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1960年，Jenning首次提出了心肌再灌注损伤的概念[1]。心肌缺血/再灌注损伤的主要原因包括氧自由基增多、细胞内钙超载及微血管损伤等[2-3]，缺血组织细胞恢复灌注后发生的再灌注损伤（MIRI）在恢复血流的过程中常会引起心肌细胞的氧化应激损伤[4-5]，往往造成患者预后不佳 [6]。
升陷汤出自张锡纯《医学衷中参西录》，该方由黄芪、柴胡、升麻、桔梗、知母组成，主治大气下陷之证，临床广泛用来防治心肌缺血性疾病[7]、治疗老年慢性充血性心力衰竭[8]、治疗不稳定型心绞痛[9]、治疗青少年病毒性心肌炎[10-11]。课题组前期考察了升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞的保护作用[12]，尚未见升陷汤对心肌细胞缺氧/复氧损伤模型保护作用的报道。本实验基于经典的心肌细胞缺氧/复氧损伤模型[13]，从细胞凋亡的角度初步探讨升陷汤及单味药对心肌缺氧/复氧的作用机制。
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纯净水（美国Millipore公司）、Fura-3/AM（碧云天生物技术有限公司）、生理盐水（海军军医大学附属长征医院）；0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco公司）；DMEM低糖培养基、培养液（美国Hyclone公司）；MTT工作液（美国sigma公司）；二甲基亚砜（德国GmbH公司）；PBS缓冲液（南京滴纯生物科技有限公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；DCFH-DA（碧云天生物有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；16%甲醛（无甲醇，赛默飞世尔科技有限公司）；其他试剂为分析纯。
倒置荧光显微镜（重庆奥特光学仪器）；流式细胞仪（美国BD公司）；全自动酶标仪（美国Multiskan MK3公司）；CO2细胞培养箱（德国Heraeus公司）；低温高速离心机（德国Heraeus公司）；台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；二氧化碳培养箱（美国Forma公司）；79-1型磁力搅拌器（江苏周庄科研仪器厂）；YJ-II型超声波细胞粉碎机（上海新芝生物技术研究所）；海尔低温冰箱。
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升陷汤中五味药材饮片由长征医院药材科提供。将5 L水浸泡升陷汤全方提取物或各单味药材24 h后，再煎煮，重复3次，将浓缩水煎煮液合并至650 ml，干燥得提取物浸膏。其中，升陷汤组方饮片（简称药物SXT）包括黄芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g和升麻100 g。SXT、黄芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液蒸干后的浸膏重量分别为431.2、187.5、89.5、45.2、43.5、28.1 g。将所有提取物分别研细，于−20°C冰箱中保存备用。
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H9C2细胞培养在含10% FBS的高糖DMEM培养液、37 ℃、5% CO2、95% O2饱和湿度的恒温细胞培养箱，待细胞汇合度达到80%～90%进行传代培养。传代时，弃去培养液，用PBS缓冲液洗2～3次后用含0.25%胰蛋白酶消化液消化细胞，待细胞变圆时立刻停止消化，以1000 r/min离心5 min。弃上清液，用含10% FBS 的DMEM培养基重悬后，并按1∶3分瓶，隔天更换培养液。取对数生长期细胞进行试验。
