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随着放射诊断技术与介入治疗手段的发展，造影剂的使用越来越广泛。相对的，造影剂所引起的急性肾功能损伤也日益受到临床关注。造影剂肾病（contrast-induced nephropathy, CIN）是接受冠状动脉造影或经皮冠状动脉腔内成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA）后常见的不良后果[1]。由于涉及多种危险因素，CIN发病率为0%～24%不等[2]。临床因血管疾病而接受造影的患者，通常合并高血压。《2018美国放射协会手册》指出需要药物治疗的高血压病史且为造影剂肾病的危险因素之一，可能需要在使用碘造影剂前进行肾功能的评估[3]。但降压药物对肾功能具体的影响以及造影术前是否需要停用这些药物还未得到严格的证实。近年来，肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂（renin-angiotensin-aldosterone system inhibitors，RAASi）包括血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin convening enzyme inhibitor, ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin receptor blockers, ARB）对造影剂急性肾损的影响尚存在争议。一项纳入12篇文献包含4 493名患者的meta分析发现，在接受RAASi和未接受RAASi治疗的患者之间，CIN的发生率没有差异[4]，反而术前接受RAASi可降低造影剂急性肾损伤的发生率和医院病死率[5]，但也有部分学者认为ACEI/ARB会增加CIN的发生率[6-7]。β受体阻滞剂作为危险因素常被认为与造影剂的过敏样反应相关[3, 8]，而对肾功能的影响鲜有研究。另外，在造影前使用CCB类的降压药物预防CIN的作用也存在争议[9]，还需进一步考察。本研究回顾分析了常见抗高血压药物对PTCA术后患者短期肾功能的影响，探讨其对CIN的作用及安全性，以期为临床用药提供更多的循证医学证据。
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选取2020年1月至2020年12月南京鼓楼医院心血管内科疑似冠心病行冠脉造影术的193例住院患者为研究对象，所有患者在PTCA治疗前后均接受了标准水化治疗。纳入标准：①年龄在18周岁以上。②冠脉造影后行PTCA术的患者。③术前均规律（≥7 d）服用ACEI/ARB、β受体阻滞剂或CCB类药物。排除标准：①同时服用两种及以上降压药的患者。②术前术中使用袢利尿剂患者。③碘过敏试验阳性或2周内静脉使用过对比剂。④严重肾功能不全：eGFR<30 ml/（min·1.73 m2）。⑤存在其他导致急性肾功能损伤的病因（如使用肾毒性药物、慢性肾功能不全、血容量不足、心力衰竭）。⑥患有自身免疫性疾病、严重感染及肿瘤者。试验分组：根据时间顺序依次纳入，分为4组，不服用降压药物或至少停药2周的单纯水化组（50例）、ACEI/ARB组（50例）、β受体阻滞剂组（47例）、CCB组（46例）。
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冠脉造影及介入治疗通过有经验的心内科介入医师在标准程序下完成，所有患者均使用碘海醇为造影剂。回顾性收集患者的临床资料，包括患者的年龄、性别、体重、身高、血压、血脂、血糖、尿酸、造影剂用量、造影前及造影48 h后的血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、Cockcroft-Gault法计算肌酐清除率（Ccr）、MDRD法计算肾小球滤过率(eGFR)。CIN诊断标准[10-11]为：排除其他影响肾功能因素，造影暴露后48 h内，SCr水平绝对值增加44.2 μmol/L或超过基础值25%以上。所有患者在造影前静脉滴注0.9%氯化钠注射液250 ml进行水化治疗。
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数据采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料用（
$\bar x$ ±s）表示。统计指标均进行正态性及方差齐性检验，造影前后连续变量的比较采用配对t检验。多组间连续变量的比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检定，方差不齐采用Games-Howell检验。计数资料采用Fisher确切概率法，用[n(%)]表示。所有统计分析，以P<0.05表示数据存在差异，具有统计学意义。 -
本研究一共纳入193例患者，如表1所示，4组患者在年龄、性别、BMI、血压、血脂、血糖、尿酸、造影剂用量以及基础肾功能指标等方面，差异均无统计学意义（P>0.05）。
表 1 4组患者基本资料比较[n(%),
$\bar x$ ±s]组别 年龄（岁） 男性 BMI（kg/m2） 收缩压
（mmHg）舒张压
（mmHg）TC
（mmol/L）TG
