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麻黄碱是中药麻黄的主要有效成分，但它也可以引起中枢神经系统毒副作用。麻黄碱属于小分子生物碱，能够通过血脑屏障对神经细胞产生直接毒性作用 [1-4]。然而，有关麻黄碱神经毒性的作用机制并不完全清楚。脑源性神经营养因子(BDNF)已被证实参与学习、记忆等多种中枢神经系统的活动[5]。突触后致密蛋白是突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的蛋白，其中PSD95是主要成分之一[6]。而synapsin1是维持突触前膜功能的重要成分之一[7]。BNDF、PSD95和synapsin1与神经元结构完整性和功能的完备性密切相关。本研究以PC12细胞为研究对象，考察麻黄碱的细胞毒性，同时检测BDNF、PSD95和synapsin1表达水平的变化，初步探讨麻黄碱引起细胞毒性的可能机制。
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盐酸麻黄碱（批号：D03150702，赤峰艾克制药科技有限公司）；BDNF抗体（批号：ab108319）、PSD95抗体（批号：ab18258）、synapsin1抗体（批号：ab64581）均购自英国Abcam公司。
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PC12细胞购自中科院细胞库。
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电子天平（德国Sartorious公司）；孵育箱（Thermo公司）；酶标仪（BioTek公司）；Western blot设备（美国Bio-Rad公司）。
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将培养瓶里的PC12细胞接种到96孔板上，每孔接种6000个细胞，用含1%FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基，1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、20 mmol，继续培养24 h后，加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT，继续孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μl的DMSO（二甲基亚砜），轻微震荡10 min，在酶标仪检测570 nm处的光密度(OD)值。
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将培养瓶的PC12细胞接种到12孔板中，用含1%FBS的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为10、500、1000 μmol，继续培养24 h后，在倒置显微镜下明场视野观察细胞形态变化。
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将6孔板每孔接种105个PC12细胞，用含1%FBS的RPMI1640培养12 h，换上基础培养基RPMI1640，1h后分别加入不同浓度的麻黄碱，其终浓度分别为1、10、100、500、1000 μmol，继续培养24 h后，迅速将培养基吸弃，置于−30℃冷冻数小时，然后在冰上每孔加相应量的RIPA（含1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂）裂解液，4℃震荡30 min，将细胞裂解液收集到相应离心管里，4℃低温高速(12000 r/min)离心10 min。取出上清，蛋白浓度检测(BCA)试剂盒测定蛋白浓度后，加入相应量的5×的上样缓冲液和适量的RIPA裂解液，95℃加热10 min制样。制胶上样，样品80 V电泳结束后，400 mA电流90 min转移至PVDF（聚偏氟乙烯膜）后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，按分子量切出相应条带，分别孵育相应一抗过夜，洗涤后室温孵育相应二抗2 h，漂洗后，增强化学发光(ECL)法显影。
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实验数据以
$ \bar x \pm s $ 表示。应用SPSS 20.0统计软件，采用单向方差分析法处理试验结果。首先进行Levene方差齐性检验，方差齐性且整体比较组间有显著性差异时，采用LSD法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较；若方差不齐，则作Welch检验，方差分析有显著性差异时，采用Dunnett’s T3法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较。 -
MTT结果如图1所示，麻黄碱在一定范围内对PC12细胞有一定的毒性，经拟合计算在PC12细胞中麻黄碱的IC25值为0.536 mmol，IC50值为2.8 mmol。
图 1 麻黄碱细胞活性试验（MTT法）
