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近年来，随着免疫抑制剂的广泛使用和介入手术的增多，深部真菌感染的发病率逐年上升。同时，手术患者的增加，住院天数的增长，也使得院内真菌感染成为急需解决的问题。在治疗真菌感染过程中长周期的给药方式和真菌耐药问题造成了政府和住院患者的医疗支出大幅增加，新的抗真菌药物或者协同抗真菌药物研究迫在眉睫。为了克服真菌的耐药性问题，本课题组一直致力于研究药物联用协同抗耐药真菌的效果。据统计，真菌感染中最常见菌属是念珠菌，而在念珠菌中白念珠菌的占比又高达45%～50%，因此，靶向于白念珠菌的药物研究就显得十分重要[1-6]。2010年，Morales等报道了化合物吩嗪硫酸甲酯具有抗白念珠菌被膜的活性[7]。为了进一步获得具有更强抗真菌活性的先导化合物，我们筛选了以吩嗪为骨架的20余种吩嗪类衍生物，获得了具有协同氟康唑抗真菌活性的化合物吩嗪衍生物-17，本研究为抗耐药真菌联合用药提供了新思路。
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洁净工作台（HPeafe-1200LC(A2)上海力申科学仪器有限公司）；振荡培养箱（HZ-2111K-B江苏太仓市实验设备厂）；微量加样器（Biohit）；小型冷冻离心机（HitachiCT15RE）；蒸汽灭菌锅（KG-SX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO，Japan）；多功能酶标仪（TECAN Infinite M200）；倒置相差显微镜（Amersham Pharmacia AMG EVOS×1）；紫外分光光度计（Amersham Biosciences Μltrospec10）。
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白念珠菌标准菌株SC5314由美国Georgetown大学William A Fonzi教授赠送，临床分离的耐药白念珠菌103和538来自海军军医大学附属长海医院皮肤科，氟康唑（FCZ）由辉瑞公司生产，吩嗪类化合物购自chemdiv化合物库，二甲基亚砜（DMSO）购自博光生物试剂有限公司，酵母提取物、甘露醇、营养肉汤购自BD公司，蛋白胨、葡萄糖、琼脂均购自上海生工生物技术有限公司，RPMI1640购自Gibco公司。
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将保存在SDA固体培养皿的SC5314单克隆菌株转接到1 ml YEPD培养基，30 ℃、200 r/min，培养过夜，使真菌菌株处于指数生长平台期。①洗菌：将活化好的菌株转移到1.5 ml离心管中，用无菌PBS缓冲液洗3次，再用1 ml PBS重悬。②调节浓度：用RPMI1640稀释菌液100倍，使其浓度为（1～5）×106 CFU/ml。再用RPMI1640稀释1000倍，使菌终浓度（1～5）×103 CFU/ml。③制备药敏实验板：取一块96孔板，第1列加入100 μl RPMI 1640液体培养基做空白对照；第2列加200 μl上述菌液，第3～12列分别加入100 μl上述菌液，第2列加吩嗪类衍生物使其终浓度为64 μg/ml，2～11列进行倍比稀释，使得药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每个药都加2个复孔（2行），以减少实验误差，铺好药和菌的96孔板用封条封闭，于30 ℃恒温培养过夜，用酶标仪在λ=630 nm测吸光度（A）值，计算MIC80值。