（mmol/L）HDL-C
（mmol/L）LDL-C
（mmol/L）单纯水化组（n=50） 60.58±11.35 28(56) 23.96±2.91 130.62±16.99 79.98±13.04 4.48±0.91 1.43±0.84 1.26±0.34 2.55±0.71 β-受体阻滞剂组(n=47) 64.40±11.61 32(68) 25.13±3.60 125.79±15.93 74.89±13.19 4.03±0.99 1.50±0.91 1.09±0.35 2.30±082 ACEI/ARB组（n=50） 65.04±6.52 25(50) 24.37±3.05 134.86±17.17 76.52±10.29 4.15±0.97 1.60±0.91 1.16±0.30 2.28±0.80 CCB组(n=46) 65.67±9.25 26(57) 24.45±2.81 139.43±14.57 78.91±9.28 4.23±0.87 1.34±0.61 1.20±0.30 2.38±0.74 组别 UA(μmol/L) FBG
（mmol/L）造影剂用量（ml） Scr
(μmol/L)BUN
（mmol/L）eGFR[ml/
（min·1.73 m2）]eGFR>90 [ml/
（min·1.73 m2）]eGFR<60 [ml/
（min·1.73 m2）]Ccr
(ml/min)单纯水化组（n=50） 330.48±82.36 5.35±1.06 122.32±56.11 63.62±16.01 5.25±1.17 112.04±27.17 11（22） 1（2） 97.86±29.83 β-受体阻滞剂组(n=47) 378.19±87.31 5.32±1.87 124.83±60.38 66.30±14.61 5.32±1.48 107.05±19.59 8（17） 1（2） 95.88±26.84 CEI/ARB组（n=50） 363.88±98.07 5.50±1.25 121.79±59.22 64.94±12.69 5.48±1.30 103.26±20.23 12（24） 1（2） 89.91±23.94 CCB组(n=46) 343.87±81.79 5.40±1.58 126.48±58.76 63.57±13.90 5.51±1.34 106.93±20.12 8（17） 1（2） 91.98±28.75 -
应用造影剂48 h后肾功能指标变化如表2所示。CIN发生率为0%，4组患者的Ccr在手术前后均无变化，组间也无差异。除了单纯水化组，服用抗高血压药物组BUN皆有一定幅度的下降，其中，β受体阻滞剂组术后与术前相比具有显著差异。并且，β受体阻滞剂组术后BUN水平与单纯水化组、CCB组之间也存在组间差异。另外，与术前相比，β受体阻滞剂组患者的eGFR水平在术后也显著降低。差异具有统计学意义（P<0.05）。
表 2 4组患者造影前后肾功能指标的比较
组别 Scr(μmol/L) BUN（mmol/L） eGFR[ml/（min·1.73 m2）] Ccr(ml/min) 术前 术后48 h 术前 术后48 h 术前 术后48 h 术前 术后48 h 单纯水化组（n=50） 63.62±16.01 64.04±16.66 5.25±1.17 5.34±1.33 112.04±27.17 110.27±25.58 97.86±29.83 97.42±30.39 β受体阻滞剂组(n=47) 66.30±14.61 64.53±14.00 5.32±1.48 4.71±1.01*▲ 107.05±19.59 105.61±18.35▲ 95.88±26.84 98.88±28.55 ACEI/ARB组（n=50） 64.94±12.69 64.98±13.28 5.48±1.30 5.26±1.47 103.26±20.23 103.23±20.29 89.91±23.94 90.02±24.70 CCB组(n=46) 63.57±13.90 63.28±13.27 5.51±1.34 5.42±1.30# 106.93±20.12 111.52±24.62 91.98±28.75 92.20±30.06 *P<0.05，与单纯水化组比较；#P<0.05，与β受体阻滞剂组比较；▲P<0.05，与同组术前比较。 -
将β受体阻滞剂组患者按照血压水平分级，比较不同血压水平下的肾功能情况，结果如表3所示。SBP≥140或DBP≥90的患者在使用造影剂之前，Scr与Ccr水平均显著高于SBP<140且DBP<90的患者（P<0.05）。
表 3 β受体阻滞剂组不同血压水平造影前后肾功能指标的比较
肾功能指标 SBP＜140且DBP＜90（n=34） SBP≥140或DBP≥90（n=13） 术前 术后48 h 术前 术后48 h Scr(μmol/L) 64.85±11.72 63.28±11.79 70.08±20.49* 67.81±18.78 BUN（mmol/L） 5.31±1.59 4.71±1.05 5.36±1.19 4.71±0.92 eGFR(ml/（min·1.73 m2) 108.58±18.10 105.40±20.44 103.06±23.38 107.77±12.16 Ccr(ml/min) 95.55±23.13 98.53±25.74 96.74±35.91* 99.75±36.06 *P<0.05，与SBP<140且DBP<90组比较。 -
