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用电感耦合等离子体质谱法测定钆特酸葡胺注射液中游离Gd3+的含量

王骐榕 陈洁仪 孙渺 陈玉平 杨峰

宋开超, 方夏琴, 李鹤, 郝玉梅, 谭晓川, 郑稳生. 水合氯醛有关物质分析方法优化与稳定性检测[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(7): 422-427. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106092
引用本文: 王骐榕, 陈洁仪, 孙渺, 陈玉平, 杨峰. 用电感耦合等离子体质谱法测定钆特酸葡胺注射液中游离Gd3+的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 124-128. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132
SONG Kaichao, FANG Xiaqin, LI He, HAO Yumei, TAN Xiaochuan, ZHENG Wensheng. Analysis method optimization and stability test of related substances of chloral hydrate[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(7): 422-427. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106092
Citation: WANG Qirong, CHEN Jieyi, SUN Miao, CHEN Yuping, YANG Feng. Determination of the content of Gd3+ in gadoteric acid meglumine salt injection by ICP-MS method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 124-128. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132

用电感耦合等离子体质谱法测定钆特酸葡胺注射液中游离Gd3+的含量

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132
基金项目: 海军军医大学本科学员创新能力孵化基地项目(FH2018078)
详细信息
    作者简介:

    王骐榕,硕士研究生,Tel:18616274302,Email:356918956@qq.com

    通讯作者: 杨 峰,博士,教授,研究方向:控缓释及靶向药物制剂研究,Email:yangfeng1008@126.com
  • 中图分类号: R284.1

Determination of the content of Gd3+ in gadoteric acid meglumine salt injection by ICP-MS method

  • 摘要:   目的  建立测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法。  方法  电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法。分离柱为金属螯合柱(1-ml Chelating Sepharose column),柱温为常温,流速为1 ml/min,进样量为0.5 ml。ICP-MS的相对分子质量为157(Gd的相对分子质量为157),载气为氩气。  结果  回归方程为:Y=0.001 635X+0.000 000E+000(经过原点),r=1.000。线性范围为0~500 μg/L;仪器精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验结果均符合要求。  结论  该方法操作简便、结果准确、重复性好,可用于测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+的含量。
  • 水合氯醛,又称水合三氯乙醛,具有镇静、催眠、抗惊厥等作用,临床上以溶液口服或灌肠方式给药。但水合氯醛稳定性较差,临床使用制成溶液制剂有效期很短,其主要的杂质有三氯甲烷、甲酸、氯乙酸等,其中三氯甲烷是原料生产与储存过程中比较重要的降解杂质[1]。国内较多数的文献对水合氯醛及其制剂的稳定性研究采用滴定法或紫外法[2-3],此方法准确度差,专属性不足,不能准确评估水合氯醛及其制剂的质量状况。目前,《中国药典》以及国外各国药典收载的水合氯醛及其制剂的质量标准中有关的检查方法专属性均较低[4-7]

    各国药典中鉴别、酸度、炽灼残渣与溶液澄清度是水合氯醛药物的基本理化分析项,醇合三氯乙醛则为控制本品合成过程中产生的一种杂质。水合氯醛在生产、运输过程中可能产生的降解杂质有甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等,现有的法定标准对此部分降解产物未进行控制,有关物质项存在缺失。本文旨在对主要降解产物进行定量检测,如甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸进行检测方法开发,其中,水合氯醛通过碳碳键断裂降解成等比例甲酸、三氯甲烷,检测甲酸或检测三氯甲烷均可。

    三氯甲烷主要采用气相、气质色谱法[8-10]进行检查,氯乙酸等卤代羧酸可采用液相色谱法和离子色谱法[11-13]分析,水合氯醛专属性较强的检测方法为气相色谱法[10-14]。因卤代羧酸具有沸点高、强极性特点,不易气化,无法直接进样进行气相色谱分析,需进行衍生化处理,故本文将卤代羧酸检测方法与三氯甲烷检测方法分别开发建立。

    Thermo trace 1300 GC(赛默飞气相色谱仪);电子天平 ME-204E(梅特勒科技);三氯甲烷 (北京通广试剂公司);氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸(标准品,CATO);正庚烷(fisher);甲醇、硫酸、硫酸钠;水合氯醛(青岛宇龙海藻药业,批号20190403)。

