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随着人口老龄化进程加快,以脑、脊髓结构或功能损伤导致的中枢神经系统(CNS)疾病的发病率和病死率逐年上升[1]。尽管对CNS疾病病因的认识已有重大进展,但是新药研发进程依旧进展缓慢,主要原因是CNS疾病发病机制复杂,以及在药物研发阶段缺少可靠有效的评价手段[2]。随着系统生物学技术的不断发展,1999年Nicholson等[3]提出的代谢组学通过研究生物体受到外界刺激或基因缺陷所导致的代谢终产物的变化情况,为研究疾病的发病机制和药物疗效评估提供了一种新手段。来源于患者或疾病动物模型的生物体样本,如血液、尿液、组织提取液等的代谢组学研究是目前的主要研究方向,但是实验研究需要大量样本数据支持,且受到伦理以及生物体内外混杂因素的影响,具有一定的局限性。细胞是构成生物体结构和功能的基本单位,体外细胞模型可建立单一症状的疾病模型、具有可控性强、有利于进行大规模药物筛选等特点而备受研究人员青睐。细胞代谢组学是以细胞为研究对象,通过现代分析方法监测细胞反应及药物作用于细胞后的代谢变化,在探寻CNS疾病的病理生理机制及治疗干预效果中展现出巨大潜力[4]。本文拟从细胞代谢组学的研究流程及其在中枢神经系统疾病中的应用进行综述,以期为从细胞层面探索中枢神经系统疾病发病机制和新药研发提供参考。
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CNS疾病影响着全球数百万患者的生命健康,其发病机制复杂,涉及神经细胞凋亡、神经炎症、氧化应激、兴奋性损伤等多种病理特征,给疾病的早期诊断和预后评估带来了很大的困难。构建单一病理状态的体外细胞模型,可以进行大规模的靶向研究和药物筛选,大大缩短了新药研发时间[26]。尽管已有各种类型的CNS疾病体外细胞模型,但其中只有少数被用于代谢组学研究。随着细胞代谢组学在探索CNS疾病发病机制以及药物作用特点中的作用日益突出,越来越多潜在的生物标志物被发现。表1归纳了2015年以来有关细胞代谢组学在CNS疾病研究的一些应用实例,包括常见CNS疾病相应的细胞模型构建、细胞代谢组学分析手段、差异代谢物筛选、通路分析及药物干预结果等。
表 1 细胞代谢组学在中枢神经系统疾病药物研究中的应用
疾病 研究对象 研究药物 检测手段 主要研究结果 参考文献 阿尔茨海默病 PC12细胞
(Aβ25~35)柚皮苷 GC-MS 筛选出甘氨酸、谷氨酸等27种AD差异代谢物,影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢及脂质代谢等代谢通路 [27] 脑微血管内皮细胞(Aβ1~42) 丹参 UHPLC-QTOF- MS 发现了33个差异代谢物,涉及精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等多条代谢通路 [28] SH-SY5Y细胞
(冈田酸)丹参、知母 UHPLC-QTOF- MS 发现了色氨酸、苯丙氨酸等45个潜在AD生物标志物,涉及12条代谢通路,筛选出与丹参相关的30种差异代谢物,与知母相关的7种差异代谢物 [29] SH-SY5Y细胞
(谷氨酸)人参皂苷 Rb1 1H NMR 发现谷氨酸、牛磺酸等7种差异代谢物,涉及5条不同的代谢通路 [30] 帕金森病 SH‐SY5Y细胞
(MPP+)胶质细胞源性神经营养因子 LC‐MS/MS 三酰甘油、磷脂酰胆碱等多种脂质代谢物受到影响 [31] SH-SY5Y细胞
(6-OHDA)花茶 UPLC-TOF-MS 发现多种与神经保护作用相关的代谢物 [32] SH-SY5Y细胞
(A53T基因突变)L-天冬酰胺酶 GC-MS/MS 可以调节谷氨酰胺代谢起到神经保护作用 [33] 抑郁症 PC12细胞
(皮质酮)阿魏酸 UPLC-QTOF-MS 发现24个差异代谢物,涉及氨基酸代谢、能量代谢和甘油磷脂代谢等代谢通路 [34] PC12细胞
(皮质酮)甘草苷 LC-MS 鉴定出谷氨酸、谷胱甘肽等11种潜在差异代谢物,涉及8条不同的代谢通路 [35] PC12细胞
(皮质酮)香附 UPLC-Q-TOF-MS 发现鞘磷脂、甘油磷脂等11种潜在差异代谢物 [36] PC12细胞 氯胺酮、羟基去甲氯胺酮对映体 GC-MS和CE-MS 发现甘油酸盐、柠檬酸盐、亮氨酸等49种潜在生物标志物 [37] 星形胶质细胞 氟西汀 1H NMR 发现17种潜在生物标志物,涉及脂质和氨基酸代谢通路 [38] 星形胶质细胞 文拉法辛 1H NMR 发现赖氨酸、酪氨酸、谷氨酸等31 种涉及能量、氨基酸和脂质代谢的差异代谢物 [39] -