CIN的危险因素有很多，包括：年龄>60岁、肾功能不全、高血压、糖尿病、造影剂剂量大、使用具有肾毒性的药物等[12]，其中最危险的因素是存在慢性肾脏病，且疾病发展严重程度与发生CIN风险有关。当eGFR<30 ml/（min·1.73 m2）时，患者CIN发病率是正常人群的3倍[13]。本研究纳入的患者肾功能基础水平均处于正常值，造影前均进行了标准水化治疗，且造影剂用量低于易发生CIN的200 ml[14]，又排除了其他对肾功能有影响的药物，因此未观测到CIN的发生。
Scr、BUN、eGFR、Ccr都是常见的用以评价肾功能的指标。其中，Scr受年龄、饮食、肌肉指数等众多因素影响，其浓度上升需要时间且只有在eGFR下降到50%时才升高，因此难以用于早期预测CIN的发生[15]。BUN与Scr相似，灵敏度与特异性较差。除了肾功能之外，BUN的浓度还取决于每日膳食蛋白摄入量、肾血流量、肝功能和患者的水合作用。有趣的是，在本研究中，除了单纯水化组以外，服用抗高血压药的患者在使用造影剂的短期内BUN水平都有轻微幅度的下降，这可能是因为其影响肾功能血流量，导致肾功能短暂性的失调，临床意义不大。在造影前评估基础肾功能损害（主要依靠eGFR）是预测患者发生CIN危险的最重要的标志。本研究中，除了β受体阻滞剂组eGFR水平在造影后有轻微下降，其余ACEI/ARB、CCB组未见明显变化。但β受体阻滞剂组的下降是在正常范围内且β受体阻滞剂作为冠心病患者用来降低心率的基础用药，并不建议术前停用。但对于发生急性肾损伤或eGFR<30 ml/（min·1.73 m2）的患者，在临床可行的情况下，还是应当谨慎去除非必要的潜在肾毒性药物[16]。另外，根据研究结果，应当格外关注那些本身基础血压控制不佳的人群，在确定无CIN发生的前提下，肾功能恢复至基线水平后，再重新启动药物治疗。
此外，作为一项回顾性分析，本研究也存在一定的局限性。①未探讨造影剂对不同肾功能损伤患者的影响。②评估的是短期内肾功能的变化，而未长期动态跟踪造影剂术后一段时间内降压药对肾功能的影响。③CIN的早期预测指标不够全面，目前研究发现的一些更敏感的生物标记物，如肾阻力指数（RRI）、肾损伤分子（KIM-1）、胱抑素C（CysC）可被选择。④未对高血压药物详细再分类，且药物使用周期未进行分层分析，忽略了长期用药对结果可能产生的影响。因此，期待未来有更多前瞻性的、大样本量的研究去进一步指导临床安全用药。
Effects of antihypertensive drugs on renal function after percutaneous transluminal coronary angioplasty
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摘要:
目的 评估经皮冠状动脉腔内成形术后应用抗高血压药对患者肾功能损伤的影响。 方法 回顾分析2020年1月至2020年12月在南京鼓楼医院心血管内科行经皮冠状动脉腔内成形术治疗并且规律服用抗高血压药物的患者，共193例。根据用药种类不同分为4组：血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂（ACEI/ARB）组、β受体阻滞剂组、钙离子通道阻滞剂（CCB）组、单纯水化组，所有患者围术期均给予常规水化。比较患者手术前后肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肾小球滤过率（eGFR）、肌酐清除率（Ccr）的水平变化。 结果 4组患者造影剂术后造影剂肾病的发生率为0。与术前相比，4组患者在Scr与Ccr水平上无明显变化，除单纯水化组，其余3组在术后BUN水平降低，其中，β受体阻滞剂组显著降低，且与单纯水化组、CCB组存在统计学差异。此外，β受体阻滞剂组术后eGFR水平也显著降低，其中，血压高值的患者（SBP≥140或DBP≥90）在术前Scr 与Ccr水平即与正常血压者（SBP<140且DBP<90）存在差异。 结论 冠状动脉造影术前使用ACEI/ARB与CCB类抗高血压药对患者短期内肾功能无影响，β受体阻滞剂可能轻微降低肾功能，应对高血压人群特别关注。 -
关键词:
- 经皮冠状动脉腔内成形术 /
- 造影剂肾病 /
- 血管紧张素转化酶抑制剂 /
- 血管紧张素受体拮抗剂 /
- β受体阻滞剂 /
- 钙离子通道阻滞剂
Abstract:Objective To evaluate the effects of antihypertensive drugs on renal function after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Methods A retrospective analysis was performed on 193 patients who underwent percutaneous transluminal coronary angioplasty and took antihypertensive drugs regularly. Those patients were admitted to Nanjing