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过程分析技术（process analytical technology，PAT）通过对关键质量数据包括原始物料质量、中间物料质量和工艺过程参数进行实时监测以确保成品质量[1]。其中，近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）分析技术是PAT的核心技术之一，其独特优势在于测试方便、分析速度快、分析效率高，非常适用于在线分析[2]。目前该技术在国外药企已有很多应用，如对流化过程中干燥终点的控制[3]、监测包衣过程[4]、测定片剂中原料药和辅料的含量[5]等。
硫酸羟氯喹是临床上治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮的常用药物[6-8]。硫酸羟氯喹制粒工艺为湿法制粒，而湿法制粒的产品质量控制主要在制粒过程中。为缩小批间差异和改善工艺，利用PAT技术建立定量或定性模型以检测颗粒水分、混合均匀度和粒径等一系列指标，而水分含量既影响粒径分布也影响混匀程度，故需要优先测量[9]。目前，硫酸羟氯喹颗粒在干燥过程中使用快速水分测定仪测定水分含量，以监测干燥终点。这种分析方法在干燥过程中取样测定水分，会带来人为干扰因素，且水分测定仪的测量时间较长，在等待测量结果时，流化床内的物料水分仍在不断变化。使用NIR分析技术对硫酸羟氯喹颗粒的水分含量进行实时监测，将有助于提高硫酸羟氯喹的生产效率、降低因等待测量结果时物料水分仍在不断降低带来的生产风险，以及提高产成品的质量，有助于向生产全自动化发展。目前，国内使用NIR分析技术监测物料水分含量的报道以离线方式居多[10-13]。课题组之前建立了硫酸羟氯喹颗粒离线水分定量模型[10]，本研究在此基础上先在小试部分建立在线水分定量模型，并在试运行情况良好的基础上将模型转移到车间生产线。结果表明该模型能满足生产过程在线监测硫酸羟氯喹颗粒水分的需求。
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Thermo Antaris MX近红外光谱仪、TQ Analyst 9.5软件（美国Thermo Fisher公司），HX204卤素水分测定仪（瑞士Mettler-Toledo公司），硫酸羟氯喹颗粒（上海上药中西制药有限公司），MATLAB 2014a（美国MathWorks公司），DPL-0.5型多功能制粒/包衣机（重庆精工制药机械有限责任公司），DG400流化床（上海东富龙科技股份有限公司）。
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在流化床锅体的下半部分安装蓝宝石窗口，并将Thermo Antaris MX近红外光谱仪的探头固定于窗口上，取样口在流化床的另一侧。将制粒后的湿颗粒倒入流化床中进行干燥，实验所用样品是在流化床干燥过程中从取样口实时取出得到的样品：流化床开始进风干燥并开始连续采集样品光谱，光谱采集完成后立即取样。因物料温度在30 ℃前样品水分变化较快，故取样间隔时间较短，每隔30 s取一次样品；在物料温度高于35 ℃时水分变化较慢，取样的间隔时间延长，每隔2 min取一次样品，待物料温度继续上升到55 ℃时停止干燥（覆盖了工艺范围以得到全面的样品光谱信息）。一批物料需分成4锅流化床完成，每做一锅流化床采集约10个样本，一批可采集约40个样品，共12批采集519个样品建立模型。
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用水分测定仪测定样品的水分质量含量为1.00%～7.50%（涵盖了工艺优化值1.00%～4.00%）。
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使用近红外光谱仪以漫反射光纤探头的采集方式连续采集干燥过程中的样品的近红外光谱。光谱的扫描范围为10 000～4 500 cm−1，扫描次数为64次，分辨率为8 cm−1，增益值为8×，每次采集光谱前均进行背景光谱的采集，采集得到的近红外光谱如图1所示。
图 1 硫酸羟氯喹颗粒近红外光谱对数图
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利用TQ Analyst 9.5软件结合化学计量学的PLS算法，建立硫酸羟氯喹颗粒含水量的定量分析模型。首先采用Chauvenet准则检验结合杠杆值-学生化残差图鉴别并剔除异常样本[14]，进而采用SPXY分类算法将其余样本划分为校正集和验证集。通过一系列参数，包括校正集误差均方根(RMSEC)、验证集误差均方根（RMSEP）和相关系数R等评价模型进行考察[15]。当模型相关系数R越接近1，说明模型拟合效果好，分析准确度越高。当RMSEC和RMSEP值越小且越彼此接近，即|RMSEP-RMSEC|趋近0，表明模型具有好的稳定性，且当RMSEP值较小时，模型具有较高预测能力。