阿尔茨海默病(AD)是一种常见于老年人的神经退行性疾病,临床表现为记忆力减退、认知和交流功能障碍[40]。常用的AD细胞模型有:β淀粉样蛋白(Aβ)诱导神经毒性模型、Tau蛋白异常磷酸化模型、氧化应激模型和基因转染模型[41]。Aβ聚集沉积易使细胞产生突触受损、线粒体功能障碍以及促进Tau蛋白病理化,当前AD防治的研究热点也集中于Aβ[42]。Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经分泌酶水解产生,APP的异常突变与AD的发展密切相关,Xiong等[43]对APP过表达的转基因(N2a/APP695swe)细胞用作AD体外模型的可行性进行验证,并将其应用于缬氨霉素改善AD的作用机制研究,GC-MS结果显示,缬氨霉素作用N2a/APP695swe细胞3 h后Aβ1~42和Aβ1~40水平降低,此时,三磷酸腺苷(ATP)水平和柠檬酸、苹果酸、丙酮酸等ATP相关代谢产物显著增加。但是6~12 h其ATP代谢产物却呈现水平下降趋势,提示缬氨霉素的作用时间应加以控制,才能有效促进ATP产生,起到改善AD的作用。有研究指出载脂蛋白E(APOE)不同亚型携带者患AD的风险不尽相同,可能与影响大脑葡萄糖摄取有关。为了解构成APOE相关遗传风险的分子机制,Williams等[44]采用稳定同位素示踪技术探究APOE中3种亚型基因产生的星形胶质细胞葡萄糖代谢差异,结果显示,相较于E2和E3,受E4影响的星形胶质细胞葡萄糖摄取受损,相应的糖代谢、三羧酸循环以及戊糖磷酸途径发生变化,谷胱甘肽合成增加,详见图2所示。与人类APOE表达E4基因的小鼠模型的研究结果相印证[45],证实了AD发病与遗传基因的相关性。为深入了解E4和代谢损伤对大脑影响的生物学基础,进一步阐明AD的发病机制提供了科学依据。
图 2 不同亚型的载脂蛋白E对星形胶质细胞葡萄糖代谢的影响[44]
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帕金森病(PD)为第二大中枢神经退行性疾病,患者常出现运动迟缓、静止性震颤和强直等症状。PD 是一种由遗传、环境和生活方式等多因素共同作用的疾病,其病理特征表现为黑质多巴胺能神经元损伤丢失和α-突触核蛋白聚集[46]。神经毒素如百草枯、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(MPP+)可诱导细胞多巴胺能神经元变性死亡,从而产生类似帕金森的病理特征,所建立的细胞模型可操作性强、重复性好,是目前最常用的PD细胞造模方法。Lei等[47]采用NMR与直接输注电喷雾电离质谱(DI-ESI-MS)联用的代谢组学方法探究百草枯诱导SH-SY5Y细胞产生的代谢谱变化,结果显示,磷酸戊糖途径中6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等代谢物增加,糖酵解与TCA 循环受到抑制。Xicoy等[48]运用LC-MS法研究6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的脂类代谢变化,结果发现除了磷脂酰丝氨酸水平降低外,磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和胆固醇水平变化情况均与PD患者血浆代谢组学结果相同[49]。进一步探究降胆固醇他汀类药物对该PD模型的神经保护作用,发现他汀类药物未展现相应的保护作用,反而是低剂量的胆固醇使SH-SY5Y细胞免受6-OHDA毒性,提示该细胞模型不适用于胆固醇参与的PD发生发展机制的研究。星形胶质细胞是人脑中含量最丰富的细胞类型,在维持PD患者大脑胆固醇稳态扮演着重要角色[50]。近年来,星形胶质细胞在PD发病机制中作用开始被发现。Sonninen等[51]通过UPLC-Q-TOF-MS法探究星形胶质细胞的代谢变化,发现LRRK2和GBA基因突变的PD星形胶质细胞出现α-突触核蛋白生成增加、钙水平升高、溶血磷脂酰乙醇胺等多种氨基酸代谢改变。
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缺血性脑卒中(IS)是中风的一种常见形式,涉及神经炎症、氧化应激、兴奋性中毒等病理机制,患病后易导致脑损伤或残疾,严重者将危及生命,对人类健康构成极大威胁[52]。IS患者因急性血管闭塞所引起的脑组织缺血、缺氧,易使细胞自由基受损、钙离子超载、能量代谢紊乱,因此保护细胞免受缺氧缺糖的影响,是体外研究IS的思路之一。脑微血管内皮细胞是IS中损伤最严重的细胞,韩晨阳等[53]采用HPLC法发现该细胞在体外缺氧缺糖环境下产生ATP、二磷酸腺苷(ADP)含量降低,磷酸腺苷(AMP)含量增加等异常能量代谢变化,而这些病理变化与IS造成的细胞损伤相似。进一步探究丁苯酞对该模型的作用机制发现,丁苯酚可以有效调节细胞在氧糖剥离条件下产生的能量紊乱、钙离子超载。