Drum Tower Hospital during January 2020 to December 2020. The patients were divided into ACEI/ARB group, β-blockers, calcium channel blockers and hydration control group. All patients received routine hydration during the perioperative period. The changes of serum creatinine (Scr), blood urea nitrogen (BUN), estimated glomerular filtration rate(eGFR) and endogenous creatinine clearance rate (Ccr) before and after operation were compared. Results The incidence of CIN was 0% in four groups. Compared with the preoperative, there was no significant change in Scr and Ccr in every group. Except for the hydration control group, the BUN levels in three treated groups were reduced after postoperative. Specifically, the BUN reduction in β-blockers group has statistically significant difference compared to the hydration control group and CCB group. In addition, eGFR levels were significantly reduced in the β-blockers group. Preoperative Scr and Ccr levels in patients with high blood pressure (SBP≥140 or DBP≥90) were significantly different from the patients with normal blood pressure (SBP<140 and DBP<90). Conclusion The use of ACEI/ARB and CCB before percutaneous transluminal coronary angioplasty had no effect on renal function in the short term. β-blockers can slightly reduce renal function, especially in patients with high blood pressure, who should receive special attention. -
脑卒中是人类疾病中最常见的脑血管疾病，已经成为人类死亡的第二大原因[1]。脑卒中引起的一系列并发症和后遗症给患者家庭带来了不可估量的负担。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种，其中，缺血性脑卒中又称脑中风，是脑卒中主要的发病方式，约占脑卒中患者的83%以上[2]。目前，尚无有效的治疗药物用于脑卒中引起的损伤，尤其是对于神经损伤的治疗[3]。活性多肽GRGDS是由甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS）5种氨基酸构成，主要通过形成一个β转角的方式与其他细胞发生黏连[4]，因而，能够阻断细胞外基质和细胞表面整合素的结合和黏附，可应用于组织工程或者癌症和肿瘤方面。本试验采用PC12细胞体外模拟脑缺血模型，探讨活性多肽GRGDS对氧糖剥夺损伤后的PC12细胞是否具有保护作用。
1. 材料
1.1 细胞株
PC12细胞购自ATCC细胞库，培养在含有10%胎牛血清的完全培养液中，每12 h观察一次细胞的生长状态，每24 h更换一次细胞培养液，待细胞长到80%进行传代。
1.2 药物与试剂
活性多肽GRGDS（上海淘普生物科技有限公司）；高糖DMEM培养液、DMEM无糖培养液（Gibco公司）；凋亡试剂盒、蛋白质提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗体：β-肌动蛋白（β-actin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-SAPK/JNK)、Bax蛋白（美国CST公司）。
1.3 仪器
细胞培养箱、酶标仪（美国Thermo公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；细胞缺氧装置（美国Billips-Rothenberg公司）；流式细胞仪（BDBiosci-ences公司）；Western blot图像扫描仪（美国Odyssey公司）。
2. 方法