    色谱柱温:40 ℃保持3 min;以5 ℃/min的速度升至80 ℃,以20 ℃/min升至160 ℃,再以30 ℃/min升至250 ℃;进样口温度:150 ℃;检测器:ECD,温度280 ℃;色谱柱:DB-5.625 30 m×0.25 mm,0.25 μm;进样体积1 μl。

    分别确定水合氯醛检测三氯甲烷和卤代羧酸的样品处理方法,详见表1

    表  1  三氯甲烷与卤代羧酸检测样品前处理方法
    溶液名称前处理1前处理2
    供试品溶液(测定卤代羧酸)/称取水合氯醛约10 mg,置50 ml具塞试管中,精密加入甲醇2 ml,20%的硫酸乙醇溶液2 ml(V/V),无水硫酸钠0.1 g,密塞,漩涡使溶解,置50 ℃水浴加热40 min,取出后迅速冲凉,精密加入4 ml正庚烷,漩涡混匀,加入
    20 ml水,振摇,静置20 min,分层,取上清液即得。
    卤代羧酸对照品溶液/分别称取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸适量,分别用甲醇配制成浓度为100 μg/ml的储备液,取1 ml置10 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度即得;取上述溶液各1 ml,置50 ml具塞试管中,精密加入1 ml甲醇,20%的硫酸乙醇溶液2 ml(V/V),无水硫酸钠0.1 g,密塞,漩涡使溶解,置50 ℃水浴加热
    40 min,取出后迅速冲凉,精密加入4 ml正庚烷,漩涡混匀,加入20 ml水,振摇,静置20 min,分层,取上清液即得各对照品溶液。
    供试品溶液(测定三氯甲烷)称取水合氯醛约10 mg,置10 ml具塞试管中,加甲醇溶液完全,定容后过滤取续滤液即得。称取水合氯醛约100 mg,置10 ml具塞试管中,加入饱和氯化钠溶液
    0.35 ml,氯化钠0.5 g,正己烷5 ml,密塞,振摇提取,静置20 min,取正己烷层,取续滤液即得。
    三氯甲烷对照品溶液称取三氯甲烷适量,甲醇溶解至
    60 μg/ml即得。
    称取三氯甲烷适量,用正己烷配置成浓度为20 μg/ml的储备液;取1 ml置10 ml量瓶中,用正己烷定容至刻度即得。
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    2.1.1   系统适用性试验

    按照图1方法,配制用于氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸检测的对照品溶液,并按照“1.2色谱条件”进样检测,结果如下。

    图  1  衍生化方法GC色谱图
    A.正庚烷;B.氯乙酸;C.二氯乙酸;D.三氯乙酸。

    对照品溶液浓度分别为氯乙酸 9.95 μg/ml,二氯乙酸 13.49 μg/ml,三氯乙酸9.45 μg/ml,连续进样5针,氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的保留时间分别为4.33、5.89和7.38 min,各峰面积RSD分别为0.75%、1.00%、1.00%,满足系统适用性要求。衍生化转化目标物更容易被气化,氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸经衍生化后分别以氯乙酸乙酯、二氯乙酸乙酯、三氯乙酸乙酯形式被检测。

    2.1.2   线性关系考察

    分别取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸对照品适量,加甲醇溶解稀释制成浓度为10 μg/ml的储备液,分别取储备液适量置具塞试管中,按照表1衍生化处理后,取正庚烷层,即得各自的工作曲线样品溶液,按照“1.2色谱条件”进样检测,以峰面积为纵坐标,相应卤代羧酸浓度为横坐标,进行线性回归。结果见表2,并按照信噪比大于3和大于10分别规定检测限和定量限。

    表  2  氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸线性试验结果
    样品名称线性方程回归系数 r线性范围(μg/ml)检测限(μg/ml)定量限(μg/ml)
    氯乙酸Y=0.0042X+0.00020.99970.25~50.0250.05
    二氯乙酸Y=0.1106X+0.0050.99980.125~2.50.050.125
    三氯乙酸Y=0.32X+0.01640.99980.0625~2.50.010.0625
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    将上述信噪比满足定量限的各对照品溶液连续进样5针,氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD为别为5.27%、1.94%、1.15%,显示各目标物的定量限浓度下检测精密度满足要求(RSD<15%)。

