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METRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年,本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为Subfatin[1]。10年来,我们对METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2];肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3],且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4];此外,METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5],并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近,我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中,我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索,并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。
尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体METRNL治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后,血清METRNL在15 min后急剧升高(226 ng/ml),接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。
因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具,并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。
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鼠尾DNA提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 × PrimeScript RT Master Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin抗体( AT819,碧云天公司);通用型RNA提取试剂盒Ⅱ(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒(DY7867-05,R&D system公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗METRNL抗体(ab235775)购自Abcam公司。
LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司);TP600PCR仪(Takara公司);5200S化学发光分析系统(Tanon公司)。
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人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(24±2)℃,相对湿度为40%~60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制(12 h照明、12 h黑暗)。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm,剪碎,按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后,对目的基因进行PCR扩增,各引物序列见表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔6 μl,电泳条件为100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心:4 ℃,3000×g,15 min,分离血清,储存至−80 ℃超低温冰箱。
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使用RNA提取试剂盒提取组织RNA,将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验,各引物序列见表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管,离心:12000 × g,20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液,97 ℃变性10 min得到蛋白样品。
使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用PVDF膜进行转膜,转膜条件为100 V,60 min。
转膜结束后,使用快速封闭液封闭15 min,之后使用1×TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入一抗(1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用1 × TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入二抗孵育液(1∶2 000稀释)常温孵育1 h,用1 × TBST缓冲液洗去二抗,5 min × 4次,结束后即可进行扫膜。
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使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的METRNL水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。
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实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。
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本研究基于前期构建好的人METRNL基因条件性过表达小鼠(简称为R26-LSL-METRNL+/-小鼠)和Cre-LoxP技术,最终获得全身过表达人METRNL基因小鼠(简称为R26-L-METRNL+/-小鼠),具体构建策略如图1所示。
R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建而成,即在其中一个Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA表达框,且该表达框的终止密码子Stop两侧插有同向LoxP位点,可基于Cre-loxP系统在Cre酶的作用下,将LoxP位点之间的序列切除,只留下一个LoxP位点,最终达到人METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中,“+”表示有外源基因表达框的插入,“-”表示无外源基因表达框插入。
Dppa3-Cre小鼠是由Dppa3基因启动子介导Cre重组酶在全身表达的工具鼠,将R26-LSL-METRNL+/-小鼠和Dppa3-Cre小鼠杂交,可获得R26-L-METRNL+/-小鼠,具体繁殖方法如图2所示。其中,野生对照小鼠简写为R26-WT,表示在Rosa26位点没有外源人METRNL基因表达框的插入。
