下载:
下载:
-
组织蛋白酶K(CTSK) 属于半胱氨酸蛋白酶，是细胞内重要的溶酶体酶，在很多组织中有表达，如肺、脑、皮肤、骨骼和甲状腺等。CTSK在体内主要发挥降解骨胶原蛋白、弹性纤维蛋白、甲状腺球蛋白及细胞外基质的作用，与人类多种疾病密切相关，如肿瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纤维化等[2]。CTSK最早发现在破骨细胞特异性高表达，主要发挥降解骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原[2]。基于生物化学和结构分析研究发现CTSK与黏多糖（GAGs)可形成一种复合物，如硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有这种复合物形成下才能更好发挥降解胶原作用[3]。
二至丸是治疗肾阴虚症的经典名方，由女贞子和墨旱莲组成，经考证出自明代吴曼辑所著的《扶寿精方》，收载于2020版《中国药典》，具补益肝肾，滋阴止血功效[4]。药理研究发现二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗变态反应性炎症和植物雌激素样等作用[5]。临床报道，二至丸常用于治疗骨质疏松[6-8]，药理发现二至丸显著降低去卵巢骨质疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我们前期研究发现墨旱莲的正丁醇提取部位和活性成分墨旱莲皂苷IX能显著抑制CTSK的胶原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制组织蛋白酶K的活性成分，故有可能从中筛选组织蛋白酶K抑制剂。本研究采用荧光偏振法考察CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性，荧光光度法考察CTSK与合成荧光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)结合活性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法考察CTSK降解生理底物胶原蛋白和明胶的活性，以期从二至丸不同提取部位和活性成分中筛查具有抑制CTSK活性的抑制剂，最终阐明二至丸抑制CTSK酶活性的物质基础。
-
墨旱莲、酒女贞子药材购自上海华宇药业有限公司, 经海军军医大学生药学教研室韩婷教授鉴定墨旱莲为菊科植物鳢肠 Ecliptaprostrata L. 的干燥地上部分，女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其活性成分异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、熊果酸、齐暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、异去甲基蟛蜞菊内酯、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13等24种标准品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
Z-FR-MCA购自日本WAKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸软骨素A (CSA)购自美国Sigma公司；荧光标记硫酸软骨素A(CSA*)购自日本株式会社Cosmo Bio公司；人I型胶原蛋白(Human collagen I)购自美国Affymetrix公司，牛不溶性I型胶原蛋白(Bovine type I insoluble collagen) 购自生工生物工程(上海)公司。
-
墨旱莲500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮浓缩，冷冻干燥，粉碎得墨旱莲水提取物。酒女贞子按照2020版药典二至丸制备方法，粉碎过80目筛。将酒女贞子粉末500 g与墨旱莲水提取物粉末混匀，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得正丁醇部位提取物。滤渣挥干，按照正丁醇方法依次分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对滤渣进行萃取，冷冻干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。
研究报道二至丸的活性成分，主要包括墨旱莲三萜皂苷类和女贞子环烯醚萜苷类成分，及一些黄酮类、苯乙醇苷类等成分[10-12]。本研究30个成分中墨旱莲皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱莲正丁醇部位经凝胶柱层析分离得到[9]，墨旱莲中蟛蜞菊内酯、异去甲基蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女贞子中异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、熊果酸、齐暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、大黄素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇等成分为购买标准品。
-
二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分别配置40 mg/ml和10 mmol/L的储备溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分别稀释至浓度为25 µg/ml和 25 µmol/ml (DMSO低于１%)，加入黑色荧光96孔板，最终反应容量为0.2 ml。加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(终浓度1 mmol/L)，孵育30 s，实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在96孔板中进行，单孔体积为200 µl。实验设阴性对照组(无抑制剂)，阳性对照组(E-64，活性位点抑制剂)。计算公式：抑制率(%)= 100−(1−Vi /V0)。Vi和V0分别表示存在和不存在抑制剂情况下的荧光信号。