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异常样本会对NIR模型产生很大的影响，例如误导光谱变量的选择，影响模型的参数估计，降低模型的预测准确度和稳定性[16-18]。采用Chauvenet准则检验结合杠杆值-学生化残差图，鉴别并剔除13个异常样本：23、58、61、70、79、95、96、97、139、223、276、350和473。
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在NIR模型建立的过程中如何挑选具有代表性的样本，对最终模型的预测准确性与稳定性有很大影响。SPXY[19]分类方法是近红外样本分类中一种常用的方法，同时考虑了样本的光谱和浓度特征。进行模型建立的样本共有519份，在“2.4.1”项下剔除了13份样品，将剩余506份样品使用SPXY分类法进行分类，344份样品作为校正集，162份样品作为验证集。主成分分析结果表明，样本的验证集均匀分布在校正集中。
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光谱预处理方法包括MSC、SNV及求导等一系列算法。MSC通过数学方法将光谱中的散射信号与化学信息进行分离，用于消除由于样品颗粒分布不均及颗粒大小不同所产生的散射对其光谱的影响。SNV的作用与MSC基本相同，均是用于消除由于颗粒散射及光程差异给光谱带来的影响[15]。
对光谱进行求导，同时运用Savitzky-Golay(S-G)平滑滤波，或者Karl Norris平滑滤波对光谱进行平滑。求导可以增强光谱信号，平滑可以滤除噪声。从表1可以看出NIR光谱经过MSC、一阶导数以及Karl Norris平滑，能得到较好的数据处理结果。
表 1 不同光谱预处理方法得到的模型参数
预处理方法 RMSEC
（%）RMSEP
（%）RMSECV
（%）R 无预处理方法 0.457 0.499 0.489 0.9206 MSC1 0.467 0.409 0.481 0.9309 SNV2 0.469 0.411 0.483 0.9306 MSC+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 MSC+二阶导数 0.457 0.745 0.867 0.7647 MSC+一阶导数+Norris3 0.408 0.435 0.446 0.9372 SNV+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 SNV+二阶导数 0.456 0.745 0.867 0.7647 SNV+一阶导数+Norris 0.405 0.436 0.446 0.9372 注：1表示多元散射校正；2表示标准归一化变换；3表示平滑滤波。 -
选择合适的波段用于模型的建立，对最终所建模型的预测准确度和稳定性有重要的影响。为了得到NIR光谱的特征信息，首先对前3个主成分的载荷向量进行分析[20]，图2A为前3个主成分全光谱范围的载荷图。由PC1载荷图可知，光谱在4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1附近的波段范围包含更多的特征信息。由PC2和PC3载荷图可知，在上述波段附近也包含较多的光谱信息。同时，与得到求导后的一阶光谱（图2B）相比较，确定上述两个波段与水分之间确实具有较强的相关性，是NIR光谱中水分的主要吸收峰，可用于水分模型的建立。
图 2 硫酸羟氯喹近红外光谱图
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主因子数的选择在建立模型的过程中至关重要，选择正确的主因子数既能完全利用NIR光谱信息，还能避免出现过拟合现象。根据TQAnlyst9.5中的PRESS图，以RMSECV和PRESS最小时所对应的主因子数即为最佳主因子数（本研究中主因子数为6）。
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根据SPXY分类法得到的校正集建立模型，用验证集对模型进行验证。以MSC+一阶导数+Karl Norris平滑为光谱的预处理方式，选择的建模波段为4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1，结合化学计量学中的PLS算法建立NIR定量分析模型（图3）：RMSEC为0.408，相关系数为0.952 9；RMSEP为0.435，相关系数为0.936 6；主因子数为6。从图3可以看出校正集和验证集的数据点在模型范围（1.00%～7.50%）内分布均匀，且校正集分布在验证集的范围内，表明用校正集建立的模型对验证集的验证有效，同时|RMSEP−RMSEC|的数值为0.027，趋近于0，以上结果均表明所建模型较为稳定。
图 3 硫酸羟氯喹颗粒定量模型