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PC12细胞形态学变化如图2所示，在20倍镜下观察，随着麻黄碱浓度的升高细胞数量与空白对照组相比逐渐减少，细胞突触数量也随之减少。1000 μmol浓度处理条件下，轴突长度显著减短，细胞体边缘模糊，细胞体积显著变小。
图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
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图3结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中BDNF的蛋白表达量增加。当麻黄碱浓度为500 μmol时，BDNF的表达量约为空白对照组的1.58倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度高达 1000 μmol时，BNDF为对照组的1.91倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中BDNF表达升高。
图 3 麻黄碱对BDNF表达水平变化的影响
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图4结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中PSD95的表达增加。麻黄碱浓度为500 μmol时，PSD95的蛋白表达水平约为空白对照组的1.38倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，PSD95表达量约上升为对照组的1.52倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中PSD95表达升高。
图 4 麻黄碱对PSD95表达水平变化的影响
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图5结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中synapsin1的表达量有下降的趋势。其中，麻黄碱浓度为500 μmol时，synapsin1的蛋白表达水平约为空白对照组的0.65，具有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，synapsin1表达量下降至对照组的0.53(P<0.001)。说明麻黄碱在该浓度范围内可以引起PC12细胞中synapsin1表达降低。
图 5 麻黄碱对synapsin1表达水平变化的影响
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麻黄历来被中医冠以“解表第一要药”，是治疗外感风寒表实证的重要中药，主要用于风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿等，麻黄汤就是以麻黄为君药的治疗表寒实证的代表名方。然而前期研究发现，给予大鼠连续灌胃麻黄，可以造成大鼠不同脑区损伤，其中对额叶皮层影响较大，HE染色结果甚至观察到神经元凋亡早期的形态学改变 [8-9]。已经证实麻黄中对中枢神经系统有兴奋毒性作用的主要成分是麻黄碱。麻黄碱的神经毒性可能与升高兴奋性谷氨酸水平有关，过量的兴奋性谷氨酸能引起多巴胺神经末梢的破坏和额叶皮层、丘脑、边缘系统的神经变性。为了明确麻黄引起中枢神经系统毒性的机制，本研究中将麻黄碱单体作为研究对象，考察其在体外细胞模型中的毒性作用。
PC12细胞源于鼠嗜铬细胞瘤，在结构上和功能上与神经元有高度相似的地方，因其可重复性好，被广泛应用于中枢神经系统的研究。本研究首先考察了不同浓度麻黄碱对PC12细胞存活率的影响，确定了麻黄碱引起细胞毒性的浓度范围。在此基础上，分别考察不影响细胞存活率情况下（IC25值以下浓度）及显著影响细胞存活率情况下（IC25值以上浓度），麻黄碱对中枢神经系统中相关功能蛋白的影响。
BDNF是神经营养因子家族的肽生长因子的一员。在体实验发现，BDNF在大脑海马的CA1区可通过促进兴奋性突触的发育来增强突触强度。同时，BDNF可以在皮层神经元中增加介导中枢神经中快速兴奋性突触传递的AMPA受体的表达，提高动物兴奋性[10-13]。而外源性的BDNF则可以通过增强突触间的传递，增强海马神经元的兴奋性 [14]。以上研究表明，BDNF与神经细胞的兴奋性密切相关。PSD95定位于突触后膜，是高电子密度的半圆形区域形成的突触后致密区的主要组成部分之一。研究发现在海马神经元中过表达PSD95可以促进成熟谷氨酸能突触以及谷氨酸受体的活性 [6,15]。PSD95链接了兴奋性受体NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受体）和下游信号分子，并且在神经元成熟以及突触的形成中发挥着重要作用[16]。尽管在多数神经退行性病变中，提高BDNF和PSD95的表达水平可以显著改善行为学，但是也有研究表明在生理状态下，神经元的过度激活会引起神经元的功能的减退甚至导致神经损伤。由于BDNF和PSD95与神经元兴奋性关系密切，在前期的行为学实验中，表明麻黄碱灌胃给药会引起大鼠自主活动的增加，并激活神经元，故我们在考察麻黄碱产生细胞毒性的机制时，检测了BDNF和PSD95的蛋白表达水平。结果显示，随着麻黄碱浓度的增加，BDNF和PSD95的表达水平浓度依赖性地升高，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱可以引起体外神经细胞模型的兴奋状态。