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菌株活化、洗菌和调菌浓度同前所述，取一块96孔板，第1列加入100 μl RPMI1640/YEPD培养基做空白对照；第12列加入100 μl上述菌液做阳性对照；剩余菌液加入适量氟康唑，使得氟康唑终浓度为2 μg/ml，第2列加入该配制好的菌液200 μl，第3～11列加入该配制好的菌液100 μl，第2列再加入吩嗪类衍生物使其终浓度为64 μg/ml，2～11列进行倍比稀释，使得药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每种药都加2个复孔（2行），以减少实验误差，将铺好药和菌的96孔板用封条封闭，于30 ℃恒温培养过夜，用酶标仪在λ=630 nm处测A值，计算最低抑菌浓度（MIC80）和协同指数（FICI）。
除了用上述耐药白念珠菌103实验外，再更换菌株为538，重复上述实验步骤进行实验。
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过夜活化的白念珠菌SC5314分别用Spider培养液和RPMI1640培养液稀释1 000倍，分别加药使吩嗪衍生物-17终浓度为4 μg/ml、FCZ的终浓度为4 μg/ml以及吩嗪衍生物-17与FCZ的合用（浓度与单药相同），空白对照加入同体积的DMSO，充分混匀，转移至12孔板中，37 ℃，静置培养3 h，倒置显微镜观察菌丝形态。
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通过对吩嗪类24种衍生物的体外抗真菌活性研究发现，吩嗪类化合物单用对白念珠菌没有抗真菌活性，其MIC80均>128 μg/ml。在RPMI1640培养液中，采用临床分离的氟康唑耐药白念珠菌103和538（氟康唑单用时，MIC80>32 μg/ml），考察吩嗪类化合物协同氟康唑的抗真菌活性。结果显示，当吩嗪类化合物与2 μg/ml的氟康唑合用时，0.25～0.5 μg/ml的吩嗪衍生物-12、0.125 μg/ml的吩嗪衍生物-17、1～2 μg/ml的吩嗪衍生物-18协同氟康唑后有明显的抗耐药白念珠菌的活性，结果见表1。而后我们采用棋盘式微量液基稀释法，进一步考察了氟康唑和吩嗪衍生物-12、吩嗪衍生物-17、吩嗪衍生物-18合用时的最低浓度，结果显示吩嗪衍生物-17与氟康唑协同抗白念珠菌菌效果最强，0.0625 μg/ml的吩嗪衍生物-17与1 μg/ml的氟康唑即可完全抑制耐药白念珠菌的生长，协同指数FICI<0.5，说明与氟康唑具有明显的协同作用（表2）。
表 1 吩嗪类衍生物（2 μg/ml）协同氟康唑对氟康唑耐药白念珠菌103MIC80值的测定结果
化合物编号 结构 分离株103MIC80
(μg/ml）分离株538MIC80
(μg/ml)吩嗪-1 >16 >16 吩嗪-2 8 8 吩嗪-3 >16 16 吩嗪-4 >16 >16 吩嗪-5 >16 >16 吩嗪-6 8 8 吩嗪-7 >16 >16 吩嗪-8 16 8 吩嗪-9 >16 >16 吩嗪-10 >16 >16 吩嗪-11 16 16 吩嗪-12 0.5 0.25 吩嗪-13 >16 >16 吩嗪-14 >16 >16 吩嗪-15 >16 >16 吩嗪-16 >16 >16 吩嗪-17 0.125 0.125 吩嗪-18 2 1 吩嗪-19 8 8 吩嗪-20 16 8 吩嗪-21 16 16 吩嗪-22 >16 >16 吩嗪-23 >16 >16 吩嗪-24 >16 16 表 2 吩嗪类衍生物与氟康唑单用及合用对氟康唑耐药白念珠菌538的MIC80值和FICI值的测定结果
化合物编号 单用[MIC80（μg/ml）] 合用[MIC80（μg/ml）] FICI 协同方式 吩嗪类衍生物 氟康唑 吩嗪类衍生物 氟康唑 吩嗪类衍生物-12 >64 >32 0.25 1.0 0.034 协同 吩嗪类衍生物-17 >64 >32 0.0625 1.0 0.032 协同 吩嗪类衍生物-18 >64 >32 0.5 2.0 0.070 协同 -