在繁殖过程中进行基因型鉴定时,需确认外源人METRNL基因表达框、终止密码子Stop和Dppa-Cre基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定,外源性表达框阳性条带为699 bp,对应野生型序列条带为996 bp,终止密码子Stop阳性条带为408 bp,Cre基因阳性条带为100 bp。如图3所示,泳道1为R26-LSL-METRNL+/-小鼠,泳道2为R26-L-METRNL+/-小鼠,泳道3为R26-WT小鼠,泳道4为R26-L-METRNL+/-Cre小鼠,泳道5为R26-WT;Cre小鼠。
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为验证R26-L-METRNL+/-小鼠是否存在人METRNL基因过表达,本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中人METRNL mRNA的表达情况。如图4所示,以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA表达量为1,肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和24 816.5。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织mRNA水平上实现了人METRNL基因过表达。
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接着,本研究提取各组织的蛋白,使用蛋白免疫印迹实验方法验证R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人METRNL蛋白表达情况。在该实验中,所用METRNL抗体可同时抗人和小鼠的METRNL蛋白。如图5所示,METRNL蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于R26-WT小鼠,而在肾组织中METRNL抗体的结合效果不佳,且并未发现两组小鼠肾METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示,R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人METRNL基因过表达。
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由于METRNL为分泌性蛋白,本研究最后使用ELISA方法测定R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人METRNL蛋白水平。如图6所示,可成功检测到R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人METRNL,浓度在1 100.3~1 579.3 pg/ml,而在R26-WT小鼠血液中检测不到人METRNL。该结果说明,R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,提示R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人METRNL基因过表达。
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本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖,最终获得R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框,不同的是在R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除,因此R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因,因此在进行实时荧光定量PCR实验时,使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地,在ELISA实验中,使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体,因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体,而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示,R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达,虽然各组织的表达量有所波动,但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示,在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平,但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多,可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外,我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异,并且两组条带都非常微弱,为确证实验结果,我们进行了重复实验,得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高,导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平,本研究结果提示R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白,而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白,说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人METRNL,并可以成功分泌至血液中。同时,该实验提示,本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好,可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。
在小鼠培育过程当中,尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式,采用R26-L-METRNL+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种,基于孟德尔遗传定律,后代鼠中R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%,但实际中,我们发现该小鼠的得率仅为15%左右,远低于理论值。这一现象非常有趣,因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型,均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象,而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关,值得我们进一步研究。
Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene
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摘要:
目的 构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠)。 方法 基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。 结果 R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠。 结论 R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。 Abstract:Objective To generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene. Methods Based on Cre-loxP system, Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice(R26-LSL-METRNL+/-)to generate R26-L-METRNL+/- mice. The genotypes of the offsprings were identified, and tissues of the blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, white adipose and muscle were collected. The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR, western blot and enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with wild type control mice, human METRNL in R26-L-METRNL+/- mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues, with abundant METRNL protein in blood. Conclusion The mouse model overexpressing human METRNL gene(R26-L-METRNL+/- mouse)was successfully constructed. -
Key words:
- METRNL /
- systemic overexpression /
- mouse
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炎症泛指机体受到创伤或病原体感染等刺激后所产生的生理反应,主要表现为疼痛、红肿、发热等[1]。通常情况下,机体受到创伤等刺激后,所产生的炎症反应是一种生理性保护反应,有益于机体损伤的修复[2-3],但当机体内的抗炎系统过于活跃时,会引起自身免疫系统紊乱,对机体正常的细胞及组织进行攻击,如系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等免疫疾病[4]。目前,临床上常用的抗炎药物主要分为甾体类抗炎药(SAIDs)、非甾体类抗炎药(NSAIDs)及免疫调节药,但这几类药物多具有副作用[5-7],因此,新型抗炎药物的研发具有极高的科研前景和社会价值。豆豉姜是樟科植物山鸡椒Litsea cubeba(Lour.)Pers的根及根茎,被傣医学及中医作为广泛的民间方剂,多用于祛风散寒、息肝风、消肿、治风湿痹痛的治疗。前期课题组提取分离得到新型的二苄基丁烷型木脂素9,9’-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5’-二甲氧基开环异落叶松树脂酚(LCA)化学结构如图1所示,并发现其具有改善类弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型中炎性症状的疗效[8],因此,课题组推测LCA是豆豉姜中具有抗炎活性的天然化合物,故采用小鼠耳肿胀和棉球肉芽肿模型及RAW264.7细胞实验,对其抗炎作用进行研究。
1. 材料
1.1 实验动物
二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验模型:5周龄SPF级雄性昆明小鼠,体重:(20±2)g;大鼠棉球肉芽肿实验:4周龄SPF级雄性SD大鼠,体重:(120±10)g。动物由海军军医大学实验动物中心提供,并饲养于海军军医大学药学院动物房,室温控制为24 ℃,12 h光照+12 h黑暗,水及食物充足供应。RAW264.7(海军军医大学药学院生药学教研室)。
1.2 试剂与器材
LCA(海军军医大学药学系有机化学教研室合成及鉴定);吲哚美辛(海军军医大学附属长海医院);二甲苯、水合氯醛、羧甲基纤维素钠CMC-Na、对氨基苯磺酸、磷酸、N-α-萘乙二胺(中国医药集团);棉球(中国朝阳公司);ELISA试剂盒(中国联科公司);iNOS、COX-2、GAPDH抗体及二抗(CST,USA)。分析天平(MettlerToledo,USA);CO2恒温细胞培养箱(Sanyo,Japan);ELx 800酶标仪(Fisher,US);凝胶成像仪(Tanon-5200 multi,中国上海)。
2. 方法
2.1 动物实验
2.1.1 动物模型建立及处理
小鼠耳廓肿胀模型建立:将60只5周龄健康雄性昆明鼠安置于动物实验中心适应1周,按体重随机分为4组,各10只,组别标记为:模型组;LCA组(20、40 mg/kg);吲哚美辛组(8 mg/kg)。给药以灌胃的形式每日一次,模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续3 d灌胃,在末次给药1 h后,将二甲苯以0.05 ml/只剂量均匀涂布于小鼠右耳廓的双面,左耳不做处理,连续刺激45 min后处死小鼠,用打孔器分别于左右耳廓同一位置打下圆形耳片[9],称重,用于计算比较耳肿胀程度及耳肿胀抑制率(%)。
大鼠棉球肉芽肿模型建立:将20只4周龄健康雄性SD大鼠安置于动物实验中心适应1周,按体重随机分为4组:模型组;LCA组(20、40 mg/kg);吲哚美辛组(5 mg/kg)。用水合氯醛对大鼠进行麻醉,于左右两边腋窝下切开一小口,将2个灭菌棉球(20 mg)分别植入小鼠左右腋窝,缝合后第2天给药。且以灌胃的形式每日一次,模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续7 d[10-11]。第8天处死大鼠,将腋下棉球及附着的肉芽组织剥离,称重,用于计算比较干湿重及抑制率。
2.1.2 动物指标测定
耳肿胀度=右耳片重量-左耳片重量
耳肿胀抑制率(%)=(模型组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/模型组平均耳肿胀度×100%
平均棉球肉芽肿重量=(右侧棉球肉芽肿重量+左侧棉球肉芽肿重量)/2
棉球肉芽肿抑制率(%)=(模型组平均棉球肉芽肿重量-给药组平均棉球肉芽肿重量)/模型组平均棉球肉芽肿重量×100%
2.2 RAW264.7细胞实验
2.2.1 细胞培养
RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)用DMEM高糖完全培养基(10% DMEM+90% FBS+1%双抗)培养于37 ℃恒温细胞培养箱中。
2.2.2 细胞增殖检测
将RAW264.7细胞以1×103个/孔接种于96孔板,完全培养基培养24 h,弃上清液,给予不同浓度的LCA培养液(3、1.5、0.75和0.375 μmol/L),并设置空白对照组,每组5个复孔,培养24 h,采用MTT法测定LCA对小鼠单核巨噬细胞的增殖作用。
2.2.3 炎症因子水平测定
