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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
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101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
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姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
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雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
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姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
图 1 最优处方纳米乳的透射电镜图
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色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
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取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
图 2 姜黄素血浆样品的专属性
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18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
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药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
图 3 各给药组姜黄素的血药浓度-时间曲线 (
$\bar x $ ±s，n=6)表 1 各给药组姜黄素的药动学参数(
$\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 -
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
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实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。 -
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
图 4 给药前后大鼠体重变化
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
图 5 肝脏湿重以及肝脏指数变化（
$\bar x $ ±s，n=8）肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
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取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）
图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）
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第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势(
$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 -
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（
$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
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姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
Preparation, pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin nano emulsion
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摘要:
目的 探究姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性和对大鼠高脂血症的药效作用。 方法 建立大鼠血浆中姜黄素的高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）含量测定方法，考察纳米乳的体内药动学过程。建立SD大鼠高脂血症动物模型，初步考察姜黄素纳米乳对高脂饮食诱导的大鼠高脂血症的药效作用。 结果 体内药动学研究结果表明，以姜黄素原料药为参比制剂，姜黄素纳米乳的相对生物利用度为313.47 %；以市售片剂为参比制剂，姜黄素纳米乳的相对生物利用度为279.52 %。纳米乳组的Cmax为原料药组的201.48 %，为片剂组的193.02 %，且比原料药组及片剂组具有更高的MRT值（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %）。药效学研究结果表明姜黄素纳米乳口服给药系统能显著降低模型大鼠的血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDLc），缓解高脂饮食给模型大鼠造成的肝脏脂质沉积及肝损伤。 结论 姜黄素纳米乳口服给药系统能够有效改善姜黄素的生物利用度，具有良好的降血脂作用，并能够控制高脂血症大鼠体重增长和改善由脂质代谢紊乱造成的肝脏系数变化。 