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RPD值是验证集标准偏差与预测集标准偏差的比值，即RPD=SDV/SEP。本研究以RPD值对模型进行评价。其中，SDV为验证集所有样本浓度值的标准偏差，SEP为预测集标准偏差。验证集样本的性质分布越均匀，SEP值越小，RPD值越大。本研究中，通过计算得到RPD值为5.18（大于5），表明模型的预测结果可以接受[10]。
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将建立完成的模型应用于一批物料（PAT190601-6）的干燥过程，按“2.1”项下操作，采集所取样品光谱。将采集的光谱导入“2.4.6”项下建立的模型，得到光谱的预测值，用快速水分测定仪测定每份样品的参考值。预测集的RMSEP=0.265。将预测集样本的预测值与参考值进行配对样本t检验，显著性水平设为0.05。检验结果|t|=0.195，小于t双尾临界值1.990，F=1.10<1.46，说明预测值与参考值之间无统计学差异。图4为预测值与参考值水分变化曲线，从图中可以看出两个曲线的重合性较好，进一步表明模型的误差较小，稳定性较好（鉴于流化床体积，一个批次样品需要分为4份进入流化床干燥）。
图 4 4份样品预测值与参考值的水分变化曲线
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在模型已初步建立完成并应用情况较好的小试基础上，将仪器移入车间，开始对大生产过程中物料水分变化进行实时检测。将蓝宝石窗口置于流化床底部，探头切合于窗口，取样口于窗口的对面处。考虑到仪器所处环境的改变可能对光谱产生影响，包括吸收峰的偏移、展宽、吸收强度的非线性变化等[21]，需要对模型在车间的可应用性重新评价。
对一批物料（PAT-191223）进行干燥实验，该批样品需分两批进入流化床，每批采集3～4 g样品后，用水分测定仪测定水分值。预测集的RMSEP=0.265。将预测集样本的预测值与参考值进行配对样本t检验，显著性水平设为0.05。检验结果|t|=0.265，小于t双尾临界值2.110，F=0.78<3.18，说明预测值与参考值之间无统计学差异。
将模型导入Result Operation软件，可实时反映物料（PAT-191223）的水分值变化，由图5可见水分值平稳下降、直至趋于稳定。在干燥过程中，在线取出5份样品，用水分测定仪测量参考值并标于图中（红色为参考值，黑色为预测值）。可见预测值与参考值的重合性较好，表明模型的误差较小且稳定性较好。
图 5 硫酸羟氯喹颗粒水分含量变化图
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模型的误差有两个来源：①探头与取样口间隔较远，降低了采集得到的光谱与样品的空间对应性，对模型的准确度带来影响；②取样口的通道较窄，会造成湿物料堆积，对样品的水分值造成影响。解决方法：①光谱采集完成后立即取样，可以保证光谱与样品的时间对应性，对于提高空间对应性的解决方法是可在窗口附近安装取样口；②及时清理取样口堆积的物料，避免对样品水分值产生影响。
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工艺要求硫酸羟氯喹颗粒水分值为1.00%～4.00%，模型预测范围为1.00%～7.50%，包含了工艺要求的范围，可应用此模型缩小批间的水分差异。例如，当预测值在2.00%时停止干燥，为工艺的改善和提高提供基础。从图5可以看出，部分时间段的水分值上下波动，而非持续下降，且在接近干燥终点时，水分值在2.00%处波动，且无明显下降趋势。原因可能为采集得到的NIR光谱反映的是表层样品的光谱，无法准确反映较深处即流化床锅体内部的物料水分情况，而下一张光谱有可能为内部的物料吹到窗口处采得，因此，预测的水分值略有升高。
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本实验采集了11批次药品用于含水量模型的建立。由于在硫酸羟氯喹的实际生产过程中，原辅料的不同批次之间存在批间差异，此外，生产过程中存在影响硫酸羟氯喹颗粒质量的其他因素，这也导致不同批次的硫酸羟氯喹颗粒之间也存在批间差异。故在建立模型时尽可能包含较多批次，以包含更多批间差异，虽然模型的误差可能会增加，但可提高后期模型在实际大生产中的可应用性。因此，在以后的生产过程中仍需不断累计数据，更新并完善模型。
Establishment of online quantitative model for moisture content determination of hydroxychloroquine sulfate particles by near infrared spectroscopy
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摘要:
目的 为实时检测硫酸羟氯喹颗粒在流化床干燥过程中的水分含量变化，建立颗粒水分的在线近红外光谱定量模型。 方法 物料颗粒在流化床的干燥过程中，实时取样并用水分测定仪测量颗粒水分，采用多元散射校正（multiplicative signal correction, MSC）、一阶导数和Karl Norris平滑的光谱预处理方法，选择近红外4 935～5 336 cm−1和6 911～7 297 cm−1两个波段，运用偏最小二乘回归（partial least squares, PLS）建立基于近红外光谱的水分定量分析模型。 结果 所建模型的校正误差均方根（RMSEC）为0.408，相关系数Rc为0.952 9。预测误差均方根（RMSEP）为0.435，相关系数Rp为0.936 6，验证集标准偏差与预测标准偏差的比值（RPD）为5.18。并将该模型应用于车间生产过程中，t检验结果表明，预测值与参考值之间无显著性差异。 结论 该法所建立的在线水分定量模型准确度较高且较为可靠稳定，该模型可应用于生产过程，以在线监测物料颗粒的水分变化。 Abstract:Objective To establish an online quantitative analysis model for moisture content assay of hydroxychloroquine sulfate particles by near infrared (NIR) spectroscopy. Methods The NIR spectra were collected in real time when the material particles were dried in the fluidized bed. Meanwhile the water content of the particles was measured with the standard moisture tester. The multiplicative signal correction (MSC) and first derivative followed by Karl Norris smoothing were used for spectra pretreatment. Two spectral range (4 935−5 336 cm−1 and 6 911−7 297 cm−1) were selected for the quantitative model with the partial least squares (PLS) regression. Results The quantitative calibration model had good correlation coefficients with Rc value=0.952 9 and Rp value=0.936 6. The root mean square error of calibration (RMSEC) was 0.408 and the root mean square error of prediction error (RMSEP) was 0.435. The ratio of standard deviation of validation set to prediction standard deviation (RPD) was 5.18. There was no significant difference between the predicted value and the reference value by t test when the established model was applied in large-scale production. Conclusion The online model established for monitoring water content has high accuracy and stability, which can be applied in industrial scale process to monitor the particle moisture in real time. -
紫茶生长于非洲肯尼亚海拔1 500～2 000 m的地区，主要成分为多酚类物质。现代药理研究表明，天然植物中的多酚具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]、抗衰老[4]等功效。课题组前期研究发现，紫茶提取物中多酚的纯度不高，直接影响相关制剂的开发。近年来，大孔吸附树脂的应用越来越广泛，尤其是在天然药物有效成分分离和纯化方面具有显著优势[5-8]。本实验以紫茶为研究对象，探索大孔吸附树脂对紫茶总多酚的纯化工艺，以期制备出纯度较高的紫茶总多酚，为其进一步开发利用提供理论依据。
1. 仪器与试药
UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；AUX220型电子分析天平（精度：0.1 mg，日本岛津）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏金坛市友联仪器研究所）。KQ-500B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
