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老药新用是药物设计的重要途径之一,采用此方法可以获得药物研究所需的先导化合物,迄今为止已有许多成功的案例,特别是在新型冠状病毒肺炎治疗药物研究中采用此策略,获得了很多有价值的药物[1-3]。阿司匹林从发明至今已有百年的历史,最初用于解热、镇痛和抗炎。随着医学科学的发展,在临床上发现阿司匹林的新用途,能够抑制血小板的聚集,抑制心脑血管疾病的发生[4-5]。因此,从上市药物中寻找新的适应证或将其作为先导物进行结构优化的老药新用设计方法成为药物研究的有效手段[6-7]。
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课题组在针对p53-MDM2靶标进行虚拟筛选过程中,发现Wayne等已运用计算机构象筛选法对ZINC数据库中3244个FDA已批准上市药物进行了筛选,鉴别出与p53-MDM2抑制剂Nutlin-3a结构不同,但具有类似形状电荷分布的化合物[12]。然后,通过Autodock软件与MDM2蛋白进行分子对接,根据结合能获得打分函数排名前15的化合物,但未用分子药理学实验证实其作用靶标。因此,课题组购买了可售的6个药物(图1)。对这6个药物进行蛋白结合抑制活性实验,以Nutlin-3为阳性对照药,结果见表1。
表 1 蛋白结合抑制活性和体外抗肿瘤活性测试结果
化合物 Ki
(μmol/L)IC50
(μmol/L)U-2OS
(wt-p53)Saos-2
(p53 null)A549
(wt-p53)NCI-H1299
(p53 null)Nutlin-3 0.093 12.2 8.38 2.18 1.97 美芬诺酮 5.79 >100 >100 8.43 >100 盐酸氮䓬斯汀 216.3 6.38 3.80 1.54 4.32 苄普地尔 0.456 2.58 1.56 1.04 1.39 保泰松 155.5 71.31 >100 91.45 >100 阿洛西林 NA >100 >100 >100 >100 盐酸多沙普仑 NA >100 >100 60.68 >100 从表1中可以看出,6个药物中美芬诺酮、盐酸氮䓬斯汀、苄普地尔和保泰松4个药物体现出一定的p53-MDM2蛋白结合抑制活性,其余2个药物无活性。其中,钙离子拮抗剂苄普地尔的Ki值达到0.456 μmol/L,显示出优异的p53-MDM2蛋白结合抑制活性。
为验证苄普地尔是否能抑制p53-MDM2蛋白结合,采用免疫印迹试验测定相关蛋白的表达变化,结果如图2。从图中可以看出,苄普地尔对p53蛋白表达作用相对较小,并且随着苄普地尔浓度上升到10 μmol/L,反而出现下降。但苄普地尔能显著降低MDM2蛋白的表达,而且呈剂量依赖关系,初步说明苄普地尔能明显抑制p53-MDM2蛋白结合。
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课题组选择骨肉瘤(U-2OS、Saos-2)和肺癌(A549、NCI-H1299) 2组细胞株进行了6个药物的体外抗肿瘤活性测试(表1)。从表1中可以看出,苄普地尔对4种细胞株均具有优秀的抗肿瘤活性,其IC50值均低于3 μmol/L,优于阳性对照药Nutlin-3。而美芬诺酮尽管具有中等的p53-MDM2蛋白结合抑制活性(Ki=5.79 μmol/L),但除对A549具有较好的抗肿瘤活性,其余细胞株均未显示出活性。令人意外的是盐酸氮䓬斯汀尽管具有较弱的p53-MDM2蛋白结合抑制活性,但对4种肿瘤细胞株也显示出较好的活性。
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课题组进一步对苄普地尔开展了人肝微粒体中代谢产物研究,结果见表2、图3和图4。发现在经人肝微粒孵化后的样品中除原形药物(M0,m/z 367)外,在保留时间为9.8 min处检测到1个色谱峰,命名为M1,其m/z为383。推测其分子式组成为C24H34N2O2,比原形增加1个O,可能为单氧化代谢产物。在MS/MS扫描质谱图中,由M1获得的主要碎片离子为m/z 312、212、184(图4),其中m/z 312、212比原形的主要碎片离子m/z 296、196,相对分子质量增加16,而碎片184与原形的相同,且未见相对分子质量少18的碎片,推测其为苯环羟基化代谢产物。
表 2 苄普地尔在肝微粒体孵化体系中的代谢产物信息
编号 代谢途径 质荷比 分子式 保留时间(t/min) M0 原形 367 C24H34N2O 11.6 M1 氧化 383 C24H34N2O2 9.8
Discovery of bepridil as a valuable lead compound with potent p53-MDM2 inhibitory activity
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摘要:
目的 采用老药新用药物设计方法,探寻p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂的先导化合物。 方法 通过荧光偏振(FP)法和蛋白印迹试验法,分别测定化合物的p53-MDM2蛋白结合抑制活性和相关蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测试其体外抗肿瘤活性,并且测定人肝微粒体中代谢产物。 结果 发现苄普地尔具有优秀的体外抗肿瘤活性和较强的p53-MDM2蛋白结合抑制活性,能显著降低MDM2蛋白的表达,而且呈剂量依赖性。在人肝微粒体中的代谢产物主要为苯环羟基单氧化代谢产物。 结论 苄普地尔可作为p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂先导化合物,用于后续的结构优化设计研究。 -
关键词:
- 老药新用 /
- 药物设计 /
- 苄普地尔 /
- p53-MDM2蛋白结合抑制剂
Abstract:Objective To find novel lead compounds as p53-MDM2 inhibitors by drug repurposing strategy. Methods The p53-MDM2 inhibitory activities of compounds were determined by FP and western blotting. MTT method was used to determine the in-vitro antitumor activities. The metabolites in human liver microsomes were tested. Results Bepridil showed excellent in-vitro anti-tumor activity and strong p53-MDM2 protein binding inhibitory activity, which can significantly reduce the expression of MDM2 protein in a dose-dependent manner. The metabolites in human liver microsomes are mainly benzene ring hydroxyl mono-oxidation metabolites. Conclusion Bepridil can be used as a lead compound for p53-MDM2 protein binding small molecule inhibitors for subsequent structural optimization design studies. -
Key words:
- new uses of old drugs strategy /
- drug design /
- bepridil /
- p53-MDM2 inhibitor
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表 1 蛋白结合抑制活性和体外抗肿瘤活性测试结果
化合物 Ki
(μmol/L)IC50
(μmol/L)U-2OS
(wt-p53)Saos-2
(p53 null)A549
(wt-p53)NCI-H1299
(p53 null)Nutlin-3 0.093 12.2 8.38 2.18 1.97 美芬诺酮 5.79 >100 >100 8.43 >100 盐酸氮䓬斯汀 216.3 6.38 3.80 1.54 4.32 苄普地尔 0.456 2.58 1.56 1.04 1.39 保泰松 155.5 71.31 >100 91.45 >100 阿洛西林 NA >100 >100 >100 >100 盐酸多沙普仑 NA >100 >100 60.68 >100 表 2 苄普地尔在肝微粒体孵化体系中的代谢产物信息
编号 代谢途径 质荷比 分子式 保留时间(t/min) M0 原形 367 C24H34N2O 11.6 M1 氧化 383 C24H34N2O2 9.8 -
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