2.1 PC12细胞氧糖剥夺损伤模型的建立
氧糖剥夺模型参照文献[5]体外模拟脑缺血模型，即OGD模型，再根据实验过程中的实际情况稍作改造。将细胞培养在培养板中，待细胞生长至培养板底面积80%以上，将对照组的培养液换成无血清高糖完全培养液，OGD组换成无糖培养液，活性多肽GRGDS给药组换成加有GRGDS药物处理的无糖培养液。将含有3组细胞的培养板置于恒温培养箱中孵育1 h，然后将模型组和给药组的细胞置于缺氧装置中，通入混合气体（95%N2，5%CO2），使装置内的氧气完全排出，分别将细胞缺糖和缺氧2、4、6、8 h后取出，采用MTT法选出细胞损伤的最佳时间，进行后续试验研究。
2.2 MTT法测定细胞活力
将PC12细胞以2.0×105个/ml的密度铺于96孔板中，按照“2.1”项下方法进行操作，在缺糖、缺氧之前，将给药组细胞的培养液换成含有不同浓度的活性多肽GRGDS（10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μg/ml）的无糖培养液置于培养箱中适应1 h，OGD组和给药组一同置于缺氧装置中缺氧4 h。缺氧过后取出培养板，在避光条件下将所有组的细胞加入每孔20 μl提前配好的0.5%MTT溶液（5 mg/ml），用锡箔纸包好将其放入37 ℃恒温培养箱中，继续孵育4 h后弃掉上清液，再向每个细胞培养孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，温室振荡5 min，用全自动酶标仪在492 nm波长处检测每个孔中细胞的吸光值（A）。
2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
将PC12细胞铺于6孔板中，待细胞贴壁后将OGD组中的培养液换成无糖DMEM培养液，给药组中的培养液换成加有活性多肽GRGDS处理的无糖DMEM培养液，恒温孵育1 h后置于缺氧装置中缺氧4 h，缺糖、缺氧后弃掉每孔中的细胞上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，洗掉细胞表面残留的培养液，再用不含依地酸(EDTA)的胰蛋白酶消化液消化1～2 min。将各组细胞置于不同的离心管中，以1200 r/min离心5 min，弃上清液，再加入PBS，将细胞进行重悬后再离心。离心后弃掉上清液，每个离心管中加入500 μl的1×缓冲液轻轻吹打混匀，避光条件下向各离心管中加入5 μl的细胞凋亡检测试剂(annexin V-FITC)，室温放置5 min后，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色液。充分混匀后室温避光放置15 min，用流式细胞仪进行检测。
2.4 ELISA检测OGD后PC12细胞相关炎症因子的变化
将PC12细胞氧糖剥夺后取细胞上清液，4 ℃、300 r/min，离心15 min。离心后取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，若不能及时检测，应将上清液放在−20 ℃冷冻保存。按照试剂盒中的说明书建立标准曲线，检测各组样本吸光值，并计算其浓度。
2.5 Western blot检测相关蛋白的表达
将氧糖剥夺损伤后的各组细胞上清液弃掉，用预冷的PBS清洗细胞表面残留的培养液，用细胞刮刀将各组细胞刮掉，置于预冷的RIPA裂解液中裂解30 min，使细胞中的蛋白完全裂解，以12 000 r/min，离心10 min，取上清液。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。各组蛋白中加入20 μl 5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min。10%SDS-PAGE分离蛋白，转膜，用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭1 h，孵育一抗4 ℃环境下过夜，回收一抗，洗膜3次（5 min/次），室温条件下加二抗，避光孵育2 h后洗膜。使用Western blot图像扫描仪扫描并统计结果。
2.6 统计学分析
所有实验数据均以（
$\bar x $ ± s）表示，并采用单因素方差分析比较组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。3. 结果
3.1 活性多肽GRGDS对OGD损伤的PC12细胞的保护作用
为了选择合适的缺糖缺氧时间，本实验设置了2、4、6、8 h的时间点，结果显示，细胞生存率随着氧糖剥夺时间的增长而显著降低，与对照组相比有显著性差异（P<0.01），且缺糖缺氧4 h细胞明显皱缩，细胞活性明显降低，细胞的损伤率达到50%，此时的损伤率有利于药物补救，更有助于细胞的恢复，因此，氧糖剥夺损伤时间为4 h条件最佳（图1A）。活性多肽GRGDS给药浓度为0.01 μg/ml，可显著提高缺糖缺氧4 h后PC12细胞的活力（P<0.01）。因此，选择缺糖缺氧4 h，给药浓度0.01 μg/ml作为实验条件进行后续研究（图1B）。
