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菟丝子为旋花科植物南方菟丝子(Cuscuta australis R. Br.)或菟丝子(Cuscuta chinensis Lam.)的干燥成熟种子,具有全寄生特性,其生长地域广泛,在我国许多省市均有分布,以北方地区为主[1]。菟丝子入药历史悠久,其性温味甘辛,归肝、肾、脾经。最早在《神农本草经》[2]即有记载,“补不足,益气力,肥健人,久服明目。”《中国药典》(2015年版)[3]中记载:菟丝子补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻;外用消风祛斑。菟丝子是传统的明目中药,在历代及现代眼科疾病治疗组方中多有应用且效果良好。然而,国内外学者对菟丝子的研究多以植物化学以及生殖系统应用为主,对菟丝子在眼科疾病治疗应用的研究资料较为有限。为进一步深入研究菟丝子在眼科疾病治疗中的作用及机制,本文对菟丝子明目效用的历代文献,临床应用及作用机制综述如下。
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菟丝子明目作用首载于汉代《神农本草经》:“味辛平,主续绝伤,补不足,益气力,肥健,汁,去面皯.久服明目,轻身延年。一名菟芦,生川泽”。唐代孙思邈的《千金翼方》记载:一名菟芦,一名菟缕,一名唐蒙,一名玉女,一名赤纲,一名菟累。养肌强阴,坚筋骨,久服明目,轻身延年。宋代《本草图经》记载:“此药治腰膝去风,兼能明目;久服令人光泽,老变为少”。至明清时期,菟丝子的功用认识进入归纳总结阶段。明代李时珍《本草纲目》记载:菟丝子释名菟缕、菟、菟芦丘、赤纲、玉女唐蒙、火焰草、野狐丝、金线草。主治肝伤目暗。提出菟丝子养肝以明目。《雷公炮制药性解》记载:菟丝子,味甘辛,性平无毒,入肾经。久服强阴坚骨,驻颜明目轻身,令人多子。提出菟丝子补肾益精。清朝《本草新编》记述:“菟丝子,可以重用,亦可一味专用。∙∙∙∙∙∙他如夜梦不安,两目昏暗,双足乏力,皆可用之一、二两,同人参、熟地、白术、山荑之类,用之多建奇功。”提出了菟丝子可以单药使用,亦可方药使用。据《本经逢原》记载:“菟丝子,祛风明目,肝肾气分也。”[4]指出了菟丝子善走肝肾阴分来发挥明目功效。综上所述,菟丝子明目效应历史悠久,它是通过补益肝肾的作用发挥明目效应。
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菟丝子治疗眼疾的方剂在《普济方》数据库中达65首,占较重比例,很多菟丝子方剂沿用至今并临症化裁,取得了良好的临床疗效。代表性方剂有:《证治准绳》记录的三仁五子丸[5]:菟丝子配伍五味子、枸杞子、覆盆子等,主治肝肾不足,体弱眼昏,内障生花,不计远近。驻景丸[5]:菟丝子与熟地、车前子,共研为末,炼蜜为丸。主治肝肾俱虚,视物不清,眼前黑影,眼生翳膜等症。《银海精微》记录的加减驻景丸[6]:驻景丸基础上配伍枸杞子、当归等,更添温阳益气养血之效。现常用于治疗肝肾阳虚的中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视神经炎、视网膜色素变性等病。《中医眼科六经法要》记录的驻景丸加减方[7]:驻景丸配伍楮实子、寒水石、茺蔚子等,主治肝肾不足兼夹实邪、虚实夹杂的内障眼病。临床广泛用于近视、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱离、视神经萎缩等眼疾。《审视瑶函》记录的四物五子丸[8]:菟丝子配伍当归、川芎、熟地黄等。主治血虚,益精,明目。应用于缺血性视乳头病变、老年性黄斑变性、高度近视眼底改变、视神经萎缩、干眼综合征、视疲劳等。《景岳全书》记录的左归丸[9]:菟丝子配伍熟地黄、牛膝、龟板胶、鹿角胶等。主治真阴不足,自汗盗汗,头晕眼花,耳聋失眠,口燥舌干,腰酸腿软,遗精滑泄。《太平惠民和剂局方》卷七记录的还睛丸[10]:菟丝子配伍白术、青葙子、防风等。主治风毒上攻,眼目赤肿,怕日羞明,睑眦红烂,瘀肉侵睛,头目眩晕。总结上述菟丝子方剂,其广泛应用于攀睛胬肉、圆翳内障、青盲、视衣脱离、视瞻昏渺、视瞻有色、青风内障、高风内障等诸多眼疾的治疗。