-
将100 µg/ml不同部位或25 µmol/ml有效成分与200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，混匀放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混匀放置15 min，室温下实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长485 nm，吸收光波长520 nm)，所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在黑色荧光96孔板中进行，总体积为100 µl。设置不使用抑制剂（阴性对照）和300 mmol/L NaCl（阳性对照）。CTSK和FP之间的关系使用抑制百分比进行分析，计算公式：抑制率(%)=100− [（100×（FPCTSK/抑制剂/CSA*−FP CSA*）/（FPCTSK/CSA*−FP CSA*）]其中，FPCTSK/抑制剂/CSA*和FPCTSK/CSA*分别是在存在和不存在抑制剂的情况下测定荧光信号。
-
人I型胶原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最终浓度400 nmol/L)、CSA (最终浓度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同浓度潜在抑制剂(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型胶原蛋白的缓冲液，单孔体积50 μl，混匀，28 ℃孵育4 h。取出后加入1μl的 100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用ImageJ 2软件进行定量分析。
-
称取1 mg不溶性牛I型胶原蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1 μmol/L CTSK酶和25 μmol/L潜在抑制剂于40 μl缓冲液中(100 mmol/L醋酸盐缓冲液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物结合活性方法在T0 min测定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，检测T30 min时的CTSK活性。从中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最终300 mmol/L），然后再次检查CTSK活性，记录为T30salt min。计算公式：结合率(%)=[1−(T0 min−T30salt min)/(T0 min−T30 min)]×100%。
-
用Discovery studio 2016软件中的libdock分子对接方法考察活性成分和组织蛋白酶K(1ATK) 蛋白进行刚性对接。利用LibDock得分作为表征化合物与活性位点结合的核心指标。LibDock得分分数越高，小分子与受体结合的活性越高。
-
每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，若有显著性差异(α=0.05)，再采用Student's t检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
-
本研究考察了DMSO浓度(10%、5%、2%和1%)对CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*复合物形成活性高通量筛查方法，及SDS-PAGE胶原降解活性筛选方法的影响。结果发现，10%、5%、2%的DMSO显著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物结合(图1A)和CTSK/CSA*复合物形成活性(图1B)。10%的DMSO显著抑制CTSK的胶原降解，1%和2%的DMSO对胶原降解无明显抑制作用。因此，本研究筛查二至丸的抑制CTSK活性方法将DMSO浓度控制在1%以下。
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
-
对二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 进行了抑制CTSK活性筛选，其中Z-FR-MCA底物结合实验结果显示，二至丸的石油醚部位抑制作用明显，为96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分别为26.1%、50.8%和43.5%（见图2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物对CTSK/CSA*复合物形成的抑制率分别为99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（见图2B），胶原降解活性结果显示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明显，达到100%，石油醚提取部位抑制作用为58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明显，分别为33.1%和6.7%（见图2C和2D）。
图 2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用
-