图 1 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞的影响（n=3）A.不同的氧糖剥夺时间；B.不同的GRGDS药物浓度（μg/ml）**P<0.01，与对照组比较；#P<0.05，与OGD组比较。3.2 活性多肽GRGDS降低OGD后PC12细胞的凋亡
将细胞以2.0×105个/ml细胞密度铺于6孔板中，培养16 h后，将OGD组细胞的高糖培养液换成无糖的DMEM培养液，给药组细胞的高糖培养液换成给予活性多肽GRGDS药物处理的无糖DMEM培养液，37 ℃恒温培养箱中平衡1 h，缺氧4 h，而正常对照组细胞的培养液换成新的高糖DMEM培养液继续培养。缺糖缺氧结束后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。图2结果显示，与正常对照组比较，OGD组细胞的凋亡率显著增加（P<0.01），由正常对照组（2.26±0.61）%上升到（12.14±1.69）%。给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，细胞凋亡率明显降低，凋亡率降至（6.94±1.45）%（P<0.01）。
图 2 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞凋亡率的影响（n=3）A.细胞凋亡情况；B.细胞凋亡比例**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。3.3 活性多肽GRGDS降低OGD后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量
正常对照组细胞上清液中TNF-α的含量为（27.16±2.69）pg/ml，两者相比，OGD组细胞中的TNF-α含量明显增加（P<0.01），为（54.51±2.89）pg/ml；与OGD比较，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理的细胞上清液TNF-α的含量显著降低，为（38.32±18）pg/ml（P<0.01，图3A）。正常对照组细胞上清液IL-1β的含量为（15.4±0.11）pg/ml，OGD组细胞上清液中IL-1β的含量为（35.99±2.25）pg/ml，两者相比，OGD中的IL-1β含量显著增加（P<0.01）。与OGD比较，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理的细胞上清液中IL-1β的含量显著降低，为（21.84±1.18）pg/ml（P<0.01，图3B）。
图 3 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β的影响（n=3）A.TNF-α含量；B.IL-1β含量**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。3.4 活性多肽GRGDS降低OGD后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白的表达
本实验检测了MAPKs信号通路中的JNK信号通路中相关蛋白表达的影响。结果如图4所示，PC12细胞经过氧糖剥夺损伤后，细胞中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达与正常对照组细胞相比均显著升高（P<0.01）；而给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，可明显降低氧糖剥夺损伤后细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白的表达（P<0.01）。
图 4 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达的影响（n=3）A. p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的Western blot经典图；B. p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白灰度值**P<0.01，与正常对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。3.5 活性多肽GRGDS降低OGD后PC12细胞中加入JNK抑制剂p-JNK、Bax蛋白的表达
将原始浓度为10 mmol/ml的JNK抑制剂（SP600125）稀释成10 μmol/ml的浓度加入到PC12细胞中，缺糖缺氧后提取细胞蛋白分别检测p-JNK及其下游Bax蛋白的表达情况。结果如图5所示，OGD组细胞中p-JNK、Bax的蛋白表达与正常对照组细胞相比都显著增加（P<0.01）；给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度以及JNK抑制剂处理后，p-JNK、Bax蛋白的表达水平与OGD组相比均明显降低（P<0.01）。
图 5 活性多肽GRGDS对OGD的PC12细胞加入JNK抑制剂后p-JNK、Bax蛋白表达的影响（n=3）A. p-JNK、Bax蛋白的Western blot经典图；B. p-JNK、Bax蛋白灰度值**P<0.01，与正常对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。4. 讨论