为了进一步考察吩嗪类衍生物-17的体外抗菌活性，我们考察了其对菌丝生长的抑制作用。结果表明，在RPMI1640诱导菌丝形成的过程中，吩嗪衍生物-17与氟康唑合用对菌丝的生长抑制不明显，但在Spider培养基中，两药合用对菌丝的形成有明显抑制作用（图1）。
图 1 吩嗪类衍生物-17抑制白念珠菌的菌丝形成
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近年来，随着免疫抑制剂的广泛用、手术介入和免疫缺陷患者的增多，系统性真菌感染的发病率逐年攀升。但抗真菌药物的研发进展缓慢，现有的几类抗真菌药物在长期使用后也逐渐出现了耐药性。为克服临床真菌感染的问题，研发新的抗真菌药物意义重大。本课题组长期致力于协同抗耐药真菌研究，期望筛选获得具有协同抗耐药真菌活性的化合物，进而达到降低给药剂量，提高抗菌能力的目的，为临床抗真菌治疗提供新的策略。本研究前期通过体外筛选吩嗪类化合物的抗真菌活性，发现吩嗪类化合物单药使用时没有抗真菌活性，但是吩嗪衍生物-12、-17、-18与氟康唑合用有显著的协同抗真菌活性，这一研究结果有望为抗真菌药物研发提供新的思路。该研究尚未探讨吩嗪类衍生物的协同抗耐药真菌机制，后续仍需进一步深入研究。
Study on the antifungal activity of phenazine derivatives
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摘要:
目的 研究吩嗪类衍生物的抗真菌活性。 方法 利用微量液基稀释法考察吩嗪类衍生物的体外抗真菌活性；利用棋盘式微量稀释法检测吩嗪类衍生物与氟康唑合用对常见临床耐药菌的抗真菌活性；在菌丝诱导条件下考察吩嗪衍生物对白念珠菌菌丝形成的抑制效果。 结果 吩嗪类衍生物单用对临床常见条件致病真菌白念珠菌没有明显抗真菌活性；吩嗪衍生物-17与氟康唑合用有显著抗白念珠菌活性；吩嗪衍生物-17与氟康唑合用可以明显抑制白念珠菌菌丝生长。 结论 筛选获得了与氟康唑合用具有抗真菌活性的吩嗪类衍生物-17，为抗真菌药物研发和克服真菌耐药提供了新思路。 Abstract:Objective To study the antifungal activity of phenazines derivatives. Methods The anti-fungal activity of phenazine compounds was evaluated initially with micro-liquid dilution. No significant antifungal activity against Candida albicans was found. Then, with the combination of phenazine compounds and fluconazole, the anti-fungal activity against fluconazole-resistant C. albicans was detected. Results The phenazine-17 had significant antifungal activity when combined with fluconazole through the inhibition of hyphae formation. Conclusion This study provides a new idea for the development of antifungal drugs and the solution of antifungal drug resistance. -
Key words:
- phenazine derivatives /