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张敏等[11]观察了驻景丸加减方联合西药治疗年龄相关性黄斑变性的临床疗效。将60例(86眼)年龄相关性黄斑变性患者分为治疗组和对照组,对照组用维生素C、维生素E和施图伦滴眼液治疗,治疗组加用驻景丸加减方。结果显示,治疗组视力恢复、黄斑部出血、渗出、水肿及玻璃膜疣消退均优于对照组。说明了驻景丸加减可以有效治疗老年黄斑变性,促进视力恢复。李官鸿等[12]以四物五子丸加味治疗与年龄相关性黄斑变性37眼,治疗后视力改善、黄斑部病灶消退,总有效率达81.08%。王组军等[13]研究了菟丝子方药黄斑复明汤联合针灸对黄斑病变的治疗作用,结果发现,黄斑复明汤联合针灸可有效改善患者的黄斑中心凹视网膜厚度、视力,缩短出血时间,加速黄斑视功能恢复,且无严重不良反应,治疗有效且具有较高的安全性。
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雷晓琴等[14]在驻景丸基础上创制通络驻景丸治疗糖尿病性视网膜病变、糖尿病黄斑水肿取得了良好的临床疗效。方中菟丝子填精补髓、益精明目,熟地黄养血调肝为君药,结合车前子三七蒲黄墨旱莲砂仁地龙,全方共奏补益肝肾、祛湿化瘀、活血通络之功,以达明目之药效。刘欢等[15]观察了通络驻景丸对非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR)的临床疗效。将54例患者分为2组,治疗组口服通络驻景丸,对照组口服羟苯磺酸钙分散片。通过ETDRS视力表、眼底照相、荧光血管造影等检查,观察视力、眼底体征及中医证候积分变化,结果显示,通络驻景丸组控制并改善了患者视力、眼底体征及自觉症状,防止了NPDR进一步恶化。章瑾等[16]在降糖药物基础上加用菟丝子组方治疗单纯型56例和增殖型40例糖网病患者。结果发现,菟丝子方组对患者视力、眼底微血管瘤、出血和渗出均有改善,单纯型糖网病患者有效率为98.2%,增殖型有效率也可达83%。
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于丽等[17]将120例与年龄相关性白内障患者随机分为治疗组和对照组,治疗组用育阴还睛丸治疗,对照组用复明片治疗,观察3个月后视力、晶状体混浊程度及肝肾两亏症状。结果显示,治疗组有效率89.17%,对照组有效率67.50%;育阴还睛丸治疗与年龄相关性白内障具有很好的临床疗效。俞洋等[18]应用菟丝子方剂补青汤补肝益肾,健脾明目,治疗62只未成熟期年龄相关性白内障,对患者的视力、晶体混浊程度进行分析。结果:显效11.29%,有效64.52%,无效24.19%,总有效率达75.81%。肯定了补青汤对治疗未成熟期年龄相关性白内障的疗效。
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杨海静等[19]用菟丝子配伍黄芪、当归、桃仁、红花治疗前部缺血性视神经病变,提高了患者视力,改善了视野平均光敏感度,降低了视野缺损,明确了治疗缺血视神经病变的有效性。何忠德等[20]用菟丝子配伍熟地、枸杞子治疗视神经萎缩86例,患者视力提升总有效率可达95.3%,证实了治疗视神经萎缩的临床疗效。
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王克年等[21]运用驻景丸治疗原发性视网膜色素变性45例,治疗组与对照组分别给予驻景丸和维生素B1、复方芦丁C治疗,治疗30 d观察组总有效率为92.0%,明显高于对照组(65.0%),取得了满意的疗效。冯彩霞等[22]采用菟丝子组成的益明散治疗干眼症46例,对照组采用泪然眼液治疗,结果:治疗组眼干症状、泪液分泌试验、角膜荧光染色、泪液渗透压均优于对照组,证明本方可以益精滋阴,泪液濡润肝窍。
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菟丝子主要成分为黄酮类、酚酸类、甾醇类、多糖、生物碱类、微量元素和氨基酸[23]。目前认为菟丝子发挥主要药理作用是黄酮类化合物,如山奈酚、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷、芹菜素等[24]。现代研究结果提示,菟丝子及其活性成分药理学机制涉及抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖等多个方面。
