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》[5-6]的设计要求，分别应用Ames试验[7]、体外培养CHO细胞染色体畸变试验[8]和小鼠骨髓微核试验[9]检测WA的遗传毒性。检测终点覆盖了基因突变、染色体畸变和细胞有丝分裂异常。
1.3 实验步骤
1.3.1 Ames实验
根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》的要求，应用S. typhimurium TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株，设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组。此外，设空白对照、溶剂对照和阳性对照组（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在加和不加代谢活化系统S9的条件下接触受试物，每皿均加入供试品或溶剂对照DMSO 0.1 ml，每个剂量组及对照组均设3个平行皿。并用最低极限的琼脂培养基培养48 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶剂对照组进行比较，重复实验一次。
表 1 阳性对照品名称及浓度组别 菌株 阳性对照品 溶液终浓度（μg/皿） 加入量（μl/皿） 浓度（μg/ml） －S9组 TA97 敌克松 50 100 500 TA98 敌克松 50 100 500 TA100 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA102 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 0.5 100 5 +S9组 TA97 2-氨基芴 10 100 100 TA98 2-氨基芴 10 100 100 TA100 2-氨基芴 10 100 100 TA102 1,8-二羟基蒽醌 50 100 500 TA1535 环磷酰胺 50 100 500 1.3.2 染色体畸变试验
在加和不加代谢活化系统S9的条件下，体外培养的CHO细胞中加入相应浓度的供试品或对照品，反应体系总体积为10 ml。低、中、高剂量组供试品终浓度分别为23.74、47.48和94.96 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5 μg/ml、60 μg/ml，另设溶剂对照组分别作用于细胞4 h后换液继续培养至24 h，和药物作用细胞24 h后收集细胞。收获细胞前4 h，加入终浓度0.2 μg/ml秋水仙素，培养结束收集细胞，经离心、低渗处理、固定、离心、制片和Giemsa染色，每个剂量组制备2～3张玻片标本。
镜检时每组观察200个染色体中分散良好、数目完整的中期分裂相细胞（若观察到大量染色体畸变细胞，如阳性对照组，分析细胞数可相应减少为至少100个细胞）。计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），记录原始数据计算畸变率。
1.3.3 小鼠骨髓微核实验
检疫期结束后分别按低、中、高组小鼠给药，分别予100、200、400 mg/kg剂量给药，其中高剂量组设两组分别在药物作用24 h和48 h后处死，并设阳性对照组和溶剂对照组。分别在药物作用24 h和48 h后处死小鼠，取股骨骨髓制成骨髓涂片，每只动物制2张涂片，经甲醇固定后用pH6.8的Giemsa染液染色。
每只动物镜检约2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE值。
1.4 剂量设计
对于易溶无毒的化合物，细菌实验最高浓度应达到5 mg/皿[10]。Ames试验设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组，每皿均加入相应浓度的供试品溶液0.1 ml，另设空白对照、溶剂对照和阳性对照。在哺乳动物细胞体外遗传实验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率[11]。通过预实验确定供试品的IC50为94.96 μg/ml。染色体畸变试验的低、中、高剂量组为23.74、47.48和94.96 μg/ml，试验时在10 ml的试验体系中分别加入0.1 ml各剂量组的应用液，另设阳性对照组和溶剂对照。ICR小鼠的微核试验采用小鼠经尾静脉注射给药，总剂量分别为100、200、400 mg/kg（单次给药剂量分别为50、100、200 mg/kg，分上、下午两次经尾静脉注射给药），给药容积为20 ml/kg体重；同时设阳性对照组和溶剂对照组。阳性对照组以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺，给药容量为10 ml/kg体重；溶剂对照组给药方式与受试物组相同，以20 ml/kg体重的容积经尾静脉注射生理盐水。
1.5 统计方法
Ames试验结果的评价是以溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，与受试物各剂量组相比较。若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性[12]。染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验均采用卡方检验或方差分析方法研究给药组与对照组之间是否具有统计学意义[13]。
2. 结果与分析
2.1 Ames试验结果
受试物各剂量组和对照组的平皿均可见背景菌苔生长。5支菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史参考范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落与空白对照组相比数目显著增加，提示本试验系统符合要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象。各剂量组受试物在加或不加S9时对TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近，未观察到明显的剂量-反应关系。结果见表2和表3。