缺血性脑卒中是由血管阻塞引起的脑血液循环障碍诱发的神经系统损伤，致死、致残率较高，且病理机制十分复杂，目前医学上仍缺乏行之有效的治疗方法。在急性缺血的早期阶段，细胞凋亡可能是对氧糖剥夺的一种自我保护反应，有助于维护重要细胞的生存。然而，在局部缺血的大部分期间，钙超载、氧自由液和溶酶体酶的释放均会导致细胞坏死[6]。
最新研究表明，活性多肽GRGDS可激活体内干细胞，促进细胞的增长和分化[7]。但是，活性多肽GRGDS对于PC12细胞凋亡引起的一系列炎症反应的作用尚未见研究报道。因此，本实验研究了活性多肽GRGDS对氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡和凋亡反应的抑制作用，并初步探讨其可能存在的药理和药效机制。首先，建立氧糖剥夺损伤的PC12细胞模型，同时加入不同给药剂量浓度的活性多肽GRGDS进行处理。结果发现，活性多肽GRGDS的不同给药剂量浓度可有效抑制氧糖剥夺PC12细胞的损伤，并且当活性多肽GRGDS的剂量浓度为0.01 μg/ml时药物作用效果最佳。故确定0.01 μg/ml浓度作为机制探讨剂量。
TNF-α是一种促炎性多效细胞因子，研究表明，TNF-α可以通过激活转录因子NF-κB的机制阻止神经元的死亡或凋亡，从而诱导Mn-SOD和Bcl-2的表达[8]。TNF-α在大脑发育过程中起着效应分子的作用，经常参与不同的信号通路，激活巨噬细胞和神经胶质细胞，促进神经毒素的产生，并启动神经细胞的凋亡或死亡过程[9]。IL-1β作为一种炎症和免疫源性细胞因子，可在多个环节参与脑缺血损伤机制。研究表明，大量炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α）参与脑缺血再灌注损伤后脑细胞的凋亡和坏死[10]。因此检测了氧糖剥夺损伤的PC12细胞上清液，结果显示，氧糖剥夺损伤后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量显著增加，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，上清液中的TNF-α和IL-1β含量明显降低。
本研究结果显示，经过氧糖剥夺损伤后，PC12细胞的凋亡率明显增加，而给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后PC12细胞的凋亡率显著下降，这提示了活性多肽GRGDS可能通过抑制PC12的凋亡而发挥神经保护作用。为了进一步研究活性多肽GRGDS是否通过抗凋亡作用发挥对PC12细胞的保护作用，本实验试着对凋亡信号通路中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3等相关蛋白的表达进行了检测。据报道，caspase 3是细胞凋亡中的关键部分，是其信号传导的效应通路。caspase 3可能通过线粒体、内质网和死亡受体三种途径激活体内细胞中的死亡信号。缺血性脑卒中一般会引起体内线粒体细胞色素c的释放导致caspase 3的表达、激活和裂解，从而促进细胞凋亡。在细胞死亡引起的凋亡过程中，cleaved caspase 3的表达会增加[11]。研究发现，MAPK可以参与调节多种信号通路诱导或减轻细胞凋亡，活化的JNK会引起脑缺血应激反应的细胞凋亡，而JNK抑制剂在脑缺血再灌注损伤后提供神经保护作用。Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡Bcl-2（Bcl-xL）和促凋亡Bax蛋白之间的动态平衡在决定脑缺血期间的细胞命运中起关键作用。越来越多的证据表明，Bcl-2（Bcl-xL）/Bax比率的增加抑制Bax易位至线粒体并保护神经元免受细胞凋亡的损伤，而平衡向Bax过量的转变会引起缺血诱导的神经细胞凋亡。本研究结果显示，氧糖剥夺损伤后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白的表达水平显著升高，综合流式细胞仪检测氧糖剥夺损伤后PC12细胞凋亡的结果，表明活性多肽GRGDS可能通过抑制凋亡信号通路中的JNK/Bax信号通路，进而抑制氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡反应，最终发挥神经保护作用。
本研究结果表明，活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度可以明显抑制氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡，降低细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量，并通过调控JNK/Bax信号通路蛋白的表达发挥神经保护作用。活性多肽GRGDS可能在脑缺血中对PC12细胞引起的损伤具有一定的神经保护作用。进一步的研究还需在动物模型上进行更深一层的体内药效试验解释活性多肽GRGDS对缺血性脑卒中的影响及其作用机制，为活性多肽GRGDS在临床上用于缺血性脑卒中的药物治疗提供良好的药理学基础。
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表 1 4组患者基本资料比较[n(%),