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洪德健等[25]以人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)为研究对象,对临床和文献典籍中常述及的子类中药(青葙子、沙苑子、女贞子、楮实子、决明子、菟丝子、枸杞子、车前子)进行抗氧化功能测定。实验分为子类药材受试组、H2O2模型组和空白组。结果表明,菟丝子、女贞子、决明子具有提高SOD酶活性,降低MDA含量的作用,可以显著抑制晶状体上皮细胞的氧化损伤。杜威威等[26]研究了山奈酚对氧化应激诱导的视网膜色素上皮损伤的保护效应。实验结果显示,用H2O2处理视网膜色素上皮(RPE)细胞24 h后,山奈酚可以提升细胞活力,降低ROS,升高SOD。研究提示,山奈酚通过抗氧化途径发挥保护视网膜色素上皮的作用,从而预防年龄相关性黄斑变性(AMD)的发生。
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朱琦等[27]研究了槲皮素对香烟烟雾提取物(CSE)刺激的RPE细胞的抗炎作用,实验采用ELISA测定细胞上清液中IL-1β,IL-6,IL-8炎性因子水平。结果显示,CSE可显著升高炎性因子水平,槲皮素治疗后IL-1β,IL-6,IL-8水平较CSE组显著降低。表明槲皮素可调节RPE细胞抗炎能力,对早期AMD可能具有潜在治疗作用。VEGF不仅是眼科新生血管性疾病重要的治病因子,而且还诱导炎症反应。Lee等[28]研究了槲皮素抑制VEGF的效应机制。实验结果表明在VEGF刺激的661W细胞中,槲皮素可降低VEGF,VEGFR1,VEGFR2,ICAM1,VCAM1,MMP2和MMP9的表达水平,抑制MAPK和Akt的磷酸化及NF-κB核转运。提示槲皮素通过下调NF-κB信号通路,抑制了视网膜感光细胞中VEGF诱导的炎症反应。
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詹敏等[29]观察了菟丝子含药血清对大鼠LECs中凋亡相关基因Bcl-2及Bax表达的干预作用。实验分为:空白对照组、模型组、槲皮素组、菟丝子含药血清组及空白血清组5组。以H2O2诱导氧化应激损伤,24 h后晶体囊膜铺片,检测LECs中Bcl-2及Bax的表达。结果表明,模型组和空白血清组Bax表达显著上调,Bcl-2表达下降。槲皮素及菟丝子含药血清组Bax表达显著下调,而Bcl-2表达上调,以菟丝子含药血清组的效应更为显著。研究结果提示,菟丝子含药血清能有效抑制LECs凋亡,保护晶状体结构,可能部分解释其减缓与年龄相关性白内障发生发展的作用。卞敏娟等[30]研究了芹菜素对光诱导的感光细胞变性小鼠的抗凋亡作用,在强光照射后1 d和3 d,模型组小鼠检测到大量Tunel阳性细胞,而芹菜素处理组Tunel细胞阳性率显著降低,表明芹菜素抑制了强光诱导的光感受器细胞凋亡。
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Higuchi等[31]研究了金丝桃苷对缺氧诱导的视网膜新生血管的抑制作用。在OIR小鼠模型中,治疗组给予3种剂量金丝桃苷灌胃,模型组用DMSO灌胃,5 d后小鼠视网膜染色量化血管闭塞和新生血管簇的形成面积。结果表明,金丝桃苷可剂量依赖性地抑制视网膜新生血管形成。胡兴娟等[32]观察了紫云英苷对高糖培养的Muller细胞VEGF产生的影响。研究发现,高糖组细胞表现出VEGF阳性染色面积比增加,而高糖+紫云英苷组与正常对照组之间无显著差异。提示紫云英苷具有抑制VEGF过表达作用,对预防治疗糖尿病视网膜血管病变具有一定应用前景。
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综上所述,菟丝子及其组方文献考证临床应用历史悠久、效果显著,通过补益肝肾作用来发挥明目效应。临床主要应用于内障眼病、青盲、视瞻昏渺、视瞻有色、青风内障、高风内障等眼疾的治疗。药理学作用机制涉及抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗增殖。今后,我们需要进一步基于中医传承辅助平台来探索菟丝子及其方剂临床用药规律,开展大样本、多中心临床随机对照试验,科学系统地评价菟丝子及其组方的明目效应,为临床应用提供准确可靠的理论数据。此外,菟丝子中化学成分代谢产物复杂,需要新兴的系统生物学研究其具体作用机制及靶点,并最大限度地开发其药用价值。