肯尼亚紫茶（批号：20181030，火烈鸟茶叶有限公司）；没食子酸对照品（批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院）；铁氰化钾（温州市化学用料厂）；ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；氯化铁、盐酸、乙醇等试剂（西陇科学股份有限公司），以上试剂均为分析纯，水为纯化水。5种大孔吸附树脂的物理参数详见表1。
表 1 5种型号大孔吸附树脂物理参数型号 外观 极性 粒径（l/nm） 比表面积（m2/g） 平均孔径（l/μm） ADS-17 白色不透明球状颗粒 氢键 0.3～1.25 90～150 25～30 D101 白色半透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 480～520 25～28 D301 浅黄色半透明球状颗粒 中极性 0.3～1.25 550～600 48～58 AB-8 白色不透明球状颗粒 弱极性 0.3～1.25 480～520 130～140 X-5 白色不透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 500～600 290～300 2. 方法与结果
2.1 紫茶总多酚的含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品28.4 mg，置于100 ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀制备成母液。精密吸取1 ml母液置10 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度为28.4 μg/ml的对照品溶液，置于冰箱中2～8 ℃避光保存。
2.1.2 供试品溶液的制备
称取紫茶粉末5.0 g，置于圆底烧瓶中，加入50%乙醇500 ml，加热回流提取30 min，放冷至室温，将药液滤过除去沉淀，滤液用50%乙醇补足减失的重量并稀释至500 ml。精密吸取1 ml稀释液，置于100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
2.1.3 线性关系及方法学考察
分别精密吸取浓度为28.4 μg/ml的没食子酸对照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0和1.2 ml于25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe（CN）6]溶液2.0 ml和0.1 mol/L HCl溶液0.5 ml，用纯化水稀释至刻度，摇匀，于室温下避光放置60 min。以相应试剂为空白，在775 nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，以吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.769 9X+0.027 3（r=0.999 7），表明没食子酸浓度在0.227～1.363 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。方法学考察结果表明，专属性良好，平均回收率为100.28%，RSD为2.09%；精密度和重复性试验的RSD小于3%。显示本方法准确可靠。
2.2 大孔吸附树脂的预处理
取5种不同型号的大孔吸附树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分溶胀，将浸泡后的树脂装柱，用95%乙醇以5 ml/min的体积流量冲洗，直至流出液澄清，之后用2倍体积的4%盐酸溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，再用2倍体积的5%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，最后用95%乙醇浸泡保存，临用时以5 ml/min体积流量的纯化水冲洗至中性。
2.3 静态吸附行为考察
2.3.1 大孔吸附树脂的筛选
取预处理后的ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共5份，置于50 ml具塞磨口锥形瓶中。加入质量浓度为50 μg/ml（以多酚含量计）的紫茶总多酚提取液20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附24 h。吸附结束后，滤过，取续滤液按照“2.1”项下方法测定总多酚的含量，计算各树脂在30 ℃下对紫茶总多酚的吸附量和吸附率。然后，将上述吸附饱和的大孔树脂取出，用纯化水清洗后，分别加入70%乙醇20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡24 h，进行静态解吸，计算其解吸率，结果见表2。计算公式如下：