本研究对30种二至丸中的活性成分进行了体外筛选，结果发现25 μmol/L的墨旱莲皂苷Ⅸ、异毛蕊花糖苷、蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女贞苷、特女贞苷、3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇抑制CTSK/CSA*复合物形成的抑制率超过50%，表儿茶素没食子酸酯为51.2%。而在25 μmol/L时，仅有齐墩果酸、3-0-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇对CTSK与Z-FR-MCA结合活性有超过50%的抑制率，熊果酸为47.1%抑制率。采用libdock技术发现仅有3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇与CTSK活性位点对接有得分。因此，这些超过50%抑制率的二至丸活性成分被认为具有潜在抑制胶原降解活性。 针对以上12种活性成分，进行胶原降解抑制实验，结果显示在100 μmol/L时，墨旱莲皂苷Ⅸ，对胶原降解抑制率达70.3%，女贞苷53.2%，蟛蜞菊内酯达50.1%和表儿茶素没食子酸酯为60.2%。异毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女贞苷、熊果酸、齐墩果酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇均显示无抑制胶原降解活性(表1)。
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 -
不溶性胶原、抑制剂和CTSK共培养15 min，通过检测培养液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，来验证潜在CTSK抑制剂在体外抑制与CTSK的结合实验，结果显示100 μmol/L的墨旱莲皂苷IX（ES-IX）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZG)和蟛蜞菊内酯(WED)抑制率分别为54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (图3)。
图 3 4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用
-
CTSK抑制剂的高通量筛选方法，多采用合成底物Z-FR-MCA结合活性来筛选，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基团, 释放游离的MCA 发色荧光基团, 通过抑制剂引起荧光信号变化差异来检测评价抑制剂活性。基于骨胶原降解需要CTSK与CSA结合发挥作用，采用荧光标记CSA*，形成CTSK/CSA*复合物，其原理为抑制剂与CTSK酶结合形成CTSK/抑制剂/CSA*复合物，导致荧光偏振信号差异，评价抑制剂与CTSK结合活性，可快速、灵敏和准确的判断化合物是否与CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝胶电泳法是常用蛋白质分类技术，将胶原蛋白及其降解产物按照分子量大小迁移，考马斯染色溶液染色，对α1胶原蛋白条带定量，计算胶原蛋白降解率。
二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*复合物形成和胶原降解活性最强，超过95%，但对CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作为CTSK活性位点的合成底物，活性成分对Z-FR-MCA抑制率越高，证明对CTSK的活性位点抑制效率越高。基于Bromme教授提出的非活性位点抑制剂的概念[13]，活性成分具有显著的抑制胶原降解活性，但对活性位点Z-FR-MCA底物无抑制活性，可称为非活性位点 (exosite) 抑制剂。结果发现，二至丸的正丁醇提取部位可显著抑制胶原降解，而对Z-FR-MCA无显著影响，证明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK胶原降解活性的活性成分, 而不影响CTSK 活性位点的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化学成分主要为墨旱莲皂苷类成分和女贞子三萜酸类成分，其中墨旱莲皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)可能是潜在的CTSK非活性位点抑制剂。熊果酸和齐墩果酸具有较强的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位点，而女贞子乙醇提取物、熊果酸、齐墩果酸和墨旱莲的蟛蜞菊内脂均报道显著抑制破骨细胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表达[14-15]，可能通过在细胞内直接作用CTSK酶，使其失去活性。
CTSK是抗骨质疏松药物研发的关键靶标，有报道，中草药尤其是补肾中药含有丰富的治疗骨质疏松的活性物质，但不清楚这些化合物是否能够抑制CTSK活性，或者特异性抑制胶原酶的活性。除了胶原降解活性，CTSK在甲状腺细胞中发挥降解甲状腺球蛋白，释放甲状腺激素[16]，在成纤维细胞中发挥降解纤维蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可进一步考察其对甲状腺球蛋白降解和纤维蛋白降解的作用活性，为中医药开发CTSK抑制剂提供新的思路。
Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan
-
摘要:
目的 考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。 方法 采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位，以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率，和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性，并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。 结果 二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%，石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%，正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%，有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯，对胶原降解抑制率超过50%，其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%，但均与CTSK活性位点分子对接不成功。 结论 二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质，主要存在于正丁醇部位，但活性成分不是活性位点抑制剂，可能通过与其他位点结合，间接抑制CTSK与寡多糖结合，进而降低了CTSK的胶原降解活性。 Abstract:Objective To investigate the active ingredients and components that inhibiting cathepsin K activity in Erzhi Wan, a classic kidney-tonifying formula. Methods Then-butanol, dichloromethane, ethyl acetate and petroleum ether parts and 30 active components in Erzhi Wan were screened by established high throughput fluorescence methods of inhibit the binding activity of CTSK with Z-FR-MCA substrate, the formation of CTSK and chondroitin sulfate A (CSA) complex activity, and the activity of substrate type I collagen degradation by CTSK. Molecular docking and insoluble collagen substrate binding assays were applied to verify the potential CTSK inhibitors. Results The n-butanol and petroleum ether parts of Erzhi Wan inhibited the formation of CTSK and CSA* complex by more than 90%, the petroleum ether part inhibited the binding of CTSK to substrate Z-FR-MCA by more than 90%, the collagen degradation inhibition rate of CTSK in n-butanol part was more than 95% and that in petroleum ether part was 58.6%. Among the 30 active components, 11 showed that the inhibition rate of CTSK and CSA* complex formation was more than 50%, and 5 components with the inhibition rate of Z-FR-MCA binding activity more than 50%. Finally, there were four components including eclalbasaponin Ⅸ, (-)-epicatechin gallate, nuezhenoside and wedelolactone. The inhibition rate of collagen degradation was more than 50%. Eclipta saponin IX inhibited the binding rate between collagen fibers and CTSK, up to 60%, but all of them failed to dock with CTSK active site. Conclusion There are active components that inhibiting cathepsin K in Erzhi Wan, which mainly exists in the n-butanol ingredients, but the active components is not an active-site inhibitor. It might inhibit the binding of CTSK with oligosaccharides by binding to other sites of CTSK, and then reduce the collagen degradation activity of CTSK. -
Key words:
- Erzhi Wan /
- osteoporosis /
- cathepsin K /
- active fraction /
- potential inhibitor
-