Progress on the clinical applications and pharmacological effects of Cuscuta chinensis in the treatment of ocular diseases
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摘要: 菟丝子是一味常用的传统中草药,其明目效应历史悠久。对菟丝子在眼科方面的文献考证、临床应用及药理学机制进行综述,以期为菟丝子药用价值开发利用提供文献与理论依据。Abstract: Cuscuta chinensis is a commonly used traditional Chinese herbal medicine. Cuscuta chinensis has a long history of clinical application in the treatment of varieties of ocular diseases. This review summarized the literatures related to its clinical applications, research progresses in the ophthalmic pharmacology and active ingredients. It was aimed to provide a theoretical basis for the further development and utilization of Cuscuta Chinensis as an effective medication.
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畲药地稔(地菍)是野牡丹科植物地稔(Melastoma dodecandrum Lour.)的新鲜或干燥全草,临床常用于带状疱疹、盆腔炎、风湿骨痛等病症的治疗,是宫炎平片和紫地宁血散等中成药的重要组成[1]。现代药理学研究[2-3]表明,地稔提取液具有清除氧自由基、抑制人红细胞膜脂质过氧化、提高小鼠血清超氧化物歧化酶活性等作用,有较强的抗氧化活性。常见的抗氧化活性测定方法有1,1-二苯基-2-苦腈基自由基(DPPH)法、2,2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐法、铁离子自由基法等,操作烦琐、费时[4]。近年来,基于DPPH的在线色谱分析法[5]大大提高了抗氧化活性的分析效率,但完成测定仍普遍需要30 min以上的时间。光谱技术具有快速、简便等优势。目前,已有研究将食品的光谱学特征与抗氧化活性直接关联,建立了茶叶、冬枣等抗氧化活性的快速预测方法[6-9],但采用紫外光谱技术快速预测地稔的抗氧化活性尚未见文献报道。课题组前期已建立了基于近红外光谱的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法[10]。在前期基础上,本研究进一步建立了基于紫外光谱和偏最小二乘(partial least squares, PLS)回归算法的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法,并开发了应用软件。采集待测地稔水提液的紫外光谱后,通过软件中的预测功能可在2 s内得到抗氧化活性的快速预测结果。本研究可为进一步完善地稔抗氧化活性的快速预测方法提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试剂和仪器
DPPH(Sigma-Aldrich公司)。无水乙醇(分析纯,浙江省无锡市展望化工试剂有限公司)。去离子水由Smart2pure超纯水系统制备(Thermo,美国)。共收集10批地稔药材,经浙江省中医药研究院俞忠明副主任中药师鉴定为地稔(Melastoma dodecandrum Lour.),阴干密封保存。紫外光谱采集采用2450系列紫外-可见分光光度仪(岛津,日本)。DPPH自由基清除活性吸光度测定采用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices,美国)。