Abstract:Objective To explore the pharmacokinetic properties of curcumin nano emulsion and its pharmacodynamic effects on hyperlipidemia in rats. Methods The method for determination of curcumin was established by HPLC-MS. The pharmacokinetics characteristics of curcumin nano emulsion oral administration system were investigated. SD rats were used as model animals to establish hyperlipidemia animal models, and the pharmacodynamic effects of curcumin nano emulsion on hyperlipidemia induced by high fat diet was preliminarily investigated. Results The results of pharmacokinetic studies in vivo showed that the relative bioavailability of curcumin nano emulsion was 313.47% with bulk drug group as the reference preparation. The relative bioavailability of curcumin nano emulsion was 279.52 % with tablets as reference preparation. Cmax of curcumin nano emulsion group was 201.48 % of that of bulk drug group and 193.02 % of that of tablet group, and had higher MRT value (183.52 % of that of bulk drug group and 154.21 % of that of tablet group) than bulk drug group and tablet group. Pharmacodynamics research results showed that curcumin nano emulsion oral administration system could significantly reduce the levels of triglyceride and LDL-c in serum of model rats, and relieve liver lipid deposition and liver injury caused by high-fat diet in model animals. Conclusion The oral administration system of curcumin nano emulsion could effectively improve the bioavailability of curcumin, which has a good hypolipidemic effect. It also could control the weight gain of hyperlipidemia rats and improve the changes of liver coefficient caused by lipid metabolism disorder. -
Key words:
- Curcumin /
- Nano emulsion /
- Hyperlipidemia /
- Pharmacokinetics /
- Pharmacodynamics
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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的一种生殖内分泌疾病，其特征以生化或临床高雄激素血症、无排卵和卵巢多囊样改变等为主要表现[1-2]。流行病学显示PCOS在全世界范围内的总体发病率约为6%~20%[3]，而由PCOS引发的排卵障碍所致的不孕症占40%[4]。PCOS不仅影响女性的正常生殖功能，还会导致女性发生代谢系统方面的障碍，如高胰岛素血症、胰岛素抵抗，增加女性继发糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌的风险，对女性健康造成严重不良影响[2]。肥胖是PCOS发生的重要危险因素之一[5]。研究数据表明，28.3%的超重或肥胖的女性患有PCOS[6]，多达42%的PCOS患者超重或肥胖[7]。肥胖对PCOS的发展和进展产生显著影响，研究发现，脂肪细胞主要通过分泌脂肪因子，如IL-1、IL-6、瘦素、脂联素等，作用于相应的靶器官、靶组织、靶细胞，如卵巢、肾上腺等，刺激机体产生较多的雄激素，而雄激素又可通过抑制肾上腺素受体等导致体内脂肪分解减少，脂肪大量堆积在体内，导致体内高雄激素水平与肥胖之间形成恶性循环，严重影响PCOS患者的健康状况[3]。与普通女性相比，PCOS患者具有更高的肥胖倾向，且更容易出现腹部脂肪堆积[8]；而这种由于腹部脂肪堆积造成的中心性肥胖反过来又可加重PCOS患者的临床或生化表现，导致胰岛素抵抗、高雄激素血症、生殖功能异常等[9]。临床试验结果显示，若患者体质量减轻初始体质量的5%，其体内激素水平、血糖水平得以改善，同时，月经周期和排卵情况趋于正常化，这表明体质量减轻可增加患者排卵和妊娠的可能性[10]。
青蒿素（artemisinin，ART）是一种天然倍半萜内酯化合物，最初由2015年诺贝尔生理学或医学奖获得者屠呦呦从青蒿植物中提取出来并广泛用于抗疟疾治疗[11]；青蒿素还用于抗癌、抗炎药物等[12]。近年研究发现，青蒿素及其衍生物还具有预防肥胖的功效：在啮齿动物模型中，青蒿素及其衍生物通过调节p38MAPK/ATF2轴和Akt/mTOR途径等在脂肪生成过程中诱导脂肪细胞褐变，从而预防肥胖并改善肥胖相关的代谢紊乱[13]。Lee等[14]和Jang[15]体外实验数据表明，青蒿素及其衍生物可通过PPARγ途径抑制脂肪生成和脂肪因子的表达。本研究通过网络药理学方法和分子对接方法分析预测青蒿素可用于治疗PCOS的潜在靶点，旨在为深入研究其治疗的作用机制提供参考。