- Candida albicans /
- antifungal activity /
- hyphae formation
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1. GPX4是重要的铁死亡调控蛋白
铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性，区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬新型细胞程序性死亡方式[1]。细胞中铁过量时，可通过芬顿反应产生羟自由基，这些自由基直接会与细胞膜中多不饱和脂肪酸反应，产生大量脂质活性氧，从而诱导细胞死亡。铁死亡在细胞内受到多种代谢途径调控。其中就包括一个重要的抗氧化系统——谷胱甘肽系统。谷胱甘肽可以在还原态（G-SH）和氧化态（G-S-S-G）之间循环，使其能够参与细胞内的氧化还原生物化学反应。正常情况下，细胞内谷胱甘肽以还原态为主[2]。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），分子量约为19 000，由170个氨基酸组成，是含硒GPx家族第4位成员。目前已在哺乳动物中发现GPX1-GPX8等多个GPx家族成员，然而仅有GPX4表现出对于膜脂过氧化氢产物的清除能力，这与GPX4独特的氨基酸序列以及空间结构相关。GPX4能够以谷胱甘肽或其他硫氧化还原蛋白作为电子供体，将氢过氧化物（R-OOH）还原为对应的醇（R-OH），从而限制铁离子依赖的毒性自由基生成，抑制脂质过氧化，使得细胞膜免受氧化损伤，是铁死亡的重要调节蛋白[3]。
近年来，大量研究表明通过抑制GPX4蛋白来诱导细胞发生铁死亡，在克服肿瘤细胞耐药、治疗脂质过氧化相关神经退行性疾病等方面极具前景[4]。本文介绍了GPX4蛋白结构及其功能，并重点综述了目前GPX4小分子抑制剂最新研究进展，为开发基于GXP4蛋白功能抑制的铁死亡诱导剂提供研究基础。
2. GPX4的蛋白结构及功能
GPX4是一种由170个氨基酸组成的单体蛋白质，显示出典型的硫氧还蛋白基序，由四个定位在蛋白质表面α螺旋和七条β链组成。GPX4含有在其他GPX硒酶中存在的保守催化活性四分体，由硒代半胱氨酸（Sec46）、谷氨酰胺（Gln81）、色氨酸（Trp136）和天冬酰胺（Asn137）组成，见图1A。Sec46，Gln81和Trp136三个氨基酸残基之间可以发生氢键相互作用和静电相互作用，这种相对牢固的空间排列对GPX4催化活性至关重要[5]。其中，Sec46是催化活性必需的，Sec46突变为半胱氨酸会使GPX4催化活性大幅降低。Sec46催化氧化还原反应是由3个连续反应组成的循环反应，见图1B：第一步，过氧化物与离子化的GPX4反应，产生GPX4硒酸衍生物；第二步，GPX4硒酸衍生物与还原型谷胱甘肽反应，还原型谷胱甘肽通过硫与GPX4的硒共价结合形成GPX4-谷胱甘肽复合物；催化循环最后一步，GPX4-谷胱甘肽复合物通过与另一个还原型谷胱甘肽反应分离为GPX4和一分子氧化型谷胱甘肽[2]。与其他GPx同工酶相比，GPX4表现出3种特性：一是该酶具有广泛的底物，即使是在高度结构化脂质蛋白组装体中，如生物膜和脂蛋白中，GPX4也能够减少复杂的脂质过氧化物；二是GPX4不仅可以将还原型谷胱甘肽作为氢供体，也可以接受蛋白质硫醇和其他还原等价蛋白；三是GPX4除了以单体形式存在以外，在精子细胞中还能以蛋白质聚集体的形式存在，这一特性影响了精子发育过程中线粒体膜的形成[6]。