1.2 数据采集
称取地稔药材各约5.0 g,分别加入料液比为1∶25~1∶45的去离子水,浸泡30 min,加热回流提取1.5~3.5 h,抽滤后的提取液水浴浓缩后转移至50 ml量瓶,用去离子水定容,共得到34批地稔水提液,采用DPPH法测定其抗氧化活性。地稔水提液的制备条件和抗氧化活性测定方法见文献[10]。
移取地稔水提液40 μl,加入去离子水3960 μl,10000 r/min离心后取上清液,制得样品溶液。用1 cm光程的石英比色皿采集紫外光谱。光谱扫描波长范围为190~600 nm,波长间隔为1 nm,扫描速度为快速。每次分析前用去离子水校正仪器基线。
1.3 数据分析
以抗氧化活性为Y,以紫外光谱矩阵为X,通过留一法交叉验证确定最优主成分数,建立X对Y的PLS回归模型。采用校正集相关系数(Rcal)、拟合均方根误差(RMSEE)、交叉验证均方根误差(RMSEcv)、验证集相关系数(Rval)和预测均方根误差(RMSEP)对模型的准确性和预测能力进行评价[11]。首先,比较不同起始波长和终止波长的建模结果,优化光谱波长范围。继而比较原始光谱和光谱经中心化、标准化、Savitsky-Golay(SG)平滑结合一阶导数、SG平滑结合二阶导数、多源散射校正、标准正则变换等预处理后的建模结果,优化光谱预处理方法。最后,基于最优PLS回归模型开发应用软件。数据处理采用SIMCA-P+软件(版本12.0,Umetrics AB,瑞典)。应用软件开发采用Visual Basic软件(版本6.0,Microsoft,美国)。
2. 结果
2.1 光谱波长范围优化
地稔水提液的抗氧化活性范围为83.4%~98.9%。样品溶液的紫外光谱见图1。随机选择24个样品作为校正集,剩下10个样品作为验证集。采用校正集样品,以抗氧化活性为Y,以190 nm为起始波长,分别以250、280、290、300、400、600 nm为终止波长,将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型,优化终止波长,见图2A。结果表明,以290 nm为终止波长所建模型的RMSEcv最小。以抗氧化活性为Y,分别以190、200、210、220 nm为起始波长,以290 nm为终止波长,将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型,优化起始波长,见图2B。结果表明,当起始波长为200 nm时所建模型的RMSEcv最小。综上所述,本研究选择200~290 nm为最优波长范围。
2.2 光谱预处理方法优化
以抗氧化活性为Y,采用200~290 nm的紫外光谱,比较原始光谱和光谱经不同预处理后的建模结果,优化光谱预处理方法,结果见表1。综合考虑Rcal、RMSEE、RMSEcv等,本研究选择标准化为最优光谱预处理方法。
表 1 基于不同预处理方法的PLS回归结果预处理方法 主成分数 校正集 验证集 校正集相关系数 拟合均方根误差 交叉验证均方根误差 验证集相关系数 预测均方根误差 原始光谱 3 0.716 40.9 40.7 0.567 47.2 中心化 3 0.883 2.23 2.21 0.901 1.83 标准化* 3 0.887 2.20 2.17 0.868 2.08 SG平滑结合一阶导数 3 0.734 40.5 39.0 0.647 44.3 SG平滑结合二阶导数 1 0.756 4.05 4.27 0.786 3.68 多元散射校正 1 0.110 4.50 4.72 0.302 3.77 标准正则变换 1 0.141 4.49 4.66 0.325 3.73 SG平滑结合一阶导数+中心化 3 0.898 2.09 2.13 0.722 3.33 SG平滑结合二阶导数+中心化 3 0.879 2.26 2.47 0.655 3.75 多元散射校正+中心化 1 0.110 4.50 4.41 0.302 3.77 标准正则变换+中心化 1 0.141 4.49 4.34 0.325 3.73 SG平滑结合一阶导数+标准化 1 0.840 95.0 95.4 0.757 91.1 SG平滑结合二阶导数+标准化 4 0.911 2.01 2.18 0.721 3.55 多元散射校正+标准化 1 0.520 3.87 4.03 0.582 3.28 标准正则变换+标准化 1 0.535 3.88 4.02 0.582 3.28 注:*最优PLS回归模型。 2.3 模型应用