    2.1.3   重复性试验

    表1前处理方法进行配制供试品溶液和对照品溶液,平行取6份供试品溶液,连续采集,记录并计算各供试品溶液中氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的含量,氯乙酸均未检出,二氯乙酸含量RSD为4.43%,三氯乙酸含量结果RSD为4.56%,按照本方法进行卤代羧酸含量检测,含量结果RSD均小于6%。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求[15],本供试品中卤代羧酸的含量(10 ppm)重复性要求RSD小于6%。本方法重复性满足要求。

    2.1.4   准确度试验

    采用加样回收率进行方法准确度考察,精密称取10 mg水合氯醛原料药10份,分别置10个50 ml锥形瓶中,编号1~3加入混合对照品溶液1.2 ml,编号4~6加入混合对照品溶液1 ml,编号7~9加入混合对照品溶液0.8 ml,上述混合对照品溶液中,氯乙酸浓度为 9.95 μg/ml,二氯乙酸 浓度为13.49 μg/ml,三氯乙酸浓度为9.45 μg/ml,第10份不加混合对照品溶液,同步取样混合对照品1 ml置50 ml锥形瓶中,得到11份样品,按照表2衍生化处理,取正庚烷层进样检测,结果如表3

    表  3  氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸准确度试验结果
    编号原有量(m/mg)加入量(m/μg)测得量(m/μg)回收率(%)
    氯乙酸二氯乙酸三氯乙酸氯乙酸二氯乙酸三氯乙酸氯乙酸二氯乙酸三氯乙酸
    110.233.003.003.003.142.883.11104.595.4595.82
    210.173.003.003.002.722.852.9990.6494.3591.75
    39.973.003.003.002.612.703.3586.9989.44103.7
    410.002.502.502.502.462.382.5198.2594.4491.13
    59.952.502.502.502.132.442.5085.0996.7090.44
    610.082.502.502.502.522.352.48100.993.2289.86
    710.112.002.002.001.711.892.0385.5393.4089.49
    89.882.002.002.001.821.862.0591.0191.8890.83
    910.012.002.002.001.781.882.0988.8292.8792.85
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    按照本方法进行卤代羧酸含量检测准确度试验,回收率结果符合相关要求。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求,本供试品中卤代羧酸的含量(10 ppm)回收率限度要求为80%~115%。本方法准确度满足要求。

    2.1.5   稳定性试验

    取“2.1.1”项下的各对照品溶液,分别于24 h内不同时间进样检测,结果显示氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD分别为4.0%、2.1%、1.6%,表明本方法样品溶液24 h内稳定性良好。

    2.2.1   专属性考察

    分别按照表1中两种前处理方式配制对照品溶液、供试品溶液。前处理1测定色谱图见图2,前处理2测定色谱图见图3。在上述色谱条件下,两种前处理使用的正己烷和甲醇均不干扰三氯甲烷的测定,三氯甲烷保留时间约为2.5 min。

    图  2  三氯甲烷检测色谱图(前处理1)
    A.甲醇;B.对照品;C.供试品。
    图  3  三氯甲烷检测色谱图(前处理2)
    A.正己烷(溶剂);B.对照品;C.供试品。
    2.2.2   重复性与系统适用性试验

    分别按照前处理1和前处理2方法制备6份供试品;另取三氯甲烷对照品适量,分别用甲醇溶解稀释至60 μg/ml;用正己烷溶解稀释至2 μg/ml。将以上供试品与对照品,按照“1.2 色谱条件”进样检测,结果见表4

    表  4  三氯甲烷检测方法重复性试验
    样品名称前处理方法1前处理方法2
    峰面积含量(%)峰面积含量(%)
    对照品溶液1.5129/0.2863/
    供试品10.7824 3.190.06080.00212
    供试品21.4486 5.910.06160.00215
    供试品31.6091 6.560.05960.00208
    供试品40.6147 2.510.05820.00203
    供试品50.8345 3.400.06530.00228
    供试品61.0321 4.210.06790.00237
    RSD(%)37.465.89
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    因水合氯醛对热不稳定,熔点低57 ℃,在高温条件下碳碳键断裂产生三氯甲烷和甲酸,直接进样或顶空进样均可导致水合氯醛降解而使检测结果偏高,不能反映其实际三氯甲烷含量。而且依据ICH Q3C(R6)残留溶剂指导原则,三氯甲烷属于药品生产中应限制使用的溶剂(二类溶剂),其限度要求是60 ppm(即残留上限0.006%),结合本品原料药检测结果与重复性结果,前处理方法2检测结果准确真实。