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将心肌细胞随机分为以下8组：对照组：心肌细胞正常培养基培养；模型组：心肌细胞用低糖无血清培养基预孵育1 h后，在含95% N2和5%CO2的培养箱中缺氧6 h，再在5% CO2和95%空气饱和的培养箱复氧1 h造成心肌缺血损伤模型组；药物干预组：心肌细胞用低糖无血清培养基稀释的药物预孵育1 h后，经缺氧6 h-复氧1 h处理后即为药物干预组。其中，干预药物包括SXT、黄芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液（共6组）。
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培养完成后，将对照组和模型组组以及药物干预组中取对数期生长的细胞接种于96孔板，调整细胞的浓度使每孔有5×105个细胞，然后向每孔中加入20 μl MTT（5 mg/ml）工作液，孵育一段时间，后向每孔中加入150 μl DMSO，室温条件先低速震荡让二者充分融合，然后参照MTT比色法试剂盒说明，在490 nm测定各孔下的吸光值，分别记录结果。模型组、各药物干预组与对照组的比值为细胞活力相对值。
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培养完成后，分别收集所有组中悬浮细胞，在各组细胞中加入150 μl DCFH-DA溶液，在37 ℃细胞培养箱内避光孵育30 min。每隔5 min震荡1次，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液将细胞洗几遍，最后用PBS重悬。采用多功能酶标仪检测细胞内ROS活性（激发波长488 nm，检测波长525 nm）。
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培养结束后，用0.25%胰酶消化离心，分别将所有组中细胞用缓冲液PBS冲洗，再与10 μmol/L钙离子荧光探针Fura-3/AM（10）共同孵育60 min，然后用缓冲液冲洗2次，最后用PBS重悬。将制成的标本置于倒置荧光显微镜下，用340 nm紫外光激发获得荧光图像，经过计算机图像处理后根据标准曲线算出细胞内钙浓度。
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培养完成的细胞用不含 EDTA 的胰酶消化，离心收集悬浮细胞，2 000 r/min离心5 min，弃培养基；用预冷的PBS洗涤细胞；加入100 μl结合缓冲液悬浮细胞，浓度约为 1 × 106/ml；然后在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于 4 ℃ 避光条件下孵育 15 min；再加入 5 μl PI 后轻轻混匀于 4 ℃ 避光条件下孵育5 min；添加PBS至500 μl并轻轻震摇均匀，于60 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
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使用GraphPad Prism v5.0统计软件进行统计学分析，实验数据以（
$\bar x \pm s$ ）表示，组内两两比较采用t-test，当P < 0.05时判定差异具有统计学意义。 -
本实验根据临床给药剂量及预实验结果，在药物试验浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μg/ml的药物浸膏时，研究全方及各单味药对心肌细胞缺氧/复氧后细胞活力的影响。MTT结果显示：升陷汤、黄芪、知母、桔梗、升麻在20 μg/ml时，细胞活力最佳，因此确定上述提取物浓度组均为20 μg/ml；由于20 μg/ml柴胡提取物对心肌细胞有一定损伤，经试验最终确定药物浓度为0.3 μg/ml时对缺氧/复氧后细胞活力无明显影响（表1）。
表 1 升陷汤各单味药对缺氧/复氧造成的心肌细胞活力的影响
组别 终浓度（μg/ml） MTT增殖率（%） 全方 20 18.745 黄芪 20 14.300 知母 20 11.199 桔梗 20 9.244 升麻 20 10.977 柴胡 0.3 26.512 -
实验结果表明：心肌细胞在缺氧/复氧条件下，细胞内活性氧含量明显增加，升高至对照组的2.49倍（P<0.01，图1），表明缺氧/复氧引起细胞内自由基损伤；给药后，除柴胡外，升陷汤全方及各单味药均能明显降低心肌缺氧/复氧致心肌损伤模型的细胞内ROS的荧光强度，升陷汤全方、黄芪、知母、桔梗和升麻处理组分别为对照组的1.46、1.40、1.79、1.52和1.83倍（P<0.01，图1）。其中，升陷汤与黄芪作用最强，两者无明显统计学差异。