表 2 不同类型大孔树脂对紫茶总多酚的静态吸附率和解吸率树脂型号 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 解吸量（μg/g） 解吸率（%） ADS-17 554.9 68.98 459.0 82.72 D101 621.6 77.74 341.4 54.93 D301 817.4 100.00 107.4 13.14 AB-8 701.8 82.20 598.2 86.73 X-5 727.8 89.90 600.8 81.13 吸附量=（C0−C1）V1/M
吸附率=（C0−C1）/C0
解吸量= C2 V2/M
解吸率=C2 V2/[（C0−C1）V]
其中，C0、C1为吸附前和吸附后吸附液中多酚的质量浓度，C2为解吸附后多酚的质量浓度，V1和V2分别为吸附液和解吸液体积，M为大孔树脂的质量。
由表2结果可知，大孔树脂D301对紫茶总多酚具有较强的吸附效果，其吸附率达到100%，其余4种树脂的吸附率从高到低依次是X-5、AB-8、D101、ADS-17。由此可见，不同类型的树脂对紫茶总多酚的吸附性能各不相同。这可能是由于树脂的内部结构、分子极性以及多酚的溶解度等对树脂吸附多酚能力的影响。多酚由于分子中酚羟基的存在，其分子极性较低，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。采用50%的乙醇进行解吸，可以看出5种树脂的解吸率差异较大，AB-8树脂的解吸效果最好，解吸率达86.73%，X-5树脂次之。综合紫茶总多酚提取液的静态吸附和解吸试验，AB-8型树脂和X-5型树脂对紫茶总多酚的吸附效果和解吸效果均较好，而AB-8型树脂价格相对低廉，从节省成本的角度考虑，优先采用AB-8型树脂对其进行纯化。
2.3.2 静态吸附和解吸曲线的绘制
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共15份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，加入质量浓度为50 μg/ml的紫茶总多酚提取液20 ml，在25 ℃水浴的条件下振荡吸附12 h，每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的吸附率，绘制静态吸附动力学曲线。然后，采用静态解吸试验的方法处理已吸附结束的树脂，进行静态解吸动力学试验，同样每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的解吸率，绘制静态解吸动力学曲线，结果见图1。
由图1可知，在测定的时间点内，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附量随着时间的延长而逐渐增多，经过2.5 h以后，树脂对紫茶总多酚的吸附量趋于平衡，对应的吸附率为88.27%。在0～5 h内，树脂的解吸率呈上升趋势，并在4 h达到最大值84.86%，在随后的时间里，解吸率随着时间的延长变化不大。
2.3.3 吸附液pH值对吸附率的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂1 g，精密称定，共7份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，分别加入质量浓度为50 μg/ml并用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8的紫茶总多酚提取液，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附2.5 h，测定吸附液中紫茶总多酚的质量浓度，计算吸附率，结果见表3。
表 3 pH值对紫茶总多酚吸附率和解吸率的影响pH值 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 2 702.4 89.79 3 712.4 90.79 4 700.3 87.77 5 706.3 89.07 6 652.5 85.71 7 641.7 83.19 8 558.4 71.54 由表3可知，吸附液pH值对紫茶总多酚的吸附率有较大影响。在pH值为2时，AB-8型大孔吸附树脂对此质量浓度下的紫茶总多酚吸附率达89.79%。因此，确定上样液的pH值为2。
2.4 动态吸附行为考察
2.4.1 泄露曲线的绘制