$\bar x$ ±s]组别 年龄（岁） 男性 BMI（kg/m2） 收缩压
（mmHg）舒张压
（mmHg）TC
（mmol/L）TG
（mmol/L）HDL-C
（mmol/L）LDL-C
（mmol/L）单纯水化组（n=50） 60.58±11.35 28(56) 23.96±2.91 130.62±16.99 79.98±13.04 4.48±0.91 1.43±0.84 1.26±0.34 2.55±0.71 β-受体阻滞剂组(n=47) 64.40±11.61 32(68) 25.13±3.60 125.79±15.93 74.89±13.19 4.03±0.99 1.50±0.91 1.09±0.35 2.30±082 ACEI/ARB组（n=50） 65.04±6.52 25(50) 24.37±3.05 134.86±17.17 76.52±10.29 4.15±0.97 1.60±0.91 1.16±0.30 2.28±0.80 CCB组(n=46) 65.67±9.25 26(57) 24.45±2.81 139.43±14.57 78.91±9.28 4.23±0.87 1.34±0.61 1.20±0.30 2.38±0.74 组别 UA(μmol/L) FBG
（mmol/L）造影剂用量（ml） Scr
(μmol/L)BUN
（mmol/L）eGFR[ml/
（min·1.73 m2）]eGFR>90 [ml/
（min·1.73 m2）]eGFR<60 [ml/
（min·1.73 m2）]Ccr
(ml/min)单纯水化组（n=50） 330.48±82.36 5.35±1.06 122.32±56.11 63.62±16.01 5.25±1.17 112.04±27.17 11（22） 1（2） 97.86±29.83 β-受体阻滞剂组(n=47) 378.19±87.31 5.32±1.87 124.83±60.38 66.30±14.61 5.32±1.48 107.05±19.59 8（17） 1（2） 95.88±26.84 CEI/ARB组（n=50） 363.88±98.07 5.50±1.25 121.79±59.22 64.94±12.69 5.48±1.30 103.26±20.23 12（24） 1（2） 89.91±23.94 CCB组(n=46) 343.87±81.79 5.40±1.58 126.48±58.76 63.57±13.90 5.51±1.34 106.93±20.12 8（17） 1（2） 91.98±28.75 
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表 2 4组患者造影前后肾功能指标的比较
组别 Scr(μmol/L) BUN（mmol/L） eGFR[ml/（min·1.73 m2）] Ccr(ml/min) 术前 术后48 h 术前 术后48 h 术前 术后48 h 术前 术后48 h 单纯水化组（n=50） 63.62±16.01 64.04±16.66 5.25±1.17 5.34±1.33 112.04±27.17 110.27±25.58 97.86±29.83 97.42±30.39 β受体阻滞剂组(n=47) 66.30±14.61 64.53±14.00 5.32±1.48 4.71±1.01*▲ 107.05±19.59 105.61±18.35▲ 95.88±26.84 98.88±28.55 ACEI/ARB组（n=50） 64.94±12.69 64.98±13.28 5.48±1.30 5.26±1.47 103.26±20.23 103.23±20.29 89.91±23.94 90.02±24.70 CCB组(n=46) 63.57±13.90 63.28±13.27 5.51±1.34 5.42±1.30# 106.93±20.12 111.52±24.62 91.98±28.75 92.20±30.06 *P<0.05，与单纯水化组比较；#P<0.05，与β受体阻滞剂组比较；▲P<0.05，与同组术前比较。
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表 3 β受体阻滞剂组不同血压水平造影前后肾功能指标的比较
肾功能指标 SBP＜140且DBP＜90（n=34） SBP≥140或DBP≥90（n=13） 术前 术后48 h 术前 术后48 h Scr(μmol/L) 64.85±11.72 63.28±11.79 70.08±20.49* 67.81±18.78 BUN（mmol/L） 5.31±1.59 4.71±1.05 5.36±1.19 4.71±0.92 eGFR(ml/（min·1.73 m2) 108.58±18.10 105.40±20.44 103.06±23.38 107.77±12.16 Ccr(ml/min) 95.55±23.13 98.53±25.74 96.74±35.91* 99.75±36.06 *P<0.05，与SBP<140且DBP<90组比较。
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