图 1 药物对心肌缺氧/复氧细胞凋亡的影响
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实验结果表明：心肌细胞在常氧下（对照组），Ca2+荧光强度较低，缺氧/复氧后，Ca2+荧光强度增加（P<0.01，图2），表明心肌细胞低氧/复氧时存在Ca2+超载。升陷汤全方和黄芪、知母药物干预后，各组细胞内荧光强度与模型组相比，分别降低了15.20%、23.98%和15.79%（P<0.05，图2），表明其对低氧/复氧时心肌细胞内Ca2+ 超载有抑制作用。桔梗、升麻药物处理后，上述值虽然有降低，但差异不明显。
图 2 药物对心肌缺氧/复氧细胞内ROS含量的影响
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采用Annexin V-FITC/Pl双染流式细胞术检测药物对缺氧/复氧损伤后心肌细胞凋亡情况。从检测结果发现，心肌细胞在常氧下（对照组），细胞凋亡较低；缺氧/复氧后，细胞凋亡增加；给药组中升陷汤全方、黄芪、桔梗可以降低细胞的凋亡率（P<0.05，图3）。
图 3 药物对心肌缺氧/复氧细胞内钙离子浓度的影响
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心肌细胞缺氧/复氧损伤是模拟MIRI的病理生理过程的经典模型，心肌细胞短时间内缺血再灌注造成的组织细胞功能代谢发生障碍及结构功能破坏加重，甚至发生不可逆性损伤的现象[14]。Ca2+超载一直被认为是心肌缺血再灌注的主要机制。缺血缺氧时，心肌细胞内Ca2+超载，线粒体膜的通透性转换孔开放；再灌注恢复使得心肌细胞重新摄取O2，产生大量的线粒体内活性氧，进一步增加线粒体胞质内的Ca2+浓度，线粒体的氧化磷酸化进而受阻促使心肌细胞死亡[15-16]。另外，线粒体内活性氧触发氧化应激反应并加重心肌细胞的凋亡和坏死[17-19]。由此可见，细胞内ROS活性和Ca2+浓度是MIRI重要的检测指标[20-21]。
本课题组前期采用大鼠冠状动脉结扎急性心肌缺血致慢性心力衰竭模型，心肌组织病理学切片证实了升陷汤全方对心肌细胞损伤和炎症发展起到有效的控制作用，通过药理指标测定结合代谢组学研究证实了升陷汤对心衰具有显著的治疗作用。升陷汤通过改善心肌细胞损伤，减少炎症反应，增强左室射血功能，调节机体磷脂代谢和脂肪酸生物合成来发挥其保护心肌作用，从而治疗慢性心力衰竭[22-23]。本课题组通过体外细胞实验从缺氧/复氧致心肌细胞损伤角度，基于心肌细胞活力角度考察并证实了升陷汤的保护作用，可通过抑制细胞凋亡、降低细胞内ROS以及Ca2+的浓度实现。同时，发现各单味药也具有一定的保护作用，但弱于全方的保护功效，进一步证实了全方治疗“大气下陷”的合理性。升陷汤全方是以黄芪补气升陷为主药，知母凉润制主药之温燥，柴胡、升麻助黄芪升陷之力，桔梗载药力上达胸中，共奏升补大气之效[24]。药材柴胡提取液在本实验中尚未发现具有保护缺氧/复氧损伤心肌细胞的作用，在一定程度上证实了其他药味配伍的合理有效性。
Protective effect of Shengxian decoction and the decoction of single herb component against myocardial injury induced by hypoxia/reoxygenation
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摘要:
目的 通过观察升陷汤及单味药材水提物对离体培养的大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响，并对其作用机制进行初步探讨。 方法 培养H9C2大鼠心肌细胞，共分成8组：空白对照组，缺氧/复氧组（模型组），缺氧复氧损伤后药物干预组（升陷汤全方及5个单味药材水提物组）。分别对心肌细胞凋亡率、心肌细胞的活力、细胞内活性氧（ROS）活性、细胞内钙离子浓度（Ca2+）等指标进行检测。 结果 升陷汤全方及黄芪、知母等药材干预能明显降低细胞凋亡率、细胞内ROS活性和Ca2+浓度（P<0.05），其中，全方的作用最强。与缺氧/复氧组细胞内ROS活性和Ca2+浓度增加至空白对照组的2.49倍及1.71倍相比，全方能使细胞内ROS活性和Ca2+浓度增加率降至缺氧/复氧组的41.37%和15.20%。 结论 升陷汤及单味药材对缺氧/复氧致心肌损伤具有保护作用，该作用的机制可能通过抑制细胞凋亡、降低细胞内ROS以及Ca2+的浓度所致。 Abstract:Objective To study the protective effect of Shengxian decoction and the single herb decoction against myocardial injury induced by hypoxia/reoxygenation. Methods The H9c2 cells were cultured to establish hypoxia/reoxygenation model. Rats were divided into 8 groups: normal control group, hypoxia/reoxygenation group (model group) and treated groups (Shengxian decoction and the single herb decoction). The apoptotic rate of cardiomyocytes, the activity of reactive oxygen species (ROS) and intracellular calcium concentration (Ca2+) were measured. Results Compared with hypoxia/reoxygenation group, the apoptosis rate, ROS activity and intracellular Ca2+ concentration were significantly lower in all treated groups (P<0.05). The ROS activity and intracellular Ca2+ concentration was decreased by 41.37% and 15.20% in Shengxian decoction group compared to the model group. Conclusion Shengxian decoction and the single herb decoction had protective effect on myocardial injury induced by hypoxia/reoxygenation. -
Key words:
- Shengxian decoction /
- hypoxia/reoxygenation injury /
- cardiomyocyte /
- protection effect
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在美国疾病预防控制中心耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)控制指南（2012年版）中，定义耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌 (CRKP)，是指在药敏试验中至少对厄他培南、美罗培南或亚胺培南其中之一者耐药，且对头孢曲松、头孢噻肟及头孢他啶耐药的肺炎克雷伯菌(KP)。CRKP引发的血流感染 (BSI) 因药物选择有限，致死率高达54.3%[1]。长期规律血液透析(HD)的尿毒症患者CRKP血流感染时，因HD的特殊性，更增加了治疗难度，特别是使用氨基糖苷类药物开展治疗时。临床药师需要根据HD患者代谢和排出的实际情况，结合药动学/药效学(PK/PD)理论对药物选择、剂量计算、以及给药时间进行优化。本文以1例 HD尿毒症患者为例，探讨阿米卡星在治疗合并CRKP血流感染的透析患者时的经验和体会。
1. 病史简介
1.1 基本信息