取预处理后的AB-8型树脂10 g，精密称定，室温下将质量浓度为250.0 μg/ml（调至pH为2）的紫茶总多酚提取液（供试品溶液用水稀释）以1.0 ml/min体积流量湿法加至树脂柱中，分段收集流出液，流出液每20 ml收集1份，测定吸光度，计算对应的总多酚含量，绘制泄露曲线。当流出液中总多酚的质量浓度达到上样液质量浓度的1/10，达到泄露点，认为此时为最佳上柱体积，结果见图2。在第2份流出液时，紫茶总多酚已经开始泄露，在第3份流出液中，总多酚的质量浓度为26.5 μg/ml，达到上样液质量浓度的1/10，因此选择上柱体积为60 ml，即3 BV。
2.4.2 上样液质量浓度的影响
取预处理好的AB-8型树脂10 g，精密称定，装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，共5份，分别加入质量浓度为250、375、500、625、750、1 000 μg/ml的上样液（pH为2）各60 ml（3 BV），以1.0 ml/min的流速上柱，收集流出液，按“2. 1”项下方法测定总多酚含量，计算各质量浓度下的吸附率，确定最佳上样质量浓度。结果显示，各上样质量浓度下的吸附率分别为74.50%、77.56%、69.77%、60.59%、56.73%、43.61%。由此可见，上样液质量浓度对大孔吸附树脂吸附性能有显著影响，在考察范围内吸附率总体呈现出先上升后下降的趋势。当质量浓度小于375 μg/ml时，随着上样液质量浓度增加，动态吸附率呈现上升的趋势；分析原因可能是在此较低的浓度范围内，紫茶多酚有较大的机会与大孔树脂的内表面接触，进而加速扩散至树脂孔道内，形成吸附作用。而当质量浓度大于375 μg/ml时，随着质量浓度继续增加，位于孔道内的紫茶总多酚分子的扩散运动受到抑制，导致树脂对多酚的吸附能力降低。因此，选择上样液质量浓度为375 μg/ml。
2.4.3 上样液体积流量的影响
取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×20 cm的层析柱中，共4份，轻敲柱壁，使柱内树脂平衡，打开下端阀门，控制体积流量使柱内纯化水流出，在液面距树脂1 cm时，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2，上样量为3 BV）分别以1.0、2.0、3.0、4.0 ml/min的体积流量上柱，同时收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳上样体积流量。结果显示，吸附率分别为79.37%、79.78%、72.73%、64.73%，当上样体积流量为2.0 ml/min时，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附率最大，故选择上样体积流量为2.0 ml/min。
2.4.4 径高比对动态吸附性能的影响
取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×40 cm的层析柱中，分别设置径高比（柱直径与树脂填充高度比值）为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2）分别以2.0 ml/min的体积流量上柱，对应的药液上样量分别为3、4.5、6、9 BV，收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳径高比。结果显示，吸附率分别为79.81%、78.37%、76.73%、68.54%。径高比1∶6和1∶9对吸附率影响不大。此后，在考察范围内，随着径高比值的降低，吸附率也呈现下降的趋势，可能是由于树脂层过高导致上样液穿透能力差所致。
2.4.5 洗脱剂体积分数的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，共5份，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱（径高比为1∶6，下同），将质量浓度为375 μg/ml上样液（调节pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，分别用纯化水及25%、50%、75%、90%乙醇溶液各3 BV以1.0 ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定其吸光度，计算解吸率，确定最佳洗脱剂体积分数。结果：解吸率分别为17.52%、62.96%、91.04%、81.41%、84.67%，由此可见，50%乙醇对紫茶总多酚的解吸作用最强，故选择洗脱剂的体积分数为50%。
2.4.6 洗脱剂用量的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml的上样液（pH为2）3 BV以2 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇以1.0 ml/min的流速进行洗脱，洗脱溶剂用量分别为1、2、3、4、5 BV，收集洗脱液，测定其吸光度，计算洗脱率，确定最佳洗脱剂用量。结果：解吸率分别为54.68%、83.37%、90.29%、91.48%、91.45%，表明当50%乙醇用量在1～3 BV时，随着用量的增加，对紫茶总多酚的解吸率呈上升的趋势，随后继续增加洗脱剂的用量，解吸率不再增加，表明此时树脂上吸附的总多酚已被充分洗脱，没有必要再增加洗脱剂的用量，故确定洗脱剂的用量为4 BV。