1. 材料和方法
1.1 青蒿素及PCOS靶点预测
通过Pubchem数据库[16]（
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）获得天然产物青蒿素的SMILES号，并将其输入Swiss TargetPrediction数据库[17]（http://www.swisstargetprediction.ch/ ）进行靶点预测，导出分析结果并保存；结合PharmMapper数据库[18]（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ ）预测的靶点，二者共同作为青蒿素的药物靶点，并将靶点导入Uniprot数据库[19]（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白与基因名称转换。以“polycystic ovary syndrome”作为关键词检索，通过DisGeNET数据库[20]（https://www.disgenet.org/ ）、GeneCard数据库[21]（https://www.genecards.org/ ）进行疾病靶点预测。将搜集的青蒿素靶点和PCOS靶点分别导入Venny在线作图软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ ）绘制韦恩图，从而得到二者的共同靶点。1.2 PPI网络构建及核心靶点筛选
将共同靶点导入STRING数据库[22]（
https://cn.string-db.org/ ），物种选择“homo sapiens”，最低相互作用分数设置为“0.9”，隐藏游离点，其他保持默认设置，得到蛋白相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI），将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.1软件[23]，进行核心靶点筛选。1.3 富集分析
将共同靶点导入DAVID数据库[24]（
https://david.ncifcrf.gov/ ），分别进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopodia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO功能富集内容从分子功能（molecular function，MF）、生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)三部分进行逐一分析，并利用微生信在线作图软件（http://www.bioinformatics.com.cn/ ）将分析结果进行可视化。1.4 药物-疾病-靶点-通路网络图构建
将所获得的青蒿素、PCOS作用靶点及信号通路分别导入Cytoscape软件构建药物-疾病-靶点-通路网络图。
1.5 分子对接
从Pubchem数据库中下载青蒿素的2D结构，在RCSB PDB数据库[25]（
https://www.rcsb.org/ ）中下载核心靶蛋白结构。利用Chem3D软件对青蒿素的2D结构进行转化，用Pymol软件对核心靶蛋白结构进行初步处理，再用Auto Dock Tools软件做进一步加氢等处理，并将处理的核心靶蛋白保存为“pdbqt”格式进行分子对接，最后利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理[26-27]。2. 结果
2.1 青蒿素及PCOS作用靶点
通过数据库检索共得到青蒿素潜在作用靶点229个，PCOS疾病靶点1292个。利用在线作图软件将青蒿素作用靶点与PCOS疾病靶点进行韦恩图分析，得到二者的交集靶点90个，如图1所示。
2.2 PPI网络构建及核心靶点筛选
将交集靶点导入String数据库，绘制PPI网络关系图，如图2所示，其中包括网络节点90个，边235条。将共同靶点导入Cytoscape 软件进行核心靶蛋白筛选。如图3所示。综合节点度值及本研究相关度排名靠前的分别为AKT1、ESR1、MMP9、PPARγ、MMP2（见表1）。
图 2 蛋白互作网络图注：图中节点代表蛋白质，其中红色节点表示查询蛋白质，其他颜色节点表示与查询蛋白只有相互作用的其他蛋白质，空白节点表示未知3D结构的蛋白质，填充节点表示已知3D结构，连线代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 2.3 富集分析
将得到的90个交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析，富集结果分别根据基因富集程度进行排序，其中BP前10个条目主要涉及细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程，MF前10个条目主要与蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白结合和酶结合等分子功能有关，CC前10个条目主要在细胞膜、胞质和胞核等部位富集，如图4所示。KEGG富集分析共筛选到162条信号通路，根据基因富集程度排序，前20个条目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、Ras、内分泌抵抗等信号通路，如图5所示。
2.4 药物-疾病-靶点-通路网络图构建
将相关靶点及通路文件导入Cytoscape 3.9.1软件，得到药物、疾病、靶点和通路之间的关系图（见图6）。
2.5 分子对接
分子对接结果显示，青蒿素与核心靶蛋白AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2之间均存在结合位点。青蒿素与核心靶蛋白的最低结合能分数见表2，结合能越低表示结合活性越高，化合物越容易与该靶点结合。其中青蒿素与核心靶蛋白之间的氢键连接可视化情况如图7所示。
表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190 3. 讨论
PCOS主要通过卵巢病变、机体内分泌紊乱等方式影响女性的生育能力[28]。目前关于PCOS的发病机制和病因尚未具体阐明，多认为是遗传和环境因素相互作用的结果；由于病因机制不明，临床治疗尚无统一方案，多采用对症治疗，如基础生活方式调整，通过控制饮食、增加体育运动以降低体质量和缩小腰围，增加机体胰岛素敏感性，降低胰岛素及雄激素水平，同时辅以相应的药物治疗，以减轻症状。