患者男性，64岁，农民，身高176 cm，体重65 kg。主诉“间断发热2 d”，于2019年10月21日入院。既往高血压病史20余年，多囊肾、多囊肝病史30余年，癫痫病史1年余，尿毒症病史4年，无尿状态，规律血液透析4年（每周一、三、五，2次血液透析+1次血液透析滤过），右侧颈静脉留置导管。2019年1月至9月，患者因“多囊肝伴感染”多次入院治疗，血培养多次报告超广谱β内酰胺酶（ESBLs）阳性的KP，曾多次接受哌拉西林他唑巴坦、替加环素、米诺环素、美罗培南、法罗培南等治疗。入院前2 d，患者再次无明显诱因出现发热，体温最高37.5 ℃，伴畏寒寒战，腰痛及呃逆，无明显咳嗽咳痰，服用“法罗培南”无明显改善，为求进一步诊治再次入院。入院查体：体温(T)38.6 ℃、脉搏(P)112次/min、呼吸频率(R)22次/min、血压(BP)117/97 mmHg。患者呈慢病面容，被动体位，查体欠合作，双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音，腹部膨隆，无压痛及反跳痛，移动性浊音阳性，肝肾区无叩痛。辅助检查：血常规：白细胞计数(WBC) 10.74×109/L、中性粒细胞百分比(N%) 85.8%、血红蛋白(Hb) 109 g/L、血小板(PLT) 117×109/L；血生化：尿素氮(BUN) 30.8 mmol/L、肌酐(Cr) 912μmol/L、丙氨酸氨基转移酶(ALT) 6 U/L、天冬氨酸氨基转移酶(AST) 8 U/L；C-反应蛋白(CRP) 254 mg/L、降钙素原(PCT) 17.35 ng/ml、血沉(ESR) 95 mm/h。腹部核磁示肝右叶多发片状DWI异常信号影，多囊肝，双侧多囊肾。胸部CT未见异常。入院诊断：肝囊肿合并感染、尿毒症、血液透析状态、慢性左心功能不全、心功能Ⅲ级、心律失常、阵发性房颤。
1.2 治疗经过
入院当日抽取静脉血做细菌培养，经验性给予美罗培南0.5 g，1次/d。治疗期间，患者仍间断发热，体温在37~38 ℃波动。10月26日化验结果显示：WBC 5.35×109/L、N% 71.2%、BUN 18.41 mmol/L、Cr 631μmol/L、CRP 179 mg/L、PCT 16.97 ng/ml、ESR 96 mm/h。10月26日细菌血培养为产丝氨酸碳青霉烯酶(KPC)的CRKP (药敏见表1)。导管内血培养阴性。临床药师对导管相关感染进行评估：患者导管处皮肤干燥，无渗液，考虑血流感染与多囊肝伴发的感染可能性更大。药敏结果示病原菌对氨基糖苷类药物敏感。经确认，患者本人及家族成员无氨基糖苷类药物的过敏史与不良反应史。临床药师建议：选择美罗培南联合敏感药物阿米卡星抗感染治疗。美罗培南剂量增加至0.5 g每12 h给药1次，延长滴注时间至2 h。阿米卡星首次剂量给予0.8 g，维持剂量0.2 g，于每次透析后给药，滴注时间不少于30 min。
表 1 患者肺炎克雷伯菌血培养和药敏结果抗生素 敏感度（mg/L） 抗生素 敏感度（mg/L） 复方新诺明 ≤20敏感 美罗培南 ≥16耐药 粘菌素 ≤0.5敏感 亚胺培南 ≥16耐药 替加环素 ≥8耐药 氨曲南 ≥64耐药 米诺环素 ≥16耐药 头孢泊肟酯 ≥32耐药 多西环素 ≥16耐药 头孢哌酮舒巴坦 ≥64耐药 左氧氟沙星 ≥8耐药 头孢他啶 ≥32耐药 环丙沙星 ≥4耐药 哌拉西林他唑巴坦 ≥128耐药 妥布霉素 ≤1敏感 替卡西林克拉维酸钾 ≥128耐药 阿米卡星 ≤2敏感 10月27日，患者体温恢复正常，病情缓解，查体：T 35.9 ℃、P 60次/min、R 16次/min、BP 148/93 mmHg。10月29日WBC 5.7×109/L、N% 59%、CRP 30.25 mg/L、PCT 3.92 ng/ml、ESR 67 mm/h。10月30日，患者血培养结果阴性，病情平稳，未诉不适。11月4日，患者体温、炎性指标等检测指标均正常，在院期间，患者未出现头晕、耳鸣等不良反应。11月8日，患者遵医嘱出院。两周后电话随访，患者未再出现发热。
2. 讨论
2.1 氨基糖苷类药物在CRKP-BSI中的治疗地位
CRKP是一类具有较厚荚膜且大多数存在菌毛的