与此同时，通过观察细胞形态变化，发现一定剂量的麻黄碱会引起PC12细胞突触数量下降和长度减短，说明麻黄碱会引起突触丢失。文献研究表明，synapsin1是突触的重要标志物，可以反应突触形态上的完整性和功能[7]。由此，我们在考察麻黄碱对PC12细胞形态影响的同时，采用Western blot检测了synapsin1的表达水平。梯度浓度麻黄碱处理PC12细胞后synapsin1的表达变化结果表明随着麻黄碱处理浓度的增加，synapsin1的表达水平降低，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱有一定的细胞毒性的同时，也可以引起神经细胞的突触毒性，突触蛋白的丢失可能也是引起神经细胞毒性的原因之一。
综上所述，本实验结果表明麻黄碱可以对PC12细胞产生毒性。与正常细胞相比，麻黄碱处理组的细胞在形态学上发生了明显的变化，BDNF和PSD95等与兴奋性相关的蛋白表达出现了明显升高，而与突触功能有关的蛋白synapsin1表达出现了明显下降，说明麻黄碱产生中枢神经系统毒副作用的机制与BDNF、PSD95及synapsin1的表达变化有关。
Effects of ephedrine on the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells
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摘要:
目的 考察麻黄碱对PC12细胞内的脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白95(PSD95)和神经突触素1(synapsin1)表达水平的影响，探讨麻黄碱对PC12细胞毒性的作用机制。 方法 通过不同浓度的麻黄碱处理PC12细胞后，采用噻唑蓝试剂(MTT)法测定细胞存活率；采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化；采用蛋白印迹(Western blot)法检测BDNF、PSD95和synapsin1的蛋白表达水平。 结果 麻黄碱呈浓度依赖性降低PC12细胞活力，其引起PC12细胞死亡的IC25和IC50分别为0.536 mmol和2.8 mmol。随着麻黄碱浓度的升高，PC12细胞体积变小，边界模糊，突触数减少，轴突长度减短；BDNF和PSD95的表达水平明显升高；synapsin1的表达水平有所降低。 结论 麻黄碱对PC12细胞的毒性作用机制可能与影响BDNF、PSD95和synapsin1的表达水平有关。 Abstract:Objective To investigate the effects of ephedrine on the expression levels of brain-derived neurotropic factor (BDNF) and postsynaptic density protein 95 (PSD95) and synapsin1 in PC12 cells, and to explore the mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12. Methods After PC12 cells were treated with different concentration of ephedrine, the cell survival rate was measured by the methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. The morphology changes of PC12 cells were observed by an inverted microscope. Western blot was used to detect the protein expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells. Results Ephedrine decreased the viability of PC12 cell in a concentration-dependent manner,with an IC25 and IC50 of 0.536 mmol and 2.8 mmol, respectively, for PC12 cell death. As ephedrine concentration increased, PC12 cells became smaller in size, with blurred boundary blurred, reduced synapses and shorter axon lengths. The expression levels of BDNF and PSD95 increased significantly. Meanwhile the expression level of synapsin1 decreased. Conclusion The mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12 may be related to the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1. -