表 2 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，${\rm{\bar x}}$ ±s)（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4 空白对照组 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4 溶剂对照组 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1 阳性对照组 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13 表 3 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，${\rm{\bar x}}$ ±s)（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4 空白对照组 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4 溶剂对照组 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4 阳性对照组 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22 2.2 染色体畸变试验结果
染色体分析结果显示，阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h在+ S9和－S9的情况下染色体畸变率分别为11%和11%，与溶剂对照组相比，均有统计学差异（P<0.05）；23.74、47.48和94.96 μg/ml受试物在24 h、+S9条件下染色体畸变率分别为1%、1%和0.5%，24 h、－S9条件下染色体畸变率分别为0%、0.5%和0%；4 h、－S9条件下染色体畸变率分别为0%、0%和0%。综上，受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比，其差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表4~6。
表 4 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(+S9)组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 1 1 0 0 0 0 0 1 2 1 47.48 μg/ml 200 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶剂对照组 200 200 0 0 0 0 0 3 3 3 1.5 阳性对照组 100 9 0 0 1 3 3 0 0 14 14 注：阳性对照组：+S9、环磷酰胺（60 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；* P<0.05，与溶剂对照组比较。 表 5 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9)组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性对照组 100 4 4 0 0 0 0 4 0 12 12* 注：阳性对照组：－S9、丝裂霉素C（0.5 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；*P<0.05，与溶剂对照组比较。 表 6 WA对4 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9/4 h)组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 阳性对照组 * P<0.05，与溶剂对照组比较。 2.3 小鼠骨髓微核试验的结果
试验结果经统计学分析表明，WA在100、200、400 mg/kg剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组和阳性对照组雌、雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为2.10‰和21.36‰、1.90‰和20.88‰，两组相比差异均有统计学意义（P<0.05），验证了本次试验系统的有效性。WA 100和2 000 mg/kg剂量24 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为1.60‰和1.80‰、1.90‰和1.60‰；400 mg/kg剂量24 h和48 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为2.10‰和2.80‰、2.40‰和1.29‰，与溶媒对照组相比均无显著差异（P>0.05）。结果见表7。
表 7 WA对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果组别 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（${\rm{\bar x}}$±s） 微核率（${\rm{\bar x}}$±s, ‰） 100 mg/kg 雌 5 10 020 2.40±0.89 1.60±0.96 200 mg/kg 雌 5 10 010 1.63±0.40 1.80±1.31 400 mg/kg (24 h采样) 雌 5 10 016 1.95±0.40 2.10±1.20 400 mg/kg (48 h采样) 雌 5 10 009 1.58±0.44 2.80±1.81 溶媒对照组 雌 5 10 009 2.37±0.69 2.10±1.20 阳性对照组 雌 5 9 095 2.18±0.30 21.36±7.84* 100 mg/kg 雄 5 10 016 1.56±0.30 1.90±1.28 200 mg/kg 雄 5 10 009 1.52±0.28 1.60±0.70 400 mg/kg (24 h采样) 雄 5 10 006 1.40±0.73 2.40±2.01 400 mg/kg (48 h采样) 雄 5 8 802 1.43±0.63 1.29±1.26 溶媒对照组 雄 5 9 029 2.13±0.58 1.90±1.45 阳性对照组 雄 5 10 011 1.62±0.42 20.88±4.94* *P<0.05，与溶剂对照组比较。 3. 讨论