${\rm{G}}^- $ 菌，较厚的荚膜与高耐药性相关[2]。近5年来，CRKP的抗菌治疗一般局限于头孢他啶/阿维巴坦、美罗培南/维博巴坦、多粘菌素、替加环素、磷霉素、碳青霉烯类以及氨基糖苷类等药物[3-7]。氨基糖苷类药物因存在神经毒性和肾毒性，较少用于一线治疗，因此对许多耐药菌仍有一定的敏感性，常常用于耐药${\rm{G}}^- $ 菌的联合治疗。多项研究表明，氨基糖苷类与β-内酰胺类药物联合治疗${\rm{G}}^- $ 菌感染的休克患者时，尤其以碳青霉烯类药物为基础的联合方案与任何一种单药治疗方案相比可显著降低患者病死率[8-9, 10-11]。根据药敏结果，药师建议美罗培南抗感染治疗联合药敏敏感且价格低廉的阿米卡星作为治疗方案。阿米卡星可破坏KP胞浆膜的完整性，通过抑制致病菌蛋白质的合成发挥抑菌作用，对KP的敏感率为85.7%[12]。2.2 规律血液透析(HD)患者阿米卡星剂量如何调整
2.2.1 氨基糖苷类药物药动学/药效学(PK/PD)特点及给药方式
氨基糖苷类药物是浓度依赖性的静止期杀菌剂，有3个PK/PD特点：①预测疗效的PK/PD指标主要为血药峰浓度/最小抑菌浓度(cmax/MIC)≥8～10[13]或0～24 h药时曲线下面积/最小抑菌浓度(AUC0~24/MIC) ≥100[14]；②抗菌药物后效应(PAE)较长，阿米卡星对KP的PAE>12 h[15]；③有耐药适应性，即接触药物暴露后细菌杀灭率降低，可能是细菌对药物的摄取下调导致的[9]。氨基糖苷类药物最理想的体内过程，是获得高的cmax，以及一段时间的无药期，以减少适应耐药性。这是氨基糖苷类药物提高给药剂量、延长给药间隔的理论基础。对于肾脏功能正常的人群，氨基糖苷类药物推荐的给药方式多为每日剂量一次给予[9, 14]。
2.2.2 氨基糖苷类药物HD患者的给药时机选择
氨基糖苷类药物是中等分子量(465～600)的化合物，蛋白结合低，分布体积较小。HD可以有效清除氨基糖苷类药物。HD患者，传统的给药方式是首剂给予肾功能正常患者的推荐剂量，每次透析后补充正常剂量的一半。有新的观点提倡，每次HD之前给予正常剂量[16-17]，或在透析过程中给药，以获得体内较高的cmax，随后由透析过程将体内药物浓度降低。但是这种给药方式也有局限性：①必须依赖于准确的HD疗程将药物浓度降低，否则，会导致药物蓄积，加重不良反应。②对于可能因意外情况而中断HD的患者以及不能进行血药浓度监测的医疗机构，有一定的风险。③HD患者无法完全排出体内的氨基糖苷类药物，不存在无药期，不能减少细菌获得性耐药产生[18]。临床药师结合本例患者的癫痫病史，且我院尚未开展阿米卡星血药浓度监测的实际情况，仍建议选择传统的透析后补充低剂量的策略，医生采纳。
2.2.3 阿米卡星HD患者给药剂量计算
根据桑德福《抗微生物指南》（第48版）推荐，阿米卡星尿毒症患者行血液透析的给药方案为：①2次/d给药方案：7.5 mg/kg，间隔48 h再次给药，做透析后额外增加3.75 mg/kg。②1次/d给药方案：首剂(推荐剂量15 mg/kg)，间隔72 h+透析后额外补充3 mg/kg。根据PK/PD理论，本例患者选择1次/d的给药方式。
Hideo[19]等对阿米卡星PK/PD评价发现：对于MIC≤2 mg/L，10 mg/kg可获得>90%的治疗目标。本例患者校正体重68.8 kg，负荷剂量选择10 mg/kg给药，给药剂量0.69 g。根据制剂规格0.2 g/支，给予0.8 g(11.6 mg/kg)，每日一次。维持剂量：每周一、三、五规律血透，每次透析后给药0.2 g（3 mg/kg）。患者用药后，第2天体温下降至正常。
2.3 尿毒症患者使用阿米卡星安全性及相关监护指标
氨基糖苷类药物可导致听觉、前庭毒性和肾脏毒性以及神经肌肉阻滞。氨基糖苷类耳毒性发生率为15%~20%，通常表现为听力下降或损失，以及前庭损害，同时使用其他肾毒性药物时[20]，须关注耳毒性反应。
氨基糖苷类药物存在肾损害、神经肌肉病、食物中毒、低钙血症，同时使用肌松药时，需关注可能出现呼吸衰竭等严重不良反应[21]。神经肌肉阻滞的发生与滴速有关，滴注时间至少30 min以上。本例患者未出现听力损伤及神经肌肉阻滞不良反应。
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表 1 升陷汤各单味药对缺氧/复氧造成的心肌细胞活力的影响
组别 终浓度（μg/ml） MTT增殖率（%） 全方 20 18.745 黄芪 20 14.300 知母 20 11.199 桔梗 20 9.244 升麻 20 10.977 柴胡 0.3 26.512 
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