GPX4主要功能是利用谷胱甘肽作为辅助因子来降低脂质过氧化，从而保护细胞膜的完整性。GPX4作为一种关键的抗过氧化物酶，可还原膜和脂蛋白中的磷脂氢过氧化物（PLOOH）。GPX4不仅可以利用谷胱甘肽消除毒性PLOOH，还可以通过减少胸腺嘧啶氢过氧化物、胆固醇氢过氧化物和脂肪酸氢过氧化物，保护细胞免受氧化损伤。除了还原氢过氧化物以外，GPX4还具有抑制花生四烯酸脂氧合酶（ALOX）活性的功能[6]。此外，与其他GPx家族成员相比，GPX4另一个独特功能是调节哺乳动物的胚胎发育[2]：在GPX4基因敲除小鼠模型中，小鼠胚胎在妊娠中期就在子宫内死亡，与此相反，GPX1、GPX2或GPX3敲除小鼠不会产生胚胎致死性。
3. GPX4小分子抑制剂研究进展
3.1 氯乙酰胺弹头共价抑制剂
迄今为止，已报道的GPX4小分子抑制剂大部分都包含与催化晒代半胱氨酸发生共价结合的反应弹头，其中最早发现的抑制剂就是以氯乙酰胺为共价结合弹头的化合物。RSL3（图2，化合物1）是最具有代表性的GPX4小分子抑制剂，最初被Yang[7]等人从47725种化合物中筛选出来，发现其具有抑制RAS突变肿瘤细胞增殖的效果。该团队发现RSL3诱导的细胞死亡与凋亡、坏死和自噬均不同。该研究团队进一步开展研究[8]，通过化学蛋白质组学来筛选鉴定RSL3靶标蛋白，确定了GPX4是其作用的靶蛋白，并发现RSL3氯乙酰胺部分对其活性至关重要，即1.0 μmol/L浓度下，GPX4抑制率为（17.08 ± 0.40）%，更换为其他亲电弹头取代时，会导致活性丧失。Hengrui团队从晶体结构角度进一步阐述了GPX4和RSL3的结合方式，发现RSL3结合位点是半胱氨酸66（Cys66）而不是GPX4的催化活性位点Sec46[9]。
Michel团队[10]对
303282 种化合物进行了高通量筛选，得到了对RAS突变细胞具有优秀抑制活性的化合物ML162（图2，化合物2）。该化合物同样含有氯乙酰胺基团，与RSL3相比显示出更好抑制率，其在1.0 μmol/L浓度下，GPX4抑制率为（27.0±0.9）%。Chen的团队[11]在ML162和RSL3的基础上，设计得到了一系列新型GPX4共价抑制剂，其中，化合物C18（图2，化合物3）表现出优于RSL3和ML162的GPX4抑制率[1.0 μmol/L浓度下，GPX抑制率为（98.8±1.5）%]，能抑制三阴性乳腺癌细胞生长（IC50=0.012 μmol/L）。Xu的团队[12]以RSL3多环的刚性骨架为切入点，以RSL3为先导化合物，将分子骨架中的哌啶环打开，并基于此继续进行结构优化，设计合成了一系列衍生物（图3）。其中化合物26a（图2，化合物4）表现出优秀的GPX4蛋白抑制活性[1.0 μmol/L浓度下，GPX抑制率为（71.7±1.7）%]，能诱导三阴性乳腺癌细胞死亡（IC50=0.78 μmol/L）。3.2 掩蔽氧化腈共价抑制剂
目前报道GPX4抑制剂主要是通过氯乙酰胺基团与GPX4进行共价结合来抑制其活性。然而，这些化合物中的氯乙酰胺基团不仅与GPX4的半胱氨酸残基共价结合，还可能与其他氨基酸残基发生结合，从而降低了它们对GPX4的特异性。鉴于此，研究人员正致力于寻找能够更特异性地与GPX4结合的化学结构。Michel[10]团队发现，不含亲电弹头的化合物ML210（图4，化合物5）在1.0 μmol/L浓度下对GPX4的抑制率高达（34.8±0.5）%。Eaton[13]等研究者揭示了ML210的作用机制（图4）：ML210中的硝基异噁唑基团在细胞内转化为氧化腈基团，进而与GPX4中的半胱氨酸残基形成共价结合。同样的机制也在化合物二酰基呋咱（图4，化合物6）中观察到[14]，其结构中的噁二唑基团能在细胞内转化为氧化腈基团，从而抑制GPX4，1.0 μmol/L浓度下抑制率为（34.8±0.5）%。不同于RSL3和ML162这类作用于多种蛋白质的抑制剂，ML210和二酰基呋咱可专一性地作用于GPX4，说明掩蔽腈氧化物是一种高特异性的GPX4靶向结构。
3.3 间接抑制剂
除了直接与GPX4发生共价结合外，某些化合物可通过非直接途径抑制GPX4蛋白。例如Shimada[15]团队从