    连续进样5针正己烷配制的三氯甲烷对照品溶液,峰面积RSD为2.45%,表明本法的系统适用性试验结果良好。

    2.2.3   线性与范围

    精密称取三氯甲烷对照品,用正己烷溶解稀释至20 μg/ml,分别取其中0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 ml置10 ml量瓶,用正己烷稀释至刻度即得工作曲线样品,按照“1.2 色谱条件”进样,以峰面积为纵坐标,相应浓度为横坐标进行线性回归,得线性方程Y=0.1094X+0.0222, r =0.9998,表明三氯甲烷在浓度0.2408~3.011 μg/ml范围内线性良好。将三氯甲烷对照品溶液逐级稀释,得0.02、0.001 μg/ml进样分析,信噪比分别为14和4,分别为定量限和检测限。

    2.2.4   三氯甲烷检测准确度试验

    取水合氯醛原料药,按表2中前处理方法2配制,平行9份,编号1~3加入0.6 ml对照品溶液,编号4~6加入对照品储备液0.5 ml,编号7~9加入对照品储备液0.6 ml,分别置10 ml离心管中,加入饱和氯化钠0.5 ml,氯化钠0.5 g,4.4 ml正己烷,振摇溶解,静置30 min,分别取正己烷层进样检测,结果见表5

    表  5  三氯甲烷检测准确度试验
    样品编号加入量(m/μg)检测值(m/μg)本底值(m/μg)回收率(%)
    供试品11.20422.301.1991.53
    供试品21.20422.181.1981.70
    供试品31.20422.391.1999.71
    供试品410.7911.771.8192.32
    供试品510.7911.601.8190.71
    供试品610.7911.791.8192.46
    供试品712.94813.251.8188.29
    供试品812.94812.811.8184.94
    供试品912.94814.041.8194.41
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    按照本方法进行三氯甲烷含量检测的准确度试验,回收率符合《中国药典》相关要求。

    2.2.5   三氯甲烷检测溶液稳定性

    取三氯甲烷对照品、水合氯醛原料药,按表2中前处理方法2进行配制对照品溶液、供试品溶液,按“1.2色谱条件”进样检测,考察24 h内不同时间样品的稳定性,结果显示供试品与对照品稳定性均小于5.0%,稳定性良好。

    水合氯醛具有较强的挥发性与引湿性,在高温条件下挥发与降解性能均增强,结合《中国药典》2020年版药品稳定性试验技术要求,对本品进行影响因素试验与加速试验考察。将水合氯醛置样品瓶(封口)中,分别置温度25 ℃/湿度75%,温度40 ℃/湿度75%,温度60 ℃/湿度60%以及温度25 ℃/湿度60%、光照强度4500 lx条件下考察,并于不同时间点检测杂质含量变化,结果见表6

    表  6  水合氯醛稳定性试验结果
    放置条件时间(t/d)检测结果(%)
    三氯乙酸二氯乙酸三氯甲烷氯乙酸
    温度25 ℃/湿度75%100.0010.0030.004未检出
    300.0010.0030.004未检出
    温度40 ℃/湿度75%100.0010.0030.152未检出
    300.0010.0030.323未检出
    温度60 ℃/湿度60%100.0010.0040.546未检出
    300.0010.0040.871未检出
    温度25 ℃/湿度60%、
    光照强度4500 lx
    100.0010.0030.045未检出
    300.0010.0030.151未检出
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    以上数据显示,水合氯醛原料受温度和光照影响较大,主要的降解产物为碳碳键断裂的水解产物三氯甲烷,卤代羧酸未有明显的改变。三氯甲烷是主要的降解产物,其中三氯甲烷为二类毒性溶剂,但目前水合氯醛的国内外法定标准中均无三氯甲烷的含量检测和限度要求,且水合氯醛本身具有较大的毒性,则其降解产物的限度仍需结合长期稳定性结果和临床使用的安全性、有效性进行综合评估。另本次试验采用称量瓶封口存放,密封性不佳,会加速水合氯醛的挥发水解,本品应室温避光密封保存;在制剂研发和存储运输过程中,应严格控制温度与光照影响。