Wang等[54]运用GC-MS法研究杜仲防治IS的作用,采用缺氧缺糖条件下的脑微血管内皮细胞造模,发现杜仲具有促进苯丙氨酸代谢,抑制线粒体活性氧产生的作用。上述IS体外细胞模型的构建采用的是物理方法,即将细胞置于缺糖或缺血培养基与缺氧环境下培养,对设备要求较高,需将连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、氯化钴(CoCl2)等化学性缺氧试剂用于IS模型的构建。王宇翔[55]在PC12细胞的无糖培养基中加入Na2S2O4建立氧糖剥离模型,采用HPLC法探究染料木黄酮对所构建细胞模型的保护作用,通过测定细胞神经递质类氨基酸随时间含量变化情况,发现染料木黄酮可逆转缺氧缺糖所引起的谷氨酸、天冬氨酸等兴奋性氨基酸水平变化,发挥神经保护作用。
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抑郁症是一种复杂的精神障碍疾病,以持续的心境低落为主要临床特征。谷氨酸循环和糖皮质激素浓度异常与抑郁症的发生发展密切相关,目前体外实验主要使用皮质酮、谷氨酸诱导细胞产生神经损伤构建抑郁症细胞模型。Zhang等[56]采用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF-MS)探究皮质酮对PC12细胞的细胞毒性机制,鉴定出15种潜在生物标志物,涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸氧化、甘油脂代谢和甾醇脂物在内的5种代谢途径,为后续实验研究提供了有力支撑。何小燕等[57]运用1H-NMR法探究谷氨酸和皮质酮诱导下PC12细胞的代谢差异,结果显示两种刺激方式产生的代谢物不同,但影响的代谢通路却无显著差别,提示将差异代谢物与其代谢通路结合分析的重要性。中医药具有多层次、多靶点的整体调控作用,在防治抑郁症方面具有独特优势。但由于相关中医学证候模型的缺乏,在一定程度上制约了中医药防治抑郁症的进一步发展。付爽等[58]使用含10%肝郁脾虚证的血清诱导肝癌HepG2细胞构建抑郁症证候模型,对所建立的抑郁症肝郁脾虚证细胞模型与肝郁脾虚证血清进行代谢组学分析,发现了溶血磷脂酰胆碱、卵磷脂、甘油磷酰胆碱等19个相同的代谢差异物,涉及9条代谢通路,该证候细胞模型的建立为中医药辩证治疗的科学性和有效性提供了依据。
Application of cellular metabolomics in central nervous system diseases
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摘要: 细胞代谢组学是代谢组学的重要分支,通过细胞代谢组学技术可以动态监测细胞反应及药物作用于细胞后的代谢变化,寻找具有潜在价值的生物标志物,阐明疾病的病理生理机制及药物治疗干预效果,近年来已被广泛应用于疾病机制、药效评价、新药研发等领域。综述细胞代谢组学的研究流程及其在中枢神经系统疾病中的应用,以期为深入研究中枢神经系统疾病的发病机制和药物防治提供理论依据。Abstract: Cell metabolomics is an important branch of metabolomics, which could dynamically monitor cell response and metabolic changes after drugs acting on cells, and look for potential biomarkers. Cell metabolomics has been widely used in illustration of disease mechanism, evaluation of drug efficacy and development of new drug through elucidating the pathophysiological mechanism of the disease and the effect of drug treatment intervention. The researches process of cellular metabolomics and its application in central nervous system diseases were reviewed in order to provide theoretical basis for in-depth study of the pathogenesis and prevention and treatment of central nervous system diseases.