近20年来，我国科技论文外流现象逐渐受到我国科技界和决策层的关注。2016年，习近平总书记在“科技三会”上指出，“广大科技工作者要把论文写在祖国的大地上”[1]。2020年2月，国家教育部和科技部联合印发《关于规范高等学校SCI论文相关指标使用，树立正确评价导向的若干意见》的通知，提出将推进改革，遏制广泛存在的“SCI至上”现象。
《中国科技期刊发展蓝皮书（2020）》显示，2010至2019年中国作者向全球SCI贡献了18.06%的论文，而中国的SCI期刊只发表了全球论文的1.72%，而这1.72%的论文的85.06%是中国作者贡献的。高被引论文外流现象更甚，ESI数据库中近10年被引频次最高的1%的论文中，我国有14.3万篇，占16.62%，遗憾的是，其中95%的论文却发表在国外期刊上[2]。大量承载着我国创新研究成果的论文“交钱发出去”，又“付钱买进来”。科研产出的版权归国外出版商所有，学术成果外流现象严重。只有切实落实“把论文写在祖国的大地上”，直接反映在论文数量回流上，建设世界一流科技期刊才有基础，振兴中国科技期刊才有希望。把论文写在祖国的大地上，不仅是对中国科技界价值观转变的要求，也是中国科技期刊掌握科技评价话语权的重要机遇[3]。本文以我国双一流高校发表的药学论文为对象，对2014至2020年间发表在国内期刊上的高被引药学论文进行特征分析，并比较2016年前后，药学论文产出及变化情况，以期了解科技创新与期刊发展的生态关系。
1. 资料来源与文献检索方法
1.1 评价对象
2017年9月，教育部等三部委公布了世界一流大学和世界一流学科建设高校及建设学科名单。按照双一流建设学科名单中“药学”专业进行统计，共获得双一流建设学科“药学”专业高校名单7所，分别为：北京大学、北京协和医学院、复旦大学、上海交通大学、浙江大学、中山大学、暨南大学。以上7所药学专业双一流高校在本文简称“各高校”。
1.2 文献检索
检索四大中文期刊数据库：中国期刊全文数据库、万方数据-数字化期刊群、维普中文期刊服务平台和中国生物医学文献数据库。文献检索方法：作者单位/机构=高校名称；时间范围：2014-01-01至2020-12-31；通过主题/篇名/关键词，将学科范围限定为药学。剔除重复的文献，以及新闻稿、会议纪要、纪念专栏等非研究性文献。英文文献检索Scopus数据库，按“1.1”项下的高校名单，检索2014至2020年发表的药学类期刊论文。
1.3 刊载论文的期刊分区
按照《世界学术期刊影响力指数（WAJCI）年报》评价刊（共13 088种）降序排列，遴选药学学科排名前25%的为Q1区期刊；排名26%～50%的为Q2区期刊；排名51%～75%的为Q3区期刊；剩余的为Q4区期刊。
2. 结果与分析
经汇总得到2014至2020年各高校共发表论文12 028篇。从发文趋势上看，7年间发文量逐年递增，2017至2019年间涨势明显，增幅分别达8.70%、8.97%和14.42%。但2020年各高校发文量均有不同程度下降，原因可能为受新冠病毒肺炎疫情所影响。
2.1 国家倡导前后各高校论文发表情况对比
以2017年为时间节点，对比2014至2016年与2017至2019年，双一流高校作者在国际刊与国内刊上的论文发表情况（见表1）。
表 1 国家倡导前后各高校发文情况比较（篇）分区 2014至2016年 2017至2019年 国际期刊 国内期刊 国际期刊 国内期刊 Q1区 2 165 44 2 876 54 Q2区 1 161 60 1 238 104 Q3区 705 119 875 86 Q4区 525 165 470 136 合计 4 556 388 5 459 380 从表1的合计项可以看出，国际期刊上发文总量为10 015篇，国内期刊发文总量为768篇，两者之比为13.04∶1，各高校药学论文高比例流向了国外期刊。对比2017至2019年与2014至2016年的数据，前一时段发文4 944篇，后一时段发文5 839篇，论文数量增幅明显（18.10%），差异有统计学意义（P<0.05），但是，增量和增比都倾向于国际刊，各高校在国际刊上发文总数增加903篇，增幅为19.82%，在国内刊上发文总数减少8篇，降幅为0.02%。2014至2016年各高校92.15%的论文流向国际刊，2017至2019年93.49%的论文流向国际刊。
2.1.1 国际刊论文数量及分区变化
各高校在国际刊上不仅发文数量明显增加，而且增长集中在Q1区（711篇），增幅为32.84%。Q2区增加77篇，Q3区增加170篇，在Q4区发文减少了55篇，降幅为10.48%。以上数据表明，各高校的药学论文水平不断提高，论文来源期刊的分区情况持续向好。
2.1.2 国内刊论文数量及分区变化
2014至2016年间，Q1区→Q4区论文数量呈递增趋势。2017至2019年间，虽然还是Q4区论文数量最多，但Q2区论文数较前明显增加，在4个分区中占比第二。比较后一时段与前一时段发文篇数发现，Q1区增加10篇，增幅18.52%；Q2区增加44篇，增幅42.31%；Q3区和Q4区减少62篇，降幅21.83%，说明各高校发表的论文质量有所提高。
2.1.3 各高校在国内刊上发表论文汇总
各高校在国内刊发表论文情况见表2。发表论文篇数最多的是北京大学。比较各高校2017至2019年与2014至2016年的合计数据，仅复旦大学的发文量有明显增加，增幅为55.93%；上海交通大学基本持平。复旦大学的增幅主要体现在Q1、Q2区论文数量显著增长，两区之和由24篇增至57篇，增幅为57.89%。其余高校在国内刊的发文总量较前均有所减少。
表 2 2014至2019年各高校在国内刊发表论文篇数统计高校名称 2014至2016年 2017至2019年 Q1区 Q2区 Q3区 Q4区 合计 Q1区 Q2区 Q3区 Q4区 合计 上海交通大学 7 10 11 10 38 8 5 5 21 39 中山大学 10 13 37 22 82 8 16 28 14 66 北京协和医学院 1 1 3 2 7 0 0 0 0 0 北京大学 8 9 30 63 110 13 22 25 46 106 复旦大学 9 15 12 23 59 16 41 11 24 92 暨南大学 1 0 6 18 25 2 10 3 9 24 浙江大学 8 12 20 27 67 7 10 14 22 53 合计 44 60 119 165 388 54 104 86 136 380 2.2 高被引论文分析