    本文建立了气相色谱法测定水合氯醛原料药中杂质三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。利用检测目标物的理化性质,采用不同前处理方法进行三氯甲烷、卤代羧酸的检测,色谱峰形良好,方法简单、准确度高、重复性良好,可避免水合氯醛检测过程中的自身降解,准确高效的检测药物中杂质含量,满足目前市售原料及其制剂的检测需求。

    本法中,三氯甲烷检测限浓度为供试品浓度的万分之0.005(0.5 ppm);氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.1(10 ppm);二氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.2(20 ppm);三氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.04(4 ppm)。本品多次检测以及稳定性试验中均未出现氯乙酸,说明本品中确无高于检出限的残留,也不易降解产生。

    通过水合氯醛的稳定性实验发现,本品在温度、光照条件下均会发生降解,三氯甲烷为主要的降解产物,故进行本品相关制剂的研发、检测、生产和运输过程中需要严格控制生产工艺与储存条件,保证产品的质量稳定,保障用药安全性。

  • 图  1  方法专属性考察曲线

    A.对照品;B.供试品;C.对照品供试品混合物;1.配合物峰;2.离子峰;L.10 min时流动性由A液转换为B液。

    表  1  钆特酸葡胺注射液精密度试验结果

    样品编号测得Gd浓度(μg/L)峰面积RSD(%)
    194.922.69
    298.241.69
    395.432.46
    4104.914.08
    590.563.13
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    表  2  钆特酸葡胺注射液稳定性试验结果(n=5)

    室温下放置时间(t/h)测得Gd浓度(μg/L)
    a液b液
    081.184.08
    283.144.17
    481.054.11
    680.413.97
    1279.054.02
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    表  3  钆特酸葡胺注射液重复性试验结果(n=5,mmol/L)

    样品编号Gd3+的理论含量Gd3+的实测含量
    10.10.104
    20.10.106
    30.10.105
    40.10.101
    50.10.102
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    表  4  加样回收率试验结果(n=4)

    样品理论钆含量
    m/mg)
    标准品理论钆含量
    m/mg)
    样品钆含量
    m/mg)
    混合溶液钆含量
    m/ng)
    加样回收率
    (%)
    平均加样回收率
    (%)
    RSD
    (%)
    104.7100209.23197.7493.1393.191.9
    104.7100215.99199.2491.24
    104.7100206.47196.0292.78
    104.7100220.80206.0195.61
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    表  5  钆特酸葡胺注射液Gd3+含量测定结果(n=3)

    批号含量(mg/L)RSD(%)
    201609012.631.53
    201609022.601.15
    201609032.641.36
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-30
  • 修回日期:  2019-12-08
  • 网络出版日期:  2020-04-23
  • 刊出日期:  2020-03-01

用电感耦合等离子体质谱法测定钆特酸葡胺注射液中游离Gd3+的含量

doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132
    基金项目:  海军军医大学本科学员创新能力孵化基地项目(FH2018078)
    作者简介:

    王骐榕,硕士研究生,Tel:18616274302,Email:356918956@qq.com

    通讯作者: 杨 峰,博士,教授,研究方向:控缓释及靶向药物制剂研究,Email:yangfeng1008@126.com
  • 中图分类号: R284.1

摘要:   目的  建立测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法。  方法  电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法。分离柱为金属螯合柱(1-ml Chelating Sepharose column),柱温为常温,流速为1 ml/min,进样量为0.5 ml。ICP-MS的相对分子质量为157(Gd的相对分子质量为157),载气为氩气。  结果  回归方程为:Y=0.001 635X+0.000 000E+000(经过原点),r=1.000。线性范围为0~500 μg/L;仪器精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验结果均符合要求。  结论  该方法操作简便、结果准确、重复性好,可用于测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+的含量。