采用200~290 nm的紫外光谱,经标准化预处理后建立最优PLS回归模型,校正集预测值与真实值之间的相关图(图3),Rcal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%。基于最优PLS回归模型开发应用软件,将所建预测模型嵌套入软件。软件双击即可打开,操作界面见图4。采用该应用软件,通过2个步骤即可实现待测地稔水提液抗氧化活性的快速预测。步骤1:将待测地稔水提液稀释后,采集紫外光谱,检测波长为200~290 nm。步骤2:通过软件中的预测功能将紫外光谱数据自动代入模型,在2 s内实现地稔水提液抗氧化活性的快速预测。
2.4 方法验证
采用所开发的软件预测验证集样品的抗氧化活性。对比验证集抗氧化活性的预测值和真实值,验证本方法的准确性。验证集预测值与真实值之间的相关图见图3,预测回收率见表2。结果显示,验证集抗氧化活性的预测值和真实值差异较小,Rval、RMSEP分别为0.868、2.08%,平均预测回收率为(100.1±2.3)%,表明该方法的预测准确度较高。
表 2 验证集抗氧化活性的预测回收率(%)编号 预测值 真实值 预测回收率 平均预测回收率 1 91.6 93.1 98.4 100.1±2.3 2 95.2 97.8 97.3 3 94.4 92.9 101.6 4 96.2 92.0 104.6 5 96.5 93.8 102.9 6 83.5 83.4 100.1 7 90.0 89.6 100.4 8 92.1 94.3 97.6 9 85.9 86.6 99.2 10 89.2 90.1 98.9 3. 讨论
地稔是我国的民间常用药,在畲族等少数民族民众中广泛应用,具有较好的临床价值,但仍缺少有效的质量控制方法。现代药理学研究表明,地稔提取液有较强的抗氧化活性,但不同采收时间、不同部位地稔的质量有较大的差异[12-13]。因此,建立地稔抗氧化活性的快速预测方法对其质量控制具有重要意义。
目前,将光谱技术应用于食品、中药等抗氧化活性的快速预测已有较多文献报道[6-9, 14],但多以近红外光谱为主。紫外光谱是一种基于分子中价电子能级跃迁的电子光谱技术,具有快速、简便、绿色、灵敏度高等优势。目前,紫外光谱技术已广泛应用于中药活性成分的快速预测[15-17],但在中药抗氧化活性的快速预测方面仍罕见文献报道。课题组前期研究表明,地稔水提液紫外光谱的吸光度与其活性成分没食子酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量具有相关性[11]。另有研究表明,地稔水提液的抗氧化活性与多种活性成分的含量呈浓度依赖性[18]。基于上述结果,推测地稔水提液紫外光谱的吸光度可能与其抗氧化活性具有相关性。鉴于此,本研究通过探索地稔水提液紫外光谱与抗氧化活性的相关性,建立了基于紫外光谱的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法。为了增加模型在不同紫外光谱仪间的适用性,本方法可选择性采用无水乙醇200 nm的吸光度进行校正[11]。采用本方法,抗氧化活性预测值与真实值的Rcal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%,Rval、RMSEP分别为0.868、2.08%,平均预测回收率为(100.1±2.3)%,可为地稔水提液抗氧化活性的快速预测提供依据。
本方法简单、绿色,无需掌握复杂的回归参数和手动计算方法,也不需要耗费有机试剂,只需将待测地稔水提液用去离子水稀释后,采集并存储200~290 nm的紫外光谱,通过所开发的应用软件即可快速得到抗氧化活性的预测结果。本方法分析时间较短(每采集一张紫外光谱的时间小于1 min,软件预测时间小于2 s),而采用常规方法或在线色谱法测定DPPH自由基清除率至少需30 min。本研究可为进一步完善地稔的质量控制方法提供依据。
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