2014至2020年间，各高校在国内刊上共发表论文850篇。按照文献的被引频次降序排列，遴选出前10%的文献作为本研究的高被引论文。得到符合条件的高被引论文223篇(表3)，占国内期刊发文总量的26.24%，总被引频次2 410次，篇均被引频次10.81次。高于篇均被引频次均值以上的有4所高校，分别是北京大学、北京协和医学院、上海交通大学和中山大学。
表 3 各高校发表高被引论文情况统计高校名称 论文篇数 被引频次 篇均被引频次 北京大学 76 955 12.57 复旦大学 46 415 9.02 中山大学 34 391 11.50 上海交通大学 20 246 12.30 浙江大学 31 245 7.90 暨南大学 11 96 8.73 北京协和医学院 5 62 12.40 合计 223 2 410 10.81 发表高被引论文数量最多的高校是北京大学，期间共发表了76篇高被引论文，被引频次955次，篇均被引频次12.57次。由表2和表3可见，北京大学的发文总量、高被引论文数量、被引频次总数和篇均被引频次均排名第一，说明北京大学发表的论文质量相对较高。
复旦大学发表高被引论文篇数（46篇）和被引频次总数（415次）均排名第二，但该校论文的篇均被引频次为9.02次（<10.81次），在7所高校中仅排名第五。北京协和医学院虽然只发表了5篇高被引论文，在各高校中数量最少，但被引频次总数达到62次，因此，该校的篇均被引频次排名第二，说明北京协和医学院的高被引论文量少质优。
2.3 各高校高被引论文TOP10统计分析
统计得到各高校在2014至2020年间发表的高被引论文TOP10，即每所高校被引频次最高的10篇论文。其中，北京协和医学院的高被引论文只有5篇。因此，7所高校的高被引论文TOP10共计65篇（简称高被引论文TOP10），占发文总量的7.65%（65/850）。从文章类型统计结果看出，高被引论文TOP10以综述类文章为主，这与国际著名期刊上高被引论文以Reviews为主相符。将高被引论文TOP10按照被引频次字段降序排列，得到7所高校中被引频次最高的5篇论文（表4），北京大学占其中3篇；从发表年份来看，2014年的文献被引频次最高。
表 4 高被引论文TOP5高校名称 论文题目 期刊名称 当年影响因子 被引频次 文章类型 发表年份 北京大学 脂质体药物递送系统的研究进展 中国新药杂志 0.635 80 综述 2014 复旦大学 胆红素代谢及其调节的研究进展 复旦学报(医学版) 0.795 64 综述 2014 北京大学 《中国万古霉素治疗药物监测指南》解读 中国临床药理学杂志 0.809 49 综述 2016 北京大学 地佐辛注射液用于镇痛的随机双盲对照临床试验 中国临床药理学杂志 0.655 48 论著 2014 中山大学 大黄素对高糖培养的GMC增殖、FN表达及p38MAPK的影响 中国药理学通报 1.368 44 论著 2014 2.3.1 作者人数及机构数统计
分别统计高被引论文TOP10的作者人数及机构数量，结果见表5。笔者注意到，复旦大学与中山大学合著的文章“Recent progress in drug delivery”，2019年发表在Acta Pharmaceutica Sinica B上，被引频次14次，该刊当年影响因子2.362。该文有14名作者、11个机构参与撰写。说明英文文献的作者人数和机构数量明显高于中文文献。有研究发现，多位研究者及多个研究机构共同开展学术活动，合著论文，有助于开拓思路、共享资源、解决复杂问题和扩大学术成果的传播范围。文献的作者人数和被引频次存在相关性，且协同合作产出的科研成果具有更高的影响力。
表 5 各高校高被引论文TOP10的作者人数及机构数统计作者人数 论文篇数（%） 机构数 论文篇数（%） 独立作者 5（7.69） 单一机构 15（23.08） 2～4人 31（47.69） 2个机构 25（38.46） 5～7人 23（35.38） 3个机构 15（23.08） ≥8人 6（9.23） ≥4个机构 10（15.38） 2.3.2 发表年份统计
对各高校高被引论文TOP10的发表年份进行统计，发现引用2014年文献的最多，为21篇，次之是2015年18篇，再次是2016年9篇。引用2014至2016年的文献之和为48篇，占施引文献总数的73.85%，而引用2017至2020年所发表文献共17篇，占施引总数的比例仅为26.15%。原因可能在于论文从发表到被引用具有一定的滞后性，越早发表的文献累积引用次数可能越多。
2.3.3 刊载高被引论文TOP10的期刊分析及影响因子分析
（1）期刊分析：按照刊载高被引论文篇数进行降序排列，同种期刊按照发表年份升序分列，共涉及8种刊登1篇以上高被引TOP10论文的期刊。其余期刊均只刊载1篇高被引论文，期刊集中趋势并不明显，见表6。笔者发现4种期刊存在同种现象，例如，《现代生物医学进展》上刊登的2篇高被引论文均来自上海交通大学，《中国现代应用药学》上的4篇高被引论文均来自浙江大学。该现象表明，有些研究者与某些期刊可能建立了认同感，形成了固定投稿的合作意愿。
表 6 刊载各高校高被引论文TOP10的期刊及其影响因子期刊名称 发表
年份当年影响因子 论文
篇数高校名称 药学学报 2014 1.519 3 北京大学、
上海交通大学、
中山大学2015 1.593 1 北京大学 2016 1.684 1 复旦大学 2017 1.435 1 复旦大学 2019 1.535 1 暨南大学 中国现代应用药学 2015 0.926 3 浙江大学 2016 1.045 1 浙江大学 中国临床药理学杂志 2014 0.655 1 北京大学 2016 0.809 1 北京大学 2019 1.458 1 暨南大学 中国药房 2014 0.489 1 暨南大学 2015 0.473 1 中山大学 中国新药杂志 2014 0.635 2 北京大学 现代生物医学进展 2015 0.470 1 上海交通大学 2016 0.545 1 上海交通大学 中国药理学通报 2014 1.368 1 中山大学 2016 1.395 1 中山大学 Acta Pharmaceutica Sinica B 2019 2.362 1 复旦大学与
