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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
图 1 化合物1 ~ 8的化学结构式
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菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
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Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
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取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
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乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
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化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。 -
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
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本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
Study on chemical constituents of sponge-associated Aspergillus terreus
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摘要:
目的 对海绵共附生真菌土曲霉Aspergillus terreus中的化学成分进行研究。 方法 采用葡聚糖凝胶柱色谱、硅胶柱色谱和高效液相色谱等手段分离纯化；通过波谱数据鉴定化合物结构；采用PNPG法和DPPH法分别对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。 结果 从土曲霉Aspergillus terreus中分离得到8个化合物，分别鉴定为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido) benzamido) benzoate ( 1 )、terrelumamide A ( 2 )、emeheterone ( 3 )、(8R,9S)-dihydroisoflavipucine ( 4 )、(8S,9S)-dihydroisoflavipucine ( 5 )、cyclo(S-Pro-S-Phe) ( 6 )、brevianamide F ( 7 )、terrein ( 8 )。活性测试结果表明，化合物 3 具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。 结论 化合物 3 、 4 、 5 、 7 为首次从土曲霉Aspergillus terreus中分离得到。 -
关键词:
- 土曲霉 /
- 化学成分 /
- α-葡萄糖苷酶抑制活性
Abstract:Objective To study the chemical constituents of Aspergillus terreus from sponge epiphytic fungal. Methods Sephadex LH-20 column chromatography, silica gel column chromatography and high performance liquid chroma-tography were used to separate and purify the compounds. The structures of compounds were identified by spectroscopic data. The α-glucosidase inhibitory activity and antioxidant activity of the compounds were tested by PNPG and DPPH methods, respectively. Results Eight compounds were isolated from Aspergillus terreus and identified as methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido) benzamido) benzoate ( 1 ), terrelumamide A ( 2) , emeheterone ( 3 ), (8R,9S)-dihydroisoflavipucine ( 4 ), (8S,9S)-dihydroisoflavipucine ( 5 ), cyclo(S-Pro-S-Phe) ( 6 ), brevianamide F ( 7 ), terrein ( 8 ). Compound 3 showed strong inhibitory activity against α-glucosidase and the IC50 value was 14.28 μmol/L. Conclusion Compounds 3 , 4 , 5 , and 7 were obtained from Aspergillus terreus for the first time. -