English Abstract

宋开超, 方夏琴, 李鹤, 郝玉梅, 谭晓川, 郑稳生. 水合氯醛有关物质分析方法优化与稳定性检测[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(7): 422-427. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106092
引用本文: 王骐榕, 陈洁仪, 孙渺, 陈玉平, 杨峰. 用电感耦合等离子体质谱法测定钆特酸葡胺注射液中游离Gd3+的含量[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(2): 124-128. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132
SONG Kaichao, FANG Xiaqin, LI He, HAO Yumei, TAN Xiaochuan, ZHENG Wensheng. Analysis method optimization and stability test of related substances of chloral hydrate[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(7): 422-427. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106092
Citation: WANG Qirong, CHEN Jieyi, SUN Miao, CHEN Yuping, YANG Feng. Determination of the content of Gd3+ in gadoteric acid meglumine salt injection by ICP-MS method[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(2): 124-128. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.201908132
  • 钆特酸葡胺注射液是一种临床上常用的含钆增强磁共振对比剂。钆对比剂按照钆离子结合配体的结构不同,可将其分为线性类和大环类两类,钆特酸葡胺注射液中钆属于大环类钆对比剂。钆对比剂具有很强的亲水性,理论上不能进入细胞内,且无特殊靶器官。通过静注后短时间内分布到全身血液系统,并很快达到平衡期,可在1 d内以原型的形式全部排出体外,理论上在人体内无残留。近年来研究表明,反复使用钆对比剂的患者,其脑部会出现不同程度的钆对比剂沉积现象,并且其脑深部核团的MRI扫描信号也会随之发生改变[1-3]。同时,使用不同类型的钆对比剂所造成的钆对比剂脑沉积的程度也有所不同[4-5]。曾经反复使用过线状钆对比剂的患者,可在其头颅MR扫描中观察到明显的信号改变。而曾经多次使用过大环状钆对比剂的患者,在脑中却未观察到明显的钆对比剂沉积现象[6]。在此基础上,美国食品药品监督管理局发布通告,要求医疗人员重新评估使用钆对比剂的条件[7]。同时,欧洲药品管理局也停止了对几种线性钆对比剂的市场授权[8]。2017年,我国食品药品监督管理局也发布通告提示关注含钆对比剂反复使用引起脑部钆沉积的风险[9-10]。研究表明,钆对比剂中游离Gd3+的含量与钆对比剂的脑沉积现象密切相关[4-5],但目前无论在体内或者体外环境中定量测定钆对比剂中游离Gd3+含量的方法尚不成熟。因此,笔者通过反复试验并查阅相关资料,建立了一种新的体外环境测定钆对比剂中游离Gd3+含量的方法。

    • AKTA蛋白纯化仪、自动进样器(美国GE公司);ICP-MS 8800(Agilent technologies);分离柱(1-ml Chelating Sepharose column GE)。

    • 钆特酸葡胺注射液0.5 mol/L,含钆特酸葡胺377 g/L。(批号:170923BC、170924BC、170925BC,江苏恒瑞医药股份有限公司);Gd标准对照品溶液(标准值1 000 mg/L,批号:GSB 04-1780-2004,国家有色金属及电子材料分析测试中心);六水合硝酸钆(浓度99.99%);去离子水(18.2 MΩ,自制);内标溶液:20 mg/L的6Li、45Sc、89Y、115In、209Bi混合溶液(2%硝酸介质,Accu Standard,USA)。其他试剂均为分析纯。

    • 分离柱为金属螯合柱(1-ml Chelating Sepharose column),常温下,A液为10 mmol/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)溶液,B液为50 mmol/L的EDTA溶液。流速为1 ml/min,平衡系统后,进样500 μl,先用100%的A液冲洗10 min(10倍柱体积),再用100%的B液冲洗20 min(20倍柱体积),得到分离后的样品。

    • 载气为氩气,射频功率1 350 W,冷却气流量:13 L/min;辅助气流量:0.80 L/min;雾化器氩气流量:0.88 L/min。采用内标法做定量分析,将“2.1.1”项分离得到的样品稀释10倍后,用过蠕动泵进样,样品提升速度为0.2 r/min,时间45 s,样品平衡速度0.1 r/min,时间35 s。ICP-MS的相对分子质量为157。