将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于24孔板,24 h后弃上清液,脂多糖(LPS)组和LCA组中加入1 ml含2 μg/ml LPS的完全培养基,刺激2 h,于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基,给药组加入各浓度LCA(1.5、0.75和0.375 μmol/L)的完全培养基,作用24 h后,测NO含量:取100 μl上清液与100 μl Griess试剂(A液:对氨基苯磺酸0.1 g,加5%磷酸10ml;B液:N-α-萘乙二胺0.01 g,加10ml蒸馏水,等体积混合)混合避光显色30 min,用酶标仪于540 nm处测各孔吸光度(A)值;测TNF-α:取上清液,根据ELISA试剂盒说明书步骤测量上清液中炎症因子TNF-α的含量。
2.2.4 炎症相关蛋白表达检测
将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于6孔板,细胞贴壁后,处理组(LPS组、LCA组)中加入1ml含2 μg/ml LPS的完全培养基,刺激2 h,于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基,给药组加入各浓度LCA(1.5、0.75和0.375 μmol/L)的完全培养基,作用24 h后,细胞裂解提取蛋白并定量,蛋白变性后SDS-PAGE凝胶电泳分离后,转膜,封闭,依次用iNOS,COX-2及GAPDH于4 ℃孵育过夜,用洗膜液(TBST)清洗3次后,二抗室温孵育1 h,TBST洗涤后,用化学发光试剂盒于凝胶成像仪中显影拍片。
2.3 统计分析
本实验指标均为定量数据,数据以(
$\bar{x}\pm s$ )形式表示。多组定量数据的比较,采用单因素方差分析,方差分析检验后两两比较采用Dunnett's t-test法。采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析。结果以P<0.05、P<0.01表示差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 LCA对小鼠耳肿胀的影响
如表1所示,与模型组对比,吲哚美辛(8 mg/kg)可抑制由二甲苯造成的小鼠耳廓肿胀(P<0.05),抑制率为29.80%;LCA(40 mg/kg)组显著抑制小鼠耳廓肿胀度(P<0.01),抑制率为37.41%,而LCA(20 mg/kg)组对小鼠耳廓肿胀度的抑制无统计学意义(P>0.05)。
表 1 LCA对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n=10,$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 肿胀度(m/mg) 抑制率(%) 模型组 3.02±0.63 — LCA组(20 mg/kg) 2.52±0.29 16.56 LCA组(40 mg/kg) 1.89±0.54** 37.41 吲哚美辛组(8 mg/kg) 2.12±0.61* 29.80 *P<0.05,**P<0.01,与模型组比较。 3.2 LCA对大鼠棉球肉芽肿的影响
如图2,模型组大鼠棉球肉芽肿体积较大且颜色鲜红,吲哚美辛组的棉球肉芽肿体积小且颜色浅,而LCA组的棉球肉芽肿在色泽和大小上均有别于模型组。数据分析显示(表2、表3),与模型组相比,阳性药组吲哚美辛明显抑制大鼠的棉球肉芽肿(P<0.001),且干重、湿重的抑制率分别为48.73%和44.19%;LCA高剂量组也可明显减少棉球肉芽肿的干重及湿重(P<0.01),且抑制率达到23.89%和29.90%。
表 2 LCA对大鼠棉球肉芽肿湿重的影响(n=5,$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿湿重(m/mg) 抑制率(%) 模型组 300.1±53.26 — LCA组(20 mg/kg) 256.0±36.36 14.70 LCA组(40 mg/kg) 228.4±51.16*** 23.89 吲哚美辛组(5 mg/kg) 167.5±15.74*** 44.19 ***P<0.001,与模型组比较。 表 3 LCA对大鼠棉球肉芽肿干重的影响(n=5,$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿干重(m/mg) 抑制率(%) 模型组 48.1±10.05 — LCA组(20 mg/kg) 42.32±10.19 12.05 LCA组(40 mg/kg) 33.73±7.10** 29.90 吲哚美辛组(5 mg/kg) 24.67±7.39*** 48.73 **P<0.01,***P<0.001,与模型组比较。 3.3 LCA对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响
如图3所示,LCA的安全剂量不高于3 μmol/ml,且在0.75和1.5 μmol/ml浓度下显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α浓度,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
3.4 LCA对炎症相关的蛋白表达的影响
如图4所示,LCA在1.5 μmol/ml浓度下显著抑制了炎症相关蛋白iNOS、COX-2蛋白的表达(P<0.001)。
4. 讨论
据报道[12],许多从中药中提取的活性天然化合物可以达到抗炎效果,包括黄芩苷、青藤碱和大黄素等,多为甘草次酸酰胺类衍生物。LCA不同于这些抗炎药物,它具有新颖的二苄基丁烷型结构,本研究从体内、体外两方面对它进行较为系统的抗炎药效评价。
二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型是评价药物体内抗炎活性的急性炎症模型之一[13],本实验模型组中二甲苯作为致炎剂刺激小鼠耳廓皮肤,促进血管舒张、增加血管通透性致使炎性物质渗出,耳片重量明显高于未经处理的耳片重量,LCA组能明显改善小鼠耳部的炎性渗出及肿胀程度,且高浓度组的抑制率高于阳性药吲哚美辛组(由于吲哚美辛高浓度有强烈的胃肠道反应,故根据临床用药剂量换算出实验动物的剂量,并参考相关文献确定用药量[13],即8 mg/kg),表明LCA对急性炎症有显著作用。在慢性炎症期,由于巨噬细胞和纤维母细胞等增生而形成肉芽组织,棉球肉芽肿实验可模拟炎症病理过程中炎性细胞浸润和肉芽组织的增生[14]。结果显示LCA降低棉球肉芽肿的湿重与干重,表明LCA可以控制慢性炎症过程中炎性渗出物的转移,同时抑制棉球外侧小血管和结缔组织的增生,证明LCA可以减少慢性炎症进程中肉芽组织的形成。结合上述两个动物实验可知LCA对急性炎症以及慢性炎症都具有一定的抑制作用。
炎症的普遍特征是病灶区域有大量炎症细胞的浸润,并释放大量炎症因子和介质,如IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素(PG)、组织胺和NO等。其中,NO可激活NF-κB信号通路,诱导促炎因子(IL-6、TNF-α等)的分泌,引起机体组织损伤以及血管扩张;TNF-α可刺激细胞免疫中T细胞产生炎症因子,进而诱导炎症的加重和扩大。iNOS可介导产生的大量NO并参与炎症反应;COX-2介导产生的前列腺素与慢性炎症的发展和持续有关,致使白细胞聚集和浸润,引起微血管内皮细胞的损伤。在本研究中,LPS刺激后,RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α含量,以及细胞内iNOS和COX-2蛋白水平明显增高,LCA浓度为1.5 μmol/ml时显著抑制激活状态下NO和TNF-α炎症介质的分泌,同时下调iNOS及COX-2蛋白的表达水平。由此进一步证实LCA具有抗炎作用。然而,LCA抗炎的具体作用机制尚不明确,有待今后进行更深层次的研究探讨。
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表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
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