本研究基于临床发现，PCOS患者多伴有肥胖表现，遂以肥胖与PCOS之间的潜在联系为出发点，同时基于课题组现有天然活性物质进行药物筛选，经文献调研发现青蒿素有抗肥胖效果，继而通过网络药理学方法分析预测青蒿素可能用于治疗PCOS的潜在作用靶点，并探讨其可能用于临床治疗PCOS的可行性。
本研究根据PPI网络拓扑属性分析筛选出核心靶点AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2等，推测这些可能是青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点。有研究表明[29]，AKT1在颗粒细胞增殖中起关键作用，而其表达量的高低主要与机体雄激素水平异常有关，这会导致PCOS患者卵巢颗粒细胞正常功能受损。此外，AKT1还具有组织特异性，Song等[30]通过小鼠实验发现脂肪组织中AKT1的选择性抑制可以刺激白色脂肪组织发生褐变，从而可增加机体能量消耗发挥抗肥胖的效果。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一种锌依赖性酶，可由卵巢产生，在卵泡发育和PCOS的发病机制中起重要作用[31]；研究发现PCOS女性患者MMPs活性增加，其血液、卵泡液和颗粒细胞中MMP9、MMP2水平升高，高水平的MMPs会通过改变细胞外基质重塑，引起异常卵泡闭锁和卵巢基质组织增加，从而对患者的排卵和生育能力产生不良影响[32]。Barbara等[33]在对正常女性和肥胖女性血清样本中的MMP浓度对比发现，体质量增加可影响女性血清中的MMP浓度。ESR是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育以及排卵功能的关键受体[34]；ESR1是一种核激素受体，作为转录因子的激活剂发挥作用[35]；Schomberg等[36]在ESR基因敲除的小鼠模型中发现ESR基因缺失会导致卵泡发育受阻，以致卵泡闭锁及无排卵现象发生。Artimani等[37]在评估PCOS患者颗粒细胞中ESR基因表达时发现，ESR mRNA的表达显著低于排卵功能正常女性，认为ESR基因的显著减少可作为颗粒细胞成熟缺陷或卵泡发育停滞的指标。ESR1也是一种与线粒体功能相关的基因，研究发现其在肥胖女性脂肪组织中有减少，Zhou等[38]在人类和啮齿动物实验中证实，脂肪组织中ESR1的表达与脂肪量呈负相关，同时ESR-α作用的降低还会损害线粒体功能，促进肥胖增加，破坏机体代谢稳态。PPARγ是一种调节脂肪细胞发育和葡萄糖稳态的核受体，主要在脂肪组织中表达[39]；此外在发育阶段的卵巢颗粒细胞中表达，并可受黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平的影响来调节机体雌激素分泌和卵巢功能[40]。此外，Lee等[41]在PCOS患者颗粒细胞中发现PPARγ mRNA表达水平下调。胡卫红等[42]研究发现PPARγ 在PCOS患者的卵巢颗粒细胞的表达异常可能与PCOS的高雄激素血症有关。
GO生物学过程富集分析表明，青蒿素治疗PCOS的生物学功能可能与细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程有关。KEGG通路富集分析表明，青蒿素可能通过作用于PI3K/Akt、MAPK、Ras、癌症等信号通路发挥治疗作用。有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与调节细胞增殖分化和迁移，在卵泡发育过程中对卵巢颗粒细胞的生长和凋亡起着关键作用[43]，在PCOS患者颗粒细胞中与氧化应激相关的凋亡多伴随PI3K/Akt信号下调[44]。此外，研究表明PI3K/Akt信号通路还可以调节脂肪细胞的脂解与分化，从而参与机体脂质代谢[45]。MAPK信号通路参与调节多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控等，且该通路与卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成有关[46]。研究发现，在PCOS女性中，异常的MAPK信号传导可导致代谢信号缺陷和卵巢雄激素分泌异常增多[47]。
为进一步探索青蒿素在PCOS治疗中的潜在分子机制，本研究将天然产物青蒿素和5个与PCOS密切相关的核心靶蛋白进行分子对接验证，寻找二者之间存在的最佳结合位点以及评估它们之间的结合能力。验证结果显示，青蒿素与核心靶蛋白之间能够较好结合。
综上所述，本研究采用网络药理学方法分析天然物青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点，其机制可能主要涉及PI3K/Akt、MAPK、内分泌抵抗等信号通路。这些信息为后续青蒿素用于治疗PCOS的实验验证提供了重要理论依据。
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图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）
A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）
A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数(
$\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 
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表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势(
$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较
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表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（
$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较
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