    • 精密量取标准钆对照品1 ml,置50 ml容量瓶中,加0.5%的稀硝酸稀释至刻度,摇匀即得20 mg/L标准对照品储备液。

    • 精密量取钆特酸葡胺注射液1 ml,置于50 ml量瓶中,加去离子水稀释至刻度,摇匀,即得10 mmol/L样品储备液。

    • 取六水合硝酸钆(99.99%)0.45 g,精密称量,置于1 000 ml容量瓶中,加去离子水稀释至刻度,摇匀得到1 mmol/L的中性对照品储备液。

    • 精密吸取“2.2.3”项下对照品储备液1.0 ml,置于10 ml量瓶中,再精密吸取“2.2.2”供试品储备液1 ml,用去离子水稀释至刻度,摇匀。得到1 mmol/L供试品(Gd配合物)+0.1 mmol/L中性对照品混合溶液(Gd3+)。

    • 精密吸取“2.2.3”中性对照品储备液1.0 ml,置于10 ml量瓶中,用去离子水稀释至刻度,摇匀,得到0.1 mmol/L的中性对照品溶液(Gd3+)。精密吸取1 ml上述稀释后的中性对照品储备液得到样本1。精密吸取“2.2.2”供试品储备液1.0 ml,置于10 ml量瓶中,用去离子水稀释至刻度,摇匀,得到1 mmol/L的供试品溶液(Gd配合物)。精密吸取1 ml上述稀释后的供试品储备液得到样本2。取“2.2.4”项下溶液1 ml,作为样本3。将样本1、2、3分别稀释10倍后,照“2.1.1”项下分离条件分离供试品,并间隔2 min收取1管分离后的供试品。得到3批、共45管分离后的供试品。将分离后的供试品按照“2.1.2”项下ICP-MS条件测量其浓度变化,结果见图1。混合对照品质谱中,有两个保留时间的质谱峰,分别对应对照品质谱和供试品质谱相应的位置上的质谱峰,而两个质谱峰之间无干扰。

      图  1  方法专属性考察曲线

    • 精密吸取“2.2.1”项下标准对照品储备液0.5、1.25、2.5 ml,加入到100 ml容量瓶中。用0.5%的稀硝酸稀释至刻度线,摇匀。得到理论浓度为100、250、500 μg/L的标准对照品溶液。再分别取浓度为500和250 μg/L的溶液5 ml置于50 ml容量瓶中,用0.5%的稀硝酸稀释至刻度线,摇匀。得到理论浓度为25、50、100、250、500 μg/L的标准对照品溶液,按上述ICP-MS条件进样测定,以对照品浓度为横坐标(X,μg/L),对照品峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。回归方程:Y=0.001 635X+0.000 000E+000(经过原点),r=1.000。结果表明Gd元素浓度在0~500 μg/L浓度范围内线性关系良好。

    • 精密吸取“2.2.1”项下标准对照品储备液0.2 ml,用0.5%硝酸稀释至40 ml,摇匀。按上述ICP-MS条件进样测定,连续操作5次,测得钆浓度。结果表明,观察峰面积的RSD <10%(n=5),表明仪器精密度良好。结果见表1

      表 1  钆特酸葡胺注射液精密度试验结果

      样品编号测得Gd浓度(μg/L)峰面积RSD(%)
      194.922.69
      298.241.69
      395.432.46
      4104.914.08
      590.563.13
    • 取“2.2.4”项下同一供试品溶液适量,稀释10倍后,按“2.1.1”项下条件进行分离,分别取分离后前10 min和后20 min的溶液,编号为a液和b液。分别精密量取a液、b液各5份,于室温下放置0、2、4、6、12 h,按“2.1.2”项下的条件进样测定。结果显示,a液的RSD为1.826%(n=5),RSD<2%表明分离后的钆配合物12 h内稳定性良好。b液的RSD为1.911%(n=5),表明分离后的钆与EDTA螯合物在12 h内稳定性良好(表2)。

      表 2  钆特酸葡胺注射液稳定性试验结果(n=5)