沙门菌回复突变试验（Ames试验）被研究者广为采用，该法的特点是快速、简便、敏感、经济，是经典的测试化学物质或药物致突变性实验[10]。染色体畸变分析是采用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞体外培养的方法进行的。CHO细胞在加或不加代谢活化系统的条件下，与受试物接触一定时间后再于收集染色体4 h前用秋水仙碱处理，使细胞的有丝分裂停止在中期相。然后收集细胞，经低渗、固定、涂片和染色后，在显微镜下观察染色体数量和结构的改变，检测受试物的诱变性[7]。微核试验是检测化合物对染色体损伤作用的重要方法。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化合物，微核试验都可检测[8]。
本研究采用遗传毒性研究经典组合的方法，分别从原核系统到真核系统，从体外试验系统到体内试验系统，体外试验中包含了加与不加代谢活化系统，能检测基因突变、染色体畸变等多个遗传学终点，符合国际标准化的要求[5-6]。
本研究结果显示，本试验条件下，采用标准平板掺入法，WA在每皿5 000、500、50、5、0.5 μg的受试剂量下，加或不加S9时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌均无致突变性；对CHO细胞，在23.74、47.48、94.96 μg/ml 3个剂量组，加或不加S9，于24 h和48 h诱发的细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比较其差异均无统计学意义（P>0.05），表明WA在受试剂量下无致CHO细胞染色体畸变效应；WA在100、200、400 mg/kg 3个剂量下，对ICR小鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较均无显著差异，表明其在受试剂量下对ICR小鼠无致微核效应[14]。上述结果提示WA没有遗传毒性和潜在致癌性。
此前有文献表明WA对小细胞肺癌的增殖有抑制作用，但对于遗传毒性未见报道。本研究对降低WA在研发过程中用于临床试验和疾病治疗的用药风险发挥重要作用。
-
图 3 茵连痛风颗粒活性成分相关基因与抗炎镇痛相关基因
A.茵陈活性成分对应的靶基因与抗炎镇痛相关基因共同靶基因；B.连钱草活性成分对应的靶基因与抗炎镇痛相关基因共同靶基因；C. 伸筋草活性成分对应的靶基因与抗炎镇痛相关基因共同靶基因。
表 1 茵连痛风颗粒23个有效活性成分及其OB及DL值
编号 活性成分 OB（%） DL 来源 YC1 异鼠李素 49.60 0.31 茵陈 A1 β-谷甾醇 36.91 0.75 茵陈 YC2 茵陈黄酮 48.96 0.41 茵陈 YC3 芫花素 37.13 0.24 茵陈 YC4 蓟黄素 30.35 0.30 茵陈 YC5 异茵陈黄酮 57.40 0.41 茵陈 YC6 紫杉醇 46.11 0.33 茵陈 YC7 依帕替丁 42.55 0.37 茵陈 YC8 茵陈色原酮 57.56 0.31 茵陈 YC9 4'-甲基茵陈色原酮 72.18 0.35 茵陈 YC10 脱甲氧基姜黄素 52.33 0.25 茵陈 YC11 茵陈黄酮A 68.32 0.24 茵陈 A2 槲皮素 46.43 0.28 茵陈 LQC1 金合欢素 34.97 0.24 连钱草 LQC2 蒙花苷 39.84 0.71 连钱草 LQC3 丁子香萜 55.38 0.78 连钱草 A1 β-谷甾醇 36.91 0.75 连钱草 LQC4 山奈酚 41.88 0.24 连钱草 LQC5 木犀草素 36.16 0.25 连钱草 A2 槲皮素 46.43 0.28 连钱草 SJC1 谷甾醇 36.91 0.75 伸筋草 SJC2 福莫尼汀 69.67 0.21 伸筋草 SJC3 豆甾醇 43.83 0.76 伸筋草 
下载: 导出CSV
-
[1] 邓丰承, 邓允英. 清热祛湿方结合关节镜清理术治疗膝关节痛风性关节炎的疗效分析[J]. 中国处方药, 2018, 16(2):108-109. doi: 10.3969/j.issn.1671-945X.2018.02.077 [2] 孙广瀚, 刘健, 龙琰, 等. 中医药治疗痛风性关节炎的研究进展[J]. 风湿病与关节炎, 2019, 8(8):64-67, 80. doi: 10.3969/j.issn.2095-4174.2019.08.015 [3] 黄艳霞. 中医治疗痛风性关节炎用药规律分析[J]. 湖南中医杂志, 2014, 30(2):111-112. [4] 陈娜, 张明, 王一飞. 茵连痛风颗粒治疗间歇期痛风性关节炎临床观察[J]. 中国中西医结合杂志, 2017, 37(7):883-885. doi: 10.7661/j.cjim.20170427.119 [5] 刘静, 徐玲玲, 徐熠. 痛风颗粒抗痛风有效部位群研究[J]. 中草药, 2013, 44(5):590-594. [6] 刘玉萍, 邱小玉, 刘烨, 等. 茵陈的药理作用研究进展[J]. 中草药, 2019, 50(9):2235-2241. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.09.033 [7] 陈利华, 李欣. 连钱草化学成分及药理作用研究[J]. 亚太传统医药, 2014, 10(15):33-35. [8] 蔡卓亚, 周自桂, 李萍, 等. 伸筋草化学成分及药理作用研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(2):297-304. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.02.026 [9] RU J L, LI P, WANG J N, et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminform,2014,6(1):1-6. doi: 10.1186/1758-2946-6-1 [10] XU X, ZHANG W X, HUANG C, et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J]. Int J Mol Sci,2012,13(6):6964-6982. doi: 10.3390/ijms13066964 [11] ZHANG Y Q, MAO X, GUO Q Y, et al. Network pharmacology-based approaches capture essence of Chinese herbal medicines[J]. Chin Herb Med,2016,8(2):107-116. doi: 10.1016/S1674-6384(16)60018-7 [12] RAPPAPORT N, TWIK M, PLASCHKES I, et al. MalaCards: an amalgamated human disease compendium with diverse clinical and genetic annotation and structured search[J]. Nucleic Acids Res,2017,45(D1):D877-D887. doi: 10.1093/nar/gkw1012 [13] 张思旋, 林茜, 吴嘉瑞, 等. 