中山大学合著（2）影响因子分析：影响因子（impact factor，IF）与期刊的影响力、期刊质量和论文质量有直接关联，是评价期刊学术影响力的重要依据。对刊载上述论文的期刊IF所在区间进行统计，发现多数期刊IF<1,共39篇，占60%，IF≥2的只有4篇，仅占6.15%，以中山大学发表在IF≥2的期刊上高被引论文数量最多（表7）。以上结果表明，我国药学类期刊IF整体偏低，笔者参考了中国药学会主办的18种药学类期刊的IF水平[4]后认为，这与药学学科属性有一定关系。通过查阅《中国学术期刊国际引证年报（自然科学与工程技术）》[5]发现，仅《分析化学》《中草药》《药学学报》《无机化学学报》4本药学类期刊入围“2020中国国际影响力优秀学术期刊名单”（4/175）。药学学科的国际影响力与我国其他优势学科相比，存在一定差距。IF值偏低也可能与文献被引用的滞后性有关，越早的文献被引用的累积概率越高。从表6可以看出，8种期刊中的5种其IF值随时间推移呈上升趋势，2种期刊只涉及当年数据，无可比性。
表 7 高被引论文TOP10的期刊影响因子统计 [篇(%)]高校名称 IF<1 1≤IF<2 IF≥2 北京大学 6 4 0 北京协和医学院 4 1 0 复旦大学 5 4 1 暨南大学 7 3 0 上海交通大学 8 2 0 浙江大学 5 4 1 中山大学 4 4 2 合计 39（60.00） 22（33.85） 4（6.15） 2.3.4 有共性的论文内容
值得注意的是，复旦大学的高会乐和蒋新国发表在《药学学报》上的两篇论文：“肿瘤靶向递药新策略的研究进展”（2016）和“新型药物递释系统的研究进展”（2017），均入选高被引论文TOP10，前者综述目前已有的肿瘤靶向递药策略,认为环境响应性和主动靶向性仍然是肿瘤靶向领域的热点，研究更为灵敏和特异的响应性材料将显著改善现有纳米材料面临的问题。后者对目前热点关注的新型递药系统进行综述,认为新型药物递释系统对提高药物的治疗效果、降低毒副反应具有重要作用,是药剂学领域的重要研究方向。两篇文章在研究内容上具有延续性，关注药剂学和材料学领域的热点，为研究者提供了有价值的参考。
3. 讨论
3.1 科技创新关乎国家安全利益
尽管自2016年起有关部门相继出台政策，但由于未建立起客观可度量的论文生产和评价生态体系，论文外流现象一时难以改变。从国家利益看，我国重要机构和重要学术创新成果在国外期刊首发，难以第一时间服务于我国的科技创新，科研人员难以及时获取信息和实现成果转化。外流论文中不少是国家资助的基金论文，作者甚至是重要科研工作的主要参与者，外流论文的“带出”效应，存在国家安全利益隐患[6]。科研人员应当尽快转变观念，优先考虑将具有自主创新的研究成果发表在我国高水平科技期刊上。实际上真正有创新的、高质量的研究论文，无论发表在国际刊，还是国内刊上，都会在世界范围被快速传播和引用，也会被国内和国际科技界公认。1965年9月，我国完成人工全合成牛胰岛素结晶，有力地证明了蛋白质的一级结构决定其高级结构的科学论断。这是蛋白质合成和蛋白质结构与功能关系研究中的重大发现。次年，该研究成果发表在《化学通报》上，被世界各国争相引用和转载[7]。眼下的中国科技期刊还无法及时、有效地吸引大量的高水平科技论文，但我们必须不断调整反映自主科技创新能力与科技生态形成的互融共生关系，促进科技界与科技期刊界的生态融合。
3.2 加强学科建设与评价体系建设
在加强药学学科建设方面，应不断进行科研评价体系的优化，将考核和绩效评价的重点放在论文等科研成果的学术影响力而非数量上。通过不断加深国际学术交流与合作的方式，让研究人员接触国际前沿的科研思潮，开启科研新思路，找到全新的突破点，提升科研队伍水平和研究成果的质量[8]。
在评价机制方面，应当尽快建立我国的科技评价体系，这是中国科技期刊界的使命与机遇。随着“中国科技期刊卓越行动计划”深入推进，一批国内优秀期刊获得国家大力扶持，我国科技期刊的影响力将明显提升，科研评价导向也将随之发生转变。治理“唯SCI”乱象，并不是“去SCI”，而是各级单位应鼓励作者在国内高水平期刊上发表论文。同时，健全科学的人才分类评价体系，解决评价标准“一刀切”问题。从事基础研究的科研人员要善于在全球话语体系中与强手同台对话，不断增强国际科学舞台的显示度，积极倡导其发表论文，争夺国际话语权[6]；从事应用研究的人员，可以“不唯论文”，根据岗位性质做好科学研究。
3.3 加快双一流高校建设推进产业创新
加快建设一批高水平大学，是我国加速科技创新、建设国家创新体系的需要，更是深入推进产教研结合战略的重要抓手。发挥双一流高校对科技创新建设的引领作用，全面优化高校科研布局。首先，要加快形成基础研究、应用基础研究、产业技术开发和成果转化的完整创新链，形成全面系统的高校创新体系；其次，要鼓励高校加强基础研究和前沿科技的探索，提升原创能力，推动高校科技创新与经济社会、国防建设发展实际需求相结合，深入推进科技成果转化；深化校地合作，引导和鼓励高校主动服务地方和军队发展，为优势产业、战略性新兴产业乃至未来产业发展提供强大的智力支撑，持续推进企业、产业和国家自主创新能力的提升[9]。
-
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
A. Z-FR-MCA活性；B.CTSK/CSA*复合物；C.胶原降解活性；*P<0.05, ***P<0.001，与不加DMSO组比较
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 
下载: 导出CSV
-