2.4.7 洗脱剂体积流量对洗脱效果的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml上样液（pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇溶液4 BV分别以1.0、2.0、4.0、6.0 ml/min的体积流量进行洗脱，计算解吸率，确定最佳体积流量。结果：对应的解吸率分别为92.47%、93.76%、91.97%、85.18%，表明紫茶总多酚的洗脱率随着洗脱体积流量的加大先升高后减小，故选择最佳洗脱体积流量为2 ml/min。
2.5 最佳工艺的验证
称取4份预处理后的大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm层析柱中（径高比为1∶6），将紫茶提取物预先用石油醚（60～90 ℃）除去脂溶性色素，参考“2.1.2”项下方法加水稀释以制备浓度为375 μg/ml（pH为2）的紫茶总多酚溶液3 BV（总多酚质量为22.5 mg，质量分数40.2%，干膏56.0 mg），并以2 ml/min体积流量上样，待吸附饱和后，先用3 BV水去除杂质，然后用50%乙醇溶液4 BV以2 ml/min的体积流量洗脱，分别收集洗脱液，按照紫茶总多酚定量测定方法，计算总多酚洗脱量及洗脱率，再将洗脱液水浴蒸干，低温烘至恒重，计算干膏的量；精密称取干膏适量，测定总多酚的含量。结果见表4。
表 4 纯化工艺验证结果编号 加入量
（m/mg）纯化前 洗脱量
（m/mg）洗脱率
（%）纯化后 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 平均质量分数（%） RSD（%） 1 22.5 56.0 40.2 20.8 92.4 29.4 70.7 69.8 1.27 2 21.0 93.3 30.6 68.6 3 20.9 92.8 30.0 69.7 4 20.6 91.6 29.4 70.1 由纯化工艺验证结果可见，经过4次验证试验，50%乙醇洗脱条件下总多酚的平均洗脱率为92.5%，紫茶总多酚干膏量由56.0 mg减少至平均29.9 mg，质量分数从40.2%升至平均69.8%，表明建立的纯化工艺对紫茶总多酚有较好的分离、纯化效果。
3. 讨论
大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，目前已广泛应用于中药的活性成分如黄酮、皂苷、生物碱及多酚等成分的分离与纯化。其中，目前采用大孔树脂对多酚类成分进行纯化的有天麻总多酚[9]、白簕叶总多酚[10]、过岗龙总多酚[11]、茶梗中茶多酚[12]等，这都提示了大孔树脂精制多酚类有效成分的可行性。影响大孔树脂的分离纯化有多方面的因素，在选择合适的大孔树脂时，应综合考虑各种影响因素，如树脂的极性、比表面积以及上样液的质量浓度、洗脱液浓度等，以获得最佳的分离效果。在利用大孔树脂纯化时，应尽量滤去上样液中的沉淀，这样既能提高总多酚的纯化率，也能提高树脂的使用寿命。本研究中的样品采用50%乙醇提取后用纯化水进行稀释，当样品溶于水中时，由于多酚类物质能被大孔树脂吸附，而色素及多糖等物质不能吸附而被洗脱掉。而在改为乙醇洗脱时，树脂的吸附效果减弱，被吸附的多酚能被乙醇洗脱。
本研究通过对5种不同型号的大孔吸附树脂的吸附和解吸进行考察，确定了AB-8型大孔吸附树脂纯化紫茶总多酚的最佳工艺条件，为该产品的进一步开发奠定了基础。
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表 1 不同光谱预处理方法得到的模型参数
预处理方法 RMSEC
（%）RMSEP
（%）RMSECV
（%）R 无预处理方法 0.457 0.499 0.489 0.9206 MSC1 0.467 0.409 0.481 0.9309 SNV2 0.469 0.411 0.483 0.9306 MSC+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 MSC+二阶导数 0.457 0.745 0.867 0.7647 MSC+一阶导数+Norris3 0.408 0.435 0.446 0.9372 SNV+一阶导数 0.537 0.506 0.585 0.8962 SNV+二阶导数 0.456 0.745 0.867 0.7647 SNV+一阶导数+Norris 0.405 0.436 0.446 0.9372 注：1表示多元散射校正；2表示标准归一化变换；3表示平滑滤波。 
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