3169 种化合物中筛选出FIN56（图5，化合物7），该化合物并不具有亲电弹头，但能导致GPX4失活。FIN56会增加细胞内活性氧的含量，但其作用速度明显慢于直接作用于GPX4的抑制剂RSL3。研究表明，经FIN56处理的细胞中GPX4丰度显著下降，但是其转录水平却显著增加，这种现象在RSL3处理的细胞中并未观察到。因此，研究者推测FIN56可能通过促进GPX4的降解来发挥作用，但具体机制尚不明确。另一种由Micheal[16]报道的非共价GPX4抑制剂是FINO2（图5，化合物8），其结构中的过氧键能直接氧化亚铁离子，导致GPX4失活。这些分子的发现为GPX4小分子抑制剂的开发提供了新的视角。4. 总结和展望
近年来，随着对铁死亡相关研究的进一步深入，人们发现铁死亡与多种癌症以及神经性疾病等病理过程相关，为治疗这些疾病提供了新的解决策略。在铁死亡的发生过程中，GPX4是关键的调控因子，它能够分解脂质过氧化物，维持脂质双分子层的稳定，反之，抑制GPX4可以诱导细胞发生铁死亡。目前，大多数已报道的GPX4小分子抑制剂为含有氯乙酰胺基团的共价抑制剂，这些化合物由于其强大的亲电性，可以与多种蛋白质结合，从而导致它们与GPX4结合的特异性不高。为解决这一问题，研究者们设计了含掩蔽氧化腈弹头的化合物，这种设计旨在通过减少细胞与高亲电性弹头的接触时间，提高靶向GPX4的特异性。这两类GPX4小分子抑制剂虽然具有较好的蛋白及细胞水平活性，但尚无候选分子进入临床试验。此外，还发现了一些非共价的GPX4小分子抑制剂，这些分子显示出抑制GPX4活性并能诱导细胞发生铁死亡，但其与GPX4具体的作用机制尚不清楚。因此，无论是基于关键调控蛋白GPX4探索高特异性的共价抑制剂，还是揭示GPX4非共价抑制剂的作用机制，都是铁死亡相关研究领域的热点问题，克服这些挑战是未来铁死亡诱导剂进入临床应用的关键一步。
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图 1 吩嗪类衍生物-17抑制白念珠菌的菌丝形成
注：白念珠菌在37 ℃的RPMI 1640或Spider培养基中诱导3 h，氟康唑和吩嗪衍生物-17加入的浓度均为4 μg/ml。
表 1 吩嗪类衍生物（2 μg/ml）协同氟康唑对氟康唑耐药白念珠菌103MIC80值的测定结果
化合物编号 结构 分离株103MIC80
(μg/ml）分离株538MIC80
(μg/ml)吩嗪-1 >16 >16 吩嗪-2 8 8 吩嗪-3 >16 16 吩嗪-4 >16 >16 吩嗪-5 >16 >16 吩嗪-6 8 8 吩嗪-7 >16 >16 吩嗪-8 16 8 吩嗪-9 >16 >16 吩嗪-10 >16 >16 吩嗪-11 16 16 吩嗪-12 0.5 0.25 吩嗪-13 >16 >16 吩嗪-14 >16 >16 吩嗪-15 >16 >16 吩嗪-16 >16 >16 吩嗪-17 0.125 0.125 吩嗪-18 2 1 吩嗪-19 8 8 吩嗪-20 16 8 吩嗪-21 16 16 吩嗪-22 >16 >16 吩嗪-23 >16 >16 吩嗪-24 >16 16 
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表 2 吩嗪类衍生物与氟康唑单用及合用对氟康唑耐药白念珠菌538的MIC80值和FICI值的测定结果
化合物编号 单用[MIC80（μg/ml）] 合用[MIC80（μg/ml）] FICI 协同方式 吩嗪类衍生物 氟康唑 吩嗪类衍生物 氟康唑 吩嗪类衍生物-12 >64 >32 0.25 1.0 0.034 协同 吩嗪类衍生物-17 >64 >32 0.0625 1.0 0.032 协同 吩嗪类衍生物-18 >64 >32 0.5 2.0 0.070 协同
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