静脉用药调配中心（pharmacy intravenous ad-mixture services, PIVAS）是专为临床提供静脉用药调配服务的药品调剂部门。随着PIVAS业务的发展，人员配置、时间分配等诸多管理话题备受关注[1-4]。通常资源配置、时间管理及工作方式等管理决策的落地均需结合工作量情况，这是因为工作量不仅可用于绩效考核，也可用于衡量需求与供给是否匹配，是调整工作强度和实现最佳调配实践过程的关键组成部分，并且对静脉药物调配服务的提供有着深远的影响（诸如人员倦怠、供应短缺导致治疗延误、调配差错等不期望的结局）[5]。因而，客观选择能够代表工作量的关键指标进行准确量化及特征分析，对PIVAS工作模式的制定和优化具有重要意义。
据上海市药学会医院药学专委会PIVAS学组2022年统计数据显示，以长期医嘱（执行两次以上的定期医嘱）为调配工作类型的上海医疗机构高达97.4%，其中31.6%的机构仅接收执行此项工作[6]。因此，客观上存在管理决策匹配至长期医嘱工作的需求，以达到解决临床用药需求、保证准点交付及提高服务质量的目的。然而，现阶段PIVAS管理决策的匹配多依赖于实操经验，缺乏可靠的理论依据，主要原因是长期医嘱工作量特征没有得到细致量化的分析并在文献中进行报道。
按日期汇总的PIVAS长期医嘱工作量是典型的时间序列，而时间序列分析法目前较为成熟，已在金融、气象、医学等领域得到广泛应用[7]。该技术不仅可通过分解法识别变量存在的周期性、循环性、趋势性等变化特征，还可根据历史数据特征进行回归分析或机器学习等模型的构建及预测[8]。因此，本研究借助时间序列分析法对PIVAS长期医嘱工作量数据进行特征分析及预测，以期为PIVAS工作模式的制定提供参考。
1. 资料与方法
1.1 数据来源
数据来自复旦大学附属中山医院东院区PIVAS，选取2020年7月至2021年6月的长期医嘱日工作量整年周期数据，进行时间序列分析及预测模型构建，选取2021年7月的数据用于模型预测准确度的验证。
1.2 数据波动性分析
利用SPSS 25.0软件对获得的工作量数据绘制时间序列图。通过局部加权回归拟合函数（loess function）对序列进行季节和趋势分解[9]，初步描述分析数据的长期趋势、季节波动、循环波动、不规则波动等重要特征。
1.3 预测模型构建及评价方法
基于数据的趋势性、季节性或平稳性假设，通过制定一个数学模型来捕捉现有的动态关系，理解数据生成过程，并可能在提出的假设限制内进行预测。传统的建模方法包括指数平滑、移动平均、多元线性回归和自回归综合移动平均等，可利用 SPSS 25.0软件直接进行统计分析以识别适合的建模方法。
1.3.1 数据预处理
预测模型的构建方法大多需要序列平稳假设的前提，即序列的均值和方差等基本统计量随时间保持不变。采用Eviews 11对时间序列数据进行单位根检验（ADF检验），以观察平稳性，若检验为非平稳序列则需进行差分运算，转化为平稳时间序列。
1.3.2 模型构建方法
应用SPSS 25.0软件中的“时间序列建模器”进行建模。根据序列的波动特征、自相关系数（ACF）及偏自相关系数（PACF）识别模型，通过试误法进行模型参数估计。以Ljung-Box统计量检验残差是否符合常态分配的基本假设，P>0.05说明模型构建成功；当拟合度（平稳R2和R2）>0.05、残差的ACF和PACF图无规律及拟合值与实际值的平均绝对误差（MAPE）<10%时，说明模型拟合效果好。
1.3.3 模型预测效果评价
利用所构建的时间序列模型进行样本外预测，并与实际值比较，通过相对误差百分比验证模型的预测能力。相对误差百分比(δ)= (预测值−实际值)/实际值×100％，δ<10%时说明模型预测有效。
2. 结果
2.1 波动特征
利用复旦大学附属中山医院东院区2020年7月至2021年6月PIVAS长期医嘱工作量数据，绘制原始序列图并进行时间序列分解。图1A为原始序列，由365个数据集成，工作量日均值为16188.55个，且整年数据基本维持在16000振幅波动，但极值（8326~21302）间相差约为2.5倍，说明PIVAS长期医嘱工作量的波动存在规律性及异常性等特征。时间序列分解结果表明：序列具有周期性、缓慢上升趋势及不规则变动等特征。图1B为季节因子序列，说明长期医嘱工作量数据遵循以7 d为周期的变动规律，单周期波动总体存在周一（谷值）至周六（峰值），先上升而后下降的模式；图1C为循环趋势序列，提示不规则变动均发生在国家法定节假日期间，且假期越长序列的不规则性越明显；工作量总体呈现缓慢上升趋势且在节假日前迎来高峰。
2.2 PIVAS长期医嘱工作量时间序列预测模型构建
2.2.1 时间序列平稳性检验
对PIVAS长期医嘱日工作量时间序列进行单位根ADF检验，检验结果表明：ADF统计值为−5.922 144，小于1%（−3.448 518）、5%（−2.869 442）、10%（−2.571 047）显著性水平的临界值（P<0.000 01），说明工作量时间序列不存在单位根，为平稳序列，符合时间序列模型构建要求。
2.2.2 模型评价
根据原始序列图的波动特征，将趋势及季节因素均纳入考虑的简单季节性模型、温特斯加法模型或温特斯乘法模型建模，最终选取温特斯乘法模型。该模型Ljung-Box统计量的显著性值大于0.05（P=0.060），表明模型正确，说明所观测的序列中不存在模型无法解释的结构（图2）。拟合参数平稳R2=0.549、R2=0.777、残差的ACF和PACF图无规律性（图2A）；工作量拟合图拟合值波动趋势与实际值基本吻合（图2B），且 MAPE=4.45%（<10%），说明模型拟合效果好。
2.2.3 模型预测效果评价
工作量预测结果的波动特征呈现明显的周期性特征（图2B）。表1显示，2021年7月长期医嘱工作量的短期预测误差处于10%之内，且平均相对偏差为3.81%，说明模型有效。