[1] CALIÒ A N, BRUNELLI M, GOBBO S, et al. Cathepsin K: a novel diagnostic and predictive biomarker for renal tumors[J]. Cancers,2021,13(10):2441. doi: 10.3390/cancers13102441 [2] DAI R C, WU Z T, CHU H Y, et al. Cathepsin K: the action in and beyond bone[J]. Front Cell Dev Biol,2020,8:433. doi: 10.3389/fcell.2020.00433 [3] LI Z Q, HOU W S, ESCALANTE-TORRES C R, et al. Collagenase activity of cathepsin K depends on complex formation with chondroitin sulfate[J]. J Biol Chem,2002,277(32):28669-28676. doi: 10.1074/jbc.M204004200 [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部: 2020年版[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. [5] 梁文娜, 李西海, 胡柳, 等. 二至丸抑制绝经后骨质疏松大鼠骨代谢紊乱的作用机制研究[J]. 中医正骨, 2017, 29(11):1-7,14. doi: 10.3969/j.issn.1001-6015.2017.11.001 [6] 胡科. 二至丸对骨质疏松性股骨颈骨折术后愈合及髋关节功能的影响[J]. 现代中西医结合杂志, 2017, 26(4):384-386. doi: 10.3969/j.issn.1008-8849.2017.04.014 [7] 俞益火, 陈久毅, 王建. 二至丸治疗绝经后骨质疏松症的疗效观察[J]. 中国中医骨伤科杂志, 2011(4):42-43. [8] 蔡秀江, 黄美艳, 丁安伟, 等. 二至丸考源及药理作用研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(23):272-275. doi: 10.3969/j.issn.1005-9903.2011.23.080 [9] 蒋益萍, 吴岩斌, 秦路平, 等. 墨旱莲组分中组织蛋白酶K非活性位点抑制剂研究[J]. 药学学报, 2017, 52(6):936-942. doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1234 [10] 钟询龙, 王若伦, 段炼, 等. 基于UPLC/Q-TOF-MS技术分析女贞子与墨旱莲配伍协同增效的物质基础[J]. 中国医院药学杂志, 2017, 37(19):1887-1891. doi: 10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2017.19.02 [11] 李雯, 庞旭, 韩立峰, 等. 中药墨旱莲化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(17):3498-3505. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20180625.001 [12] 刘美红, 邹峥嵘. 女贞子化学成分, 药理作用及药动学研究进展[J]. 热带亚热带植物学报, 2022(003):030.446-460. [13] SHARMA V, PANWAR P, O'DONOGHUE A J, et al. Structural requirements for the collagenase and elastase activity of cathepsin K and its selective inhibition by an exosite inhibitor[J]. Biochem J,2015,465(1):163-173. doi: 10.1042/BJ20140809 [14] XU D, LYU Y, CHEN X W, et al. Fructus Ligustri Lucidi ethanol extract inhibits osteoclastogenesis in RAW264.7 cells via the RANKL signaling pathway[J]. Mol Med Rep,2016,14(5):4767-4774. doi: 10.3892/mmr.2016.5849 [15] LIU Y Q, HONG Z L, ZHAN L B, et al. Wedelolactone enhances osteoblastogenesis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway but suppresses osteoclastogenesis by NF-κB/c-fos/NFATc1 pathway[J]. Sci Rep,2016,6:32260. doi: 10.1038/srep32260 [16] TEPEL C, BRÖMME D, HERZOG V, et al. Cathepsin K in thyroid epithelial cells: sequence, localization and possible function in extracellular proteolysis of thyroglobulin[J]. J Cell Sci, 2000, 113 Pt 24: 4487-4498. [17] VASSALLE C, IERVASI G. Cathepsin K: a classical bone biomarker in cardiovascular disease: the heart is not alone anymore[J]. Atherosclerosis,2013,228(1):36-37. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2013.01.042 期刊类型引用(0)
其他类型引用(3)
-
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3763
- HTML全文浏览量: 1399
- PDF下载量: 18
- 被引次数: 3