基于网络药理学的“苍术-黄柏”药对治疗痛风作用机制研究[J]. 中国医院用药评价与分析, 2019, 19(8):927-933. [14] JIAO X, SHERMAN B T, HUANG D W, et al. DAVID-WS: a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis[J]. Bioinformatics,2012,28(13):1805-1806. doi: 10.1093/bioinformatics/bts251 [15] HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc,2009,4(1):44-57. doi: 10.1038/nprot.2008.211 [16] HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists[J]. Nucleic Acids Res,2009,37(1):1-13. doi: 10.1093/nar/gkn923 [17] HULSEN T, DE VLIEG J, ALKEMA W. BioVenn - a web application for the comparison and visualization of biological lists using area-proportional Venn diagrams[J]. BMC Genomics,2008,9(1):1-6. doi: 10.1186/1471-2164-9-1 [18] 徐熠. 茵连痛风颗粒的质量控制研究及初步药效学评价[D]. 上海: 上海中医药大学, 2011. [19] 李墨娇, 刘杰, 张玉波, 等. 伸筋草的化学成分研究[J]. 中草药, 2015, 46(1):33-37. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.01.008 [20] 刘杰, 李国强, 吴霞, 等. 连钱草的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(4):695-698. [21] 章林平, 孙倩, 王威, 等. 茵陈有效成分的药理作用及其临床应用的研究进展[J]. 抗感染药学, 2014, 11(1):28-31. [22] WANG X, HUANG H, MA X P, et al. Anti-inflammatory effects and mechanism of the total flavonoids from Artemisia scoparia Waldst. et kit. in vitro and in vivo[J]. Biomed Pharmacother,2018,104:390-403. doi: 10.1016/j.biopha.2018.05.054 [23] 黄敬群, 宋扬, 赵鹏, 等. 槲皮素对急性痛风性关节炎的抗炎、镇痛实验研究[J]. 海峡药学, 2013, 25(7):64-67. doi: 10.3969/j.issn.1006-3765.2013.07.029 [24] 李荣华. 痛风康对急性痛风性关节炎的抗炎作用及对TLRs/MyD88通路的影响[D]. 广州: 广州中医药大学, 2011. [25] 郭璐, 夏道宗, 骆叶姣, 等. 基于网络药理学探讨土茯苓治疗痛风的作用机制[J]. 中草药, 2019, 50(6):1413-1418. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.06.023 [26] BAS E, RECIO M C, GINER R M, et al. Anti-inflammatory activity of 5-O-demethylnobiletin, a polymethoxyflavone isolated from Sideritis tragoriganum[J]. Planta Med,2006,72(2):136-142. doi: 10.1055/s-2005-873191 [27] SAKATA C, KAWASAKI T, IWATSUKI Y, et al. Inhibitory effects of ASP6537, a selective cyclooxygenase-1 inhibitor, on thrombosis and neointima formation in rats[J]. Thromb Res,2017,157:72-78. doi: 10.1016/j.thromres.2017.06.038 [28] 李艳华. 四妙君逸软膏对肛肠病术后疼痛模型大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10影响的实验研究[D]. 长沙: 湖南中医药大学, 2012. [29] 崔允强. 补肾强骨方治疗膝关节骨性关节炎的疗效及对患者血清TNF-α、IL-6和IL-10的影响[J]. 黑龙江医药, 2018, 31(4):831-833. [30] KIM J, LIM J, KANG B Y, et al. Capillarisin augments anti-oxidative and anti-inflammatory responses by activating Nrf2/HO-1 signaling[J]. Neurochem Int,2017,105:11-20. doi: 10.1016/j.neuint.2017.01.018 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 7186
- HTML全文浏览量: 2654
- PDF下载量: 48
- 被引次数: 0