表 1 2021年7月静脉用药调配中心实际工作量与预测工作量的比较日期 实际工作量(袋) 预测工作量(袋) 相对误差(%) 2021-07-01 17467 18161 3.97 2021-07-02 19722 19495 −1.15 2021-07-03 18732 20386 8.83 2021-07-04 17317 17890 3.31 2021-07-05 15412 15962 3.57 2021-07-06 16238 16726 3.01 2021-07-07 18796 17942 −4.54 2021-07-08 16766 18197 8.54 2021-07-09 20154 19534 −3.08 2021-07-10 18697 20427 9.25 2021-07-11 17521 17926 2.31 2021-07-12 15295 15994 4.57 2021-07-13 16088 16759 4.17 2021-07-14 17495 17978 2.76 2021-07-15 17968 18233 1.47 2021-07-16 20266 19573 −3.42 2021-07-17 19986 20468 2.41 2021-07-18 17335 17962 3.62 2021-07-19 14618 16026 9.63 2021-07-20 16982 16793 −1.11 2021-07-21 16879 18014 6.72 2021-07-22 18567 18270 −1.60 2021-07-23 20632 19612 −4.94 2021-07-24 20689 20508 −0.87 2021-07-25 16998 17997 5.88 2021-07-26 16086 16058 −0.17 2021-07-27 16675 16826 0.91 2021-07-28 17929 18049 0.67 2021-07-29 17634 18306 3.81 2021-07-30 20090 19651 −2.19 2021-07-31 21755 20549 −5.54 3. 讨论
前期通过文献查阅梳理出可以代表工作量的常见指标[10-12]，主要包括“日调配时间”、“日输液袋量”、“日用药支数”及“日注射剂总量”。通过相关性分析（表2）发现，指标间均存在显著正相关，说明指标间可能存在某种联系，一定程度均可以代表工作量。尽管按输液量（袋数）计算的日调配量是现今PIVAS工作量评价共识[12]，但该指标更适用于周转过程的统计，并不能较好体现输液制备过程的工作难易程度。此外，“日调配时间”指标统计过程的规范化程度，以及“日用药支数”指标忽略大容量注射剂（输液）统计导致的大容量注射剂工作量缺失，均可能引发工作量特征量化的准确性争议。因此，基于指标参数获取的准确性、PIVAS长期医嘱工作结构、过程及结果的综合考虑，本研究最终选择“日注射剂总量”（即每日注射剂总量，包含大容量注射剂）作为长期医嘱工作量指标。该指标参数不仅可直接从医院信息系统（HIS系统）获得，而且一定程度体现了工作强度及药品使用情况，有助于建立管理和PIVAS医嘱工作量之间的统计关联。
表 2 主要指标的相关系数矩阵（n=365）变量 均值 标准差 日调配
时间
（min）日输液量
（袋）日用药量
（支）日调配时间
(min)3045.96 399.749 日输液量
(袋)3087.49 312.444 0.908** 日用药量
(支)13101.06 1775.484 0.839** 0.879** 日注射剂
总量(个)16188.55 2055.580 0.863** 0.911** 0.997** 注：**P<0.01。 研究发现长期医嘱工作量波动具有明显的周期性、受节假日因素影响的不规则变动以及不明显的缓慢增长趋势等特征。有意思的是，多项研究证实门急诊日诊量波动具有同样的波动特征[13-14]，说明医院工作模式可能是影响医疗机构内日工作量波动的关键因素。需要注意的是，PIVAS药学服务在医疗机构中属于下游服务节点，存在滞后性，从而导致工作量波动特征存在周一谷值和周六峰值等现象。此外，波动性还可能受临床患者住院时间的主观因素影响，包括入院期、出院期、床位周转率、化疗周期以及患者手术择期选择等因素[15]。后续有必要采用相关性分析等手段进一步验证假设，从而建立与临床数据间的联系，以便更好地为临床服务。随后课题组将波动特征规律运用到PIVAS运营管理中，制订了一些措施，取得较好成效。如：（1）周六及节假日初期充足准备，中后期直至工作日来临适当减少，一旦进入工作日周期又逐步增加的资源配备；（2）通过周排班模式合理搭配、均衡人力配置原则来统筹协调人力资源；（3）每周周一盘点，周二物资采购，周五补充，来保障物资供应以应对周内工作量攀升压力。
简单季节模型、温特斯乘法模型均能提供准确预测，基于贝叶斯信息准则最小原则选择温特斯乘法模型。温斯特乘法模型具有实践轻松简单、高预测精度的优点，然而仍存在一定的局限性，体现在其主要通过提取时间序列中季节变动及长期趋势因素建模，对于元旦、春节等节假日信息提取不足，从而可能降低预测值的精确度。导致这一结果的根本原因是节假日的时间跨度不明确，后期将收集更多长期医嘱工作量数据以便丰富数据，考虑构建长期记忆模型以便将元旦等节假日因素纳入模型中，从而使预测更精准。
综上所述，本研究所采用的时间序列分析法为科学分析与预测PIVAS长期医嘱工作量变化提供了思路，该方法实现简单，可行性强，准确度高，对药房管理有一定指导和实践意义。然而，真实世界中的数据存在固有的复杂性，不存在适用于任何环境的通用模型，如受天气或流感爆发等因素影响时，可进行及时的短期分析以实现更精确的近期预测。
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