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Key words:
- cellular metabolomics /
- central nervous system diseases /
- cell model /
- biomarkers
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图 1 细胞代谢组学工作流程[6]
图 2 不同亚型的载脂蛋白E对星形胶质细胞葡萄糖代谢的影响[44]
表 1 细胞代谢组学在中枢神经系统疾病药物研究中的应用
疾病 研究对象 研究药物 检测手段 主要研究结果 参考文献 阿尔茨海默病 PC12细胞
(Aβ25~35)柚皮苷 GC-MS 筛选出甘氨酸、谷氨酸等27种AD差异代谢物,影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢及脂质代谢等代谢通路 [27] 脑微血管内皮细胞(Aβ1~42) 丹参 UHPLC-QTOF- MS 发现了33个差异代谢物,涉及精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等多条代谢通路 [28] SH-SY5Y细胞
(冈田酸)丹参、知母 UHPLC-QTOF- MS 发现了色氨酸、苯丙氨酸等45个潜在AD生物标志物,涉及12条代谢通路,筛选出与丹参相关的30种差异代谢物,与知母相关的7种差异代谢物 [29] SH-SY5Y细胞
(谷氨酸)人参皂苷 Rb1 1H NMR 发现谷氨酸、牛磺酸等7种差异代谢物,涉及5条不同的代谢通路 [30] 帕金森病 SH‐SY5Y细胞
(MPP+)胶质细胞源性神经营养因子 LC‐MS/MS 三酰甘油、磷脂酰胆碱等多种脂质代谢物受到影响 [31] SH-SY5Y细胞
(6-OHDA)花茶 UPLC-TOF-MS 发现多种与神经保护作用相关的代谢物 [32] SH-SY5Y细胞
(A53T基因突变)L-天冬酰胺酶 GC-MS/MS 可以调节谷氨酰胺代谢起到神经保护作用 [33] 抑郁症 PC12细胞
(皮质酮)阿魏酸 UPLC-QTOF-MS 发现24个差异代谢物,涉及氨基酸代谢、能量代谢和甘油磷脂代谢等代谢通路 [34] PC12细胞
(皮质酮)甘草苷 LC-MS 鉴定出谷氨酸、谷胱甘肽等11种潜在差异代谢物,涉及8条不同的代谢通路 [35] PC12细胞
(皮质酮)香附 UPLC-Q-TOF-MS 发现鞘磷脂、甘油磷脂等11种潜在差异代谢物 [36] PC12细胞 氯胺酮、羟基去甲氯胺酮对映体 GC-MS和CE-MS 发现甘油酸盐、柠檬酸盐、亮氨酸等49种潜在生物标志物 [37] 星形胶质细胞 氟西汀 1H NMR 发现17种潜在生物标志物,涉及脂质和氨基酸代谢通路 [38] 星形胶质细胞 文拉法辛 1H NMR 发现赖氨酸、酪氨酸、谷氨酸等31 种涉及能量、氨基酸和脂质代谢的差异代谢物 [39] -
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