山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br. 或山楂 Crataegus pinnati- fida Bge. 的干燥成熟果实，焦山楂为其炒制品[1]。现代药理研究证明，焦山楂抑菌作用强于生山楂，而某些特定菌群与消化功能密切相关[2]。而山楂炒焦后产生新的物质—类黑素，类黑素是在食品热处理过程中形成的。目前，类黑素的抗菌活性已得到证实。大多数类黑素对微生物作用的研究都是在特定的微生物生长培养基中进行的，这些研究表明类黑素可以刺激微生物生长[3]，也可以抑制微生物生长[4-5]。肠道菌群与人体健康密切相关，药物和功能食品可能通过调节肠道微生物来改善胃肠功能，帮助消化[6-7]。双歧杆菌和大肠杆菌是典型的有益菌和有害菌，双歧杆菌常被加入酸奶饮品中帮助消化。乙酸是双歧杆菌的主要代谢物质，随着乙酸的增多，pH值降低从而抑制大肠杆菌的生长繁殖。本实验通过研究山楂，焦山楂以及焦山楂炒制过程中产生的类黑素对大肠杆菌、双歧杆菌以及其代谢物乙酸的影响，探究“山楂炒焦长于消食导滞”的作用机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验仪器
低温培养箱（美墨尔特有限公司，德国），生物安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国），高压灭菌锅（三洋公司，日本），纯水机（密理博公司，美国），厌氧罐（北京陆桥技术股份有限公司，北京）；紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，上海）；7890B型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司，美国）；HP-FFAP型毛细管柱（货号：19091F-413，安捷伦科技有限公司，美国）；GM900型非接触红外测温仪（深圳聚茂源科技有限公司，深圳）。
1.1.2 实验试剂
MRS固体培养基、PYG液体培养基、厌氧产气袋和厌氧指示剂（北京陆桥技术股份有限公司）；蛋白胨、酵母粉（英国OXOID公司）；乙酸（98.85%，国药集团化学试剂有限公司，中国）；其余试剂均为分析纯。
1.1.3 山楂和实验菌株
净山楂饮片（四川同善堂中药饮片有限责任公司，批号：180501）；双歧杆菌（GDMCC1.1258）、大肠杆菌（ATCC25922）（中国科学院微生物研究所）。
1.2 方法
1.2.1 焦山楂的炮制
参照2015版《中国药典》一部山楂项下制备焦山楂。取生山楂150 g，中火（380～420）℃炒制10 min，至药材表面呈焦黄或焦褐色，内部颜色加深，并具有焦香气味，取出，常温封存，即得。
1.2.2 生山楂，焦山楂和类黑素浸膏的制备
（1）生山楂和焦山楂浸膏的制备
取生山楂和焦山楂各100 g进行水浸提，料液比为1:15，浸提8 h，浸提2次。生山楂和焦山楂浸提液分别在4 ℃下以3 600 r/min离心10 min，取上层清液各1 000 ml。将500 ml上层清液进行蒸发浓缩至胶状，停止加热，余温使其自然干燥，得生山楂浸膏13.75 g，焦山楂浸膏14.02 g。
（2）焦山楂中类黑素的提取
取焦山楂100 g，按照“1.2.2”项中⑴的方法提取得到1 000 ml上层清液。取500 ml上层清液蒸发浓缩得棕褐色浓缩液50 ml，进行大孔树脂吸附，室温吸附流速1.5 ml/min，60%乙醇作为洗脱剂，洗脱至色谱柱上无棕色为止，收集洗脱液500 ml。洗脱液蒸发浓缩至胶状，停止加热，余温使其自然干燥，得焦山楂类黑素浸膏13.12 g。
（3）类黑素的紫外检测
取类黑素浸膏1 g，蒸馏水溶解定容至100 ml，取10 ml溶液，分别定容至50 ml；因波长420 nm处是类黑素的特征吸收波长，测其特征吸收下的吸光度值，焦山楂类黑素浸膏吸光度值为0.492，说明焦山楂中类黑素提取成功。
1.2.3 山楂炮制品及类黑素对肠道菌群生长繁殖的影响
（1）双歧杆菌测试菌菌液的制备
以接种环自双歧杆菌标准菌种管挑取菌种，划线接种至MRS固体培养基，36 ℃厌氧培养48 h，挑取单菌落接种至PYG液体培养基，36 ℃厌氧培养48 h，以生理盐水调整浓度至1.0麦氏浓度，作为受试菌初始菌液，按10:1浓度加入试验体系。
（2）大肠杆菌测试菌液的制备
以接种环自大肠杆菌标准菌种管挑取菌种，划线接种至LB固体培养基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，加入1 L蒸馏水，以5 mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，121 ℃高压灭菌15 min备用），36 ℃有氧培养24 h，挑取单菌落接种至LB液体培养基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，加入1 L蒸馏水，以5 mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，121 ℃高压灭菌15 min备用），36 ℃有氧培养6 h，以生理盐水调整浓度至0.5麦氏浓度，作为受试菌初始菌液，按10:1浓度加入试验体系。