      室温下放置时间(t/h)测得Gd浓度(μg/L)
      a液b液
      081.184.08
      283.144.17
      481.054.11
      680.413.97
      1279.054.02
    • 取同一批样品(批号:170923BC),精密量取适量,按照“2.2.4”项下方法配成混合溶液适量,稀释10倍后,按“2.1.1”项下条件进行分离,分别取分离后前10 min和后20 min的溶液,编号为a液和b液。分别按“1.1.2”项下条件进样测定。计算混合溶液中Gd3+的实际含量。同法操作重复5次。结果表明,混合溶液中Gd3+的实测含量RSD为1.998%(n=5),RSD<2%(n=5)表明本方法重复性良好,结果见表3

      表 3  钆特酸葡胺注射液重复性试验结果(n=5,mmol/L)

      样品编号Gd3+的理论含量Gd3+的实测含量
      10.10.104
      20.10.106
      30.10.105
      40.10.101
      50.10.102
    • 用空白对照溶液(去离子水),按“2.1.2”项下ICP-MS条件进样测定,连续操作8次,分别测得钆浓度。计算其平均浓度,检测限=测得空白对照的平均浓度×3,测得结果为0.223 μg/L。

    • 用空白对照溶液(0.5%的硝酸),按“2.1.2”项下ICP-MS条件进样测定,连续操作8次,分别测得钆浓度。计算其平均浓度,定量限=测得空白对照的平均浓度×10,测得结果为:0.7443 μg/L。

    • 精密量取已知含量的钆特酸葡胺注射液(批号:170923BC)4份,按照“2.2.2”方法配得10 mmol/L的样品溶液,精密量取1 ml样品溶液置10 ml容量瓶中,用0.5%的硝酸定容,摇匀,得到1 mmol/L的样品溶液。精密量取1 ml稀释后的样品,用0.5%的硝酸再稀释到30 ml。得到5.23 mg/L的样品溶液,称其为①液。精密量取1 ml对照品溶液(1 g/L)置50 ml容量瓶中,用0.5%的硝酸定容,摇匀。同样精密量取5 ml稀释后的对照品溶液,用0.5%的硝酸稀释至20 ml,得到5 mg/L的对照品溶液,称为②液。精密量取2 ml①液置50 ml容量瓶中,用0.5%的硝酸定容,摇匀,得到样品液A。分别精密量取1 ml①液和1 ml②液置50 ml容量瓶中,用0.5%的硝酸定容,摇匀,得到样品液B。得到的两份溶液分别按“2.1.2”项下条件,进样测定并计算加样回收率,反复4次上述步骤。加样回收率=(加样试样测定值-加样测定值)/加样量×100%。计算平均加样回收率,结果见表4

      表 4  加样回收率试验结果(n=4)

      样品理论钆含量
      m/mg)
      标准品理论钆含量
      m/mg)
      样品钆含量
      m/mg)
      混合溶液钆含量
      m/ng)
      加样回收率
      (%)
      平均加样回收率
      (%)
      RSD
      (%)
      104.7100209.23197.7493.1393.191.9
      104.7100215.99199.2491.24
      104.7100206.47196.0292.78
      104.7100220.80206.0195.61
    • 取3批精密量取已知含量的钆特酸葡胺注射液,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下条件测定,通过回归方程计算,结果见表5

      表 5  钆特酸葡胺注射液Gd3+含量测定结果(n=3)

      批号含量(mg/L)RSD(%)
      201609012.631.53
      201609022.601.15
      201609032.641.36
    • 文献[11]报道,采用HPLC-ICP-MS联用,以硝酸作为洗脱液的方法测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+的含量。经查阅相关资料,其选用的金属螯合柱实际为低压柱,无法承受高效液相的压力,并且硝酸的洗脱效率较EDTA要低得多,还具有腐蚀性,对于ICP-MS仪器有一定的损害,因此,该文献所报道方法无法验证。根据配位化学原理,EDTA对Gd3+有很强的螯合性,能快速形成稳定配合物,故笔者选用EDTA作为洗脱流动相,结果表明,此法可迅速将螯合柱上的Gd3+完全洗脱。因为自然界中Gd元素含量稀少,所以本实验运用ICP-MS时受外界干扰小,实验结果可靠。

      本实验建立的测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法操作简便、结果准确、重现性好。研究表明不同批次钆特酸葡胺注射液样品中Gd3+含量变化较小,质量稳定可控。综上所述,此方法可作为测定钆特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法。

参考文献 (11)

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