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METRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年,本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为Subfatin[1]。10年来,我们对METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2];肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3],且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4];此外,METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5],并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近,我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中,我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索,并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。
尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体METRNL治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后,血清METRNL在15 min后急剧升高(226 ng/ml),接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。
因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具,并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。
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鼠尾DNA提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 × PrimeScript RT Master Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin抗体( AT819,碧云天公司);通用型RNA提取试剂盒Ⅱ(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒(DY7867-05,R&D system公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗METRNL抗体(ab235775)购自Abcam公司。
LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司);TP600PCR仪(Takara公司);5200S化学发光分析系统(Tanon公司)。
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人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(24±2)℃,相对湿度为40%~60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制(12 h照明、12 h黑暗)。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm,剪碎,按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后,对目的基因进行PCR扩增,各引物序列见表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔6 μl,电泳条件为100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心:4 ℃,3000×g,15 min,分离血清,储存至−80 ℃超低温冰箱。
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使用RNA提取试剂盒提取组织RNA,将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验,各引物序列见表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管,离心:12000 × g,20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液,97 ℃变性10 min得到蛋白样品。
使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用PVDF膜进行转膜,转膜条件为100 V,60 min。
转膜结束后,使用快速封闭液封闭15 min,之后使用1×TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入一抗(1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用1 × TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入二抗孵育液(1∶2 000稀释)常温孵育1 h,用1 × TBST缓冲液洗去二抗,5 min × 4次,结束后即可进行扫膜。
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使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的METRNL水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。
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实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。
Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene
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摘要:
目的 构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。 方法 基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。 结果 R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。 结论 R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。 Abstract:Objective To generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene. Methods Based on Cre-loxP system, Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice(R26-LSL-METRNL+/-)to generate R26-L-METRNL+/- mice. The genotypes of the offsprings were identified, and tissues of the blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, white adipose and muscle were collected. The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR, western blot and enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with wild type control mice, human METRNL in R26-L-METRNL+/- mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues, with abundant METRNL protein in blood. Conclusion The mouse model overexpressing human METRNL gene(R26-L-METRNL+/- mouse)was successfully constructed. -
Key words:
- METRNL /
- systemic overexpression /
- mouse
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表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
[1] LI Z Y, ZHENG S L, WANG P, et al. Subfatin is a novel adipokine and unlike Meteorin in adipose and brain expression[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(4):344-354. doi: 10.1111/cns.12219 [2] LI Z Y, SONG J, ZHENG S L, et al. Adipocyte metrnl antagonizes insulin resistance through PPARγ signaling[J]. Diabetes, 2015, 64(12):4011-4022. doi: 10.2337/db15-0274 [3] LI Z Y, FAN M B, ZHANG S L, et al. Intestinal Metrnl released into the gut lumen acts as a local regulator for gut antimicrobial peptides[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(11):1458-1466. doi: 10.1038/aps.2016.70 [4] ZHANG S L, LI Z Y, WANG D S, et al. Aggravated ulcerative colitis caused by intestinal Metrnl deficiency is associated with reduced autophagy in epithelial cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2020, 41(6):763-770. doi: 10.1038/s41401-019-0343-4 [5] XU T Y, QING S L, ZHAO J X, et al. Metrnl deficiency retards skin wound healing in mice by inhibiting AKT/eNOS signaling and angiogenesis[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(9):1790-1800. doi: 10.1038/s41401-023-01090-x [6] HONG C, WANG Z, ZHENG S L, et al. Metrnl regulates cognitive dysfunction and hippocampal BDNF levels in D-galactose-induced aging mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(4):741-751. doi: 10.1038/s41401-022-01009-y [7] ZHENG S L, LI Z Y, SONG J, et al. Endothelial METRNL determines circulating METRNL level and maintains endothelial function against atherosclerosis[J]. Acta Pharm Sin B, 2023, 13(4):1568-1587. doi: 10.1016/j.apsb.2022.12.008 [8] AMANO Y, NONAKA Y, TAKEDA R, et al. Effects of electrical stimulation-induced resistance exercise training on white and brown adipose tissues and plasma meteorin-like concentration in rats[J]. Physiol Rep, 2020, 8(16):e14540. [9] RAO R R, LONG J Z, WHITE J P, et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis[J]. Cell, 2014, 157(6):1279-1291. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.065 [10] USHACH I, ARREVILLAGA-BONI G, HELLER G N, et al. Meteorin-like/meteorin-β is a novel immunoregulatory cytokine associated with inflammation[J]. J Immunol, 2018, 201(12):3669-3676. doi: 10.4049/jimmunol.1800435 [11] JUNG T W, LEE S H, KIM H C, et al. METRNL attenuates lipid-induced inflammation and insulin resistance via AMPK or PPARδ-dependent pathways in skeletal muscle of mice[J]. Exp Mol Med, 2018, 50(9):1-11. [12] REBOLL M R, KLEDE S, TAFT M H, et al. Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase[J]. Science, 2022, 376(6599):1343-1347. doi: 10.1126/science.abn3027 [13] LU Q B, DING Y, LIU Y, et al. Metrnl ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy[J]. J Adv Res, 2023, 51:161-179. doi: 10.1016/j.jare.2022.10.014