（3）样本药液的处理
准确称取生山楂，焦山楂和类黑素浸膏各10 g，加入100 ml去离子水，超声振荡处理，期间手动震摇数次，直至样本完全溶解，配制10%母液，并经115 ℃高压灭菌处理15 min后4 ℃保存备用。
（4）乙酸含量测定
①样本前处理：将经过微生物培养的溶液1 ml，经过高速离心机4 000 r/min离心，之后再过0.2 µm有机相滤头于进样瓶，样品量大于0.5 ml，或者使用内插管，上机测定。
②标准溶液及标准曲线：称取60.05 g乙酸于100 ml容量瓶，用一级水定容至刻度，摇匀，作为储备标准溶液，浓度为101.33 mmol/L。将标准储备溶液依次稀释1、3、10、20、100、200倍得标准工作溶液。
③色谱条件：洗针液为甲醇，进样量0.5 µl，进样口温度240 ℃；压力6.1219 psi；分流比10:1，流量为1.0 ml；升温程序：初始温度：100 ℃，保持0 min；梯度一：以5 ℃/min升到120 ℃，保持0 min；梯度二：以20 ℃/min升到200 ℃，保持10 min；总运行时间：18 min；检测器（FID）温度：240 ℃；空气流量：300 ml/min；氢气流量：33 ml/min；尾吹氮气流量：20 ml/min；数据采集频率/峰宽：20 Hz/0.01 min。
1.3 统计学方法
使用SPSS 22.0进行独立样本t检验，数据以平均数±标准差（
$\bar x \pm s$ ）表示，P<0.05认为存在显著性差异。2. 结果
2.1 乙酸标准曲线的建立
乙酸浓度在0.51～101.33 mmol/L线性关系良好。以乙酸峰面积（Y）为纵坐标，乙酸含量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=3.670 5X−4.300 8，r=0.999 0，残留标准误差为6.644 2，如图1所示。
2.2 山楂饮片及类黑素对双歧杆菌体外生长的影响
生山楂和焦山楂加速生长期双歧杆菌的生长繁殖，达稳定期后，由于生山楂中多种物质被分解，菌群产生大量代谢废物，于衰亡期加速双歧杆菌的衰亡；由于焦山楂中多种物质被分解，菌群产生大量代谢废物，于衰亡期加速双歧杆菌的衰亡；但因焦山楂中存在类黑素且其他物质较少，衰亡速率慢于生山楂组；类黑素加速生长期双歧杆菌的生长繁殖，但由于无其他物质，其生长速率慢于生山楂组，但在衰亡期中明显改变双歧杆菌生长规律，使生长期延长（生长速率变缓），双歧杆菌衰亡延后，如图2。
2.3 山楂饮片及类黑素对大肠杆菌体外生长的影响
生山楂促进大肠杆菌生长期前期的生长繁殖，但由于代谢废物的逐渐增加，乙酸堆积，使生长速率逐渐变缓；焦山楂促进大肠杆菌生长期前期的生长繁殖，但由于类黑素及代谢废物的影响使生长期变短，稳定期提前；类黑素对大肠杆菌生长期前期无明显影响，但生长期后期明显促进大肠杆菌的生长繁殖，如图3所示。
3. 讨论
3.1 焦山楂炮制工艺研究
《中国药典》一部中对焦山楂炮制方法为：取净山楂，中火条件下炒至药材表面焦褐色，内部焦黄色，并具有焦香气味。因无可控工艺参数，焦山楂炮制过程中易出现饮片表面以及内部颜色不均一，山楂炒制成品质量不稳定等情况。结合课题组前期实验，采用分别100、150、200和250 g净山楂为炮制对象，中火条件为（340～380）℃、（380～420）℃和（420～460）℃，炮制时间为8、10、12和14 min；不同质量同一批号的净山楂在不同的中火条件下炮制不同的时间，采用非接触式红外测温仪检测炒制温度，并以炒锅初温和山楂药材炒制末温辅助控温。实验筛选出150 g净山楂中火条件（380～420）℃下炒制10 min，可得到质量稳定，颜色均一的焦山楂。
3.2 焦山楂类黑素提取工艺研究
类黑素的提取方法主要是水浸提法，Borrelli等[8]在90 ℃条件下，采用1:6料液比，对咖啡中的类黑素进行水提；Langner等[9]在室温条件下采用1:12料液比，水浸提1 h，提取到土豆类黑素粗制品。类黑素成分复杂，提纯困难。目前，主要的纯化方法有大孔树脂、超滤和凝胶层析等方法。何健[10]等发现X-5大孔树脂是曲霉型豆豉类黑素的最佳吸附树脂。秦礼康等[11]利用S-8树脂分离得到豆豉两个类黑素组分。本实验在水浸提法的基础上进行改良，最终获得最优提取工艺。结果显示类黑色素在420 nm处有较强吸收[12]。
3.3 气相色谱条件的筛选
实验采用气相色谱法检测菌群代谢物乙酸的含量。参照文献[13-14]，结果显示其色谱条件对于本样品分析效果不佳；在柱温选择中，恒温法对乙酸检测效果不理想，峰形不稳定，因此实验采取梯度升温。经反复试验，最终获得正文中的检测参数，分离效果好，可作为本实验乙酸检测条件。
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图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
A. 空白对照；B. 10 μmol麻黄碱；C. 500 μmol麻黄碱浓度；D. 1000 μmol麻黄碱浓度；标尺：500 μm
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