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麻黄碱是中药麻黄的主要有效成分，但它也可以引起中枢神经系统毒副作用。麻黄碱属于小分子生物碱，能够通过血脑屏障对神经细胞产生直接毒性作用 [1-4]。然而，有关麻黄碱神经毒性的作用机制并不完全清楚。脑源性神经营养因子(BDNF)已被证实参与学习、记忆等多种中枢神经系统的活动[5]。突触后致密蛋白是突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的蛋白，其中PSD95是主要成分之一[6]。而synapsin1是维持突触前膜功能的重要成分之一[7]。BNDF、PSD95和synapsin1与神经元结构完整性和功能的完备性密切相关。本研究以PC12细胞为研究对象，考察麻黄碱的细胞毒性，同时检测BDNF、PSD95和synapsin1表达水平的变化，初步探讨麻黄碱引起细胞毒性的可能机制。
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盐酸麻黄碱（批号：D03150702，赤峰艾克制药科技有限公司）；BDNF抗体（批号：ab108319）、PSD95抗体（批号：ab18258）、synapsin1抗体（批号：ab64581）均购自英国Abcam公司。
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PC12细胞购自中科院细胞库。
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电子天平（德国Sartorious公司）；孵育箱（Thermo公司）；酶标仪（BioTek公司）；Western blot设备（美国Bio-Rad公司）。
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将培养瓶里的PC12细胞接种到96孔板上，每孔接种6000个细胞，用含1%FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基，1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、20 mmol，继续培养24 h后，加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT，继续孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μl的DMSO（二甲基亚砜），轻微震荡10 min，在酶标仪检测570 nm处的光密度(OD)值。
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将培养瓶的PC12细胞接种到12孔板中，用含1%FBS的RPMI 1640培养12 h后，吸弃原培养基，加入RPMI 1640基础培养基1 h后分别加入不同浓度的麻黄碱，使其终浓度分别为10、500、1000 μmol，继续培养24 h后，在倒置显微镜下明场视野观察细胞形态变化。
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将6孔板每孔接种105个PC12细胞，用含1%FBS的RPMI1640培养12 h，换上基础培养基RPMI1640，1h后分别加入不同浓度的麻黄碱，其终浓度分别为1、10、100、500、1000 μmol，继续培养24 h后，迅速将培养基吸弃，置于−30℃冷冻数小时，然后在冰上每孔加相应量的RIPA（含1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂）裂解液，4℃震荡30 min，将细胞裂解液收集到相应离心管里，4℃低温高速(12000 r/min)离心10 min。取出上清，蛋白浓度检测(BCA)试剂盒测定蛋白浓度后，加入相应量的5×的上样缓冲液和适量的RIPA裂解液，95℃加热10 min制样。制胶上样，样品80 V电泳结束后，400 mA电流90 min转移至PVDF（聚偏氟乙烯膜）后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，按分子量切出相应条带，分别孵育相应一抗过夜，洗涤后室温孵育相应二抗2 h，漂洗后，增强化学发光(ECL)法显影。
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实验数据以
$ \bar x \pm s $ 表示。应用SPSS 20.0统计软件，采用单向方差分析法处理试验结果。首先进行Levene方差齐性检验，方差齐性且整体比较组间有显著性差异时，采用LSD法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较；若方差不齐，则作Welch检验，方差分析有显著性差异时，采用Dunnett’s T3法进行多重比较，方差分析不显著时不进行多重比较。 -
MTT结果如图1所示，麻黄碱在一定范围内对PC12细胞有一定的毒性，经拟合计算在PC12细胞中麻黄碱的IC25值为0.536 mmol，IC50值为2.8 mmol。
图 1 麻黄碱细胞活性试验（MTT法）
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PC12细胞形态学变化如图2所示，在20倍镜下观察，随着麻黄碱浓度的升高细胞数量与空白对照组相比逐渐减少，细胞突触数量也随之减少。1000 μmol浓度处理条件下，轴突长度显著减短，细胞体边缘模糊，细胞体积显著变小。
图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
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图3结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中BDNF的蛋白表达量增加。当麻黄碱浓度为500 μmol时，BDNF的表达量约为空白对照组的1.58倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度高达 1000 μmol时，BNDF为对照组的1.91倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中BDNF表达升高。
图 3 麻黄碱对BDNF表达水平变化的影响
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图4结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中PSD95的表达增加。麻黄碱浓度为500 μmol时，PSD95的蛋白表达水平约为空白对照组的1.38倍，有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，PSD95表达量约上升为对照组的1.52倍(P<0.001)。说明该浓度范围内麻黄碱可以浓度依赖性的引起PC12细胞中PSD95表达升高。
图 4 麻黄碱对PSD95表达水平变化的影响
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图5结果显示，随着麻黄碱剂量的增加，PC12细胞中synapsin1的表达量有下降的趋势。其中，麻黄碱浓度为500 μmol时，synapsin1的蛋白表达水平约为空白对照组的0.65，具有统计学差异(P<0.05)；而当麻黄碱浓度达到1000 μmol时，synapsin1表达量下降至对照组的0.53(P<0.001)。说明麻黄碱在该浓度范围内可以引起PC12细胞中synapsin1表达降低。
图 5 麻黄碱对synapsin1表达水平变化的影响
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麻黄历来被中医冠以“解表第一要药”，是治疗外感风寒表实证的重要中药，主要用于风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿等，麻黄汤就是以麻黄为君药的治疗表寒实证的代表名方。然而前期研究发现，给予大鼠连续灌胃麻黄，可以造成大鼠不同脑区损伤，其中对额叶皮层影响较大，HE染色结果甚至观察到神经元凋亡早期的形态学改变 [8-9]。已经证实麻黄中对中枢神经系统有兴奋毒性作用的主要成分是麻黄碱。麻黄碱的神经毒性可能与升高兴奋性谷氨酸水平有关，过量的兴奋性谷氨酸能引起多巴胺神经末梢的破坏和额叶皮层、丘脑、边缘系统的神经变性。为了明确麻黄引起中枢神经系统毒性的机制，本研究中将麻黄碱单体作为研究对象，考察其在体外细胞模型中的毒性作用。
PC12细胞源于鼠嗜铬细胞瘤，在结构上和功能上与神经元有高度相似的地方，因其可重复性好，被广泛应用于中枢神经系统的研究。本研究首先考察了不同浓度麻黄碱对PC12细胞存活率的影响，确定了麻黄碱引起细胞毒性的浓度范围。在此基础上，分别考察不影响细胞存活率情况下（IC25值以下浓度）及显著影响细胞存活率情况下（IC25值以上浓度），麻黄碱对中枢神经系统中相关功能蛋白的影响。
BDNF是神经营养因子家族的肽生长因子的一员。在体实验发现，BDNF在大脑海马的CA1区可通过促进兴奋性突触的发育来增强突触强度。同时，BDNF可以在皮层神经元中增加介导中枢神经中快速兴奋性突触传递的AMPA受体的表达，提高动物兴奋性[10-13]。而外源性的BDNF则可以通过增强突触间的传递，增强海马神经元的兴奋性 [14]。以上研究表明，BDNF与神经细胞的兴奋性密切相关。PSD95定位于突触后膜，是高电子密度的半圆形区域形成的突触后致密区的主要组成部分之一。研究发现在海马神经元中过表达PSD95可以促进成熟谷氨酸能突触以及谷氨酸受体的活性 [6,15]。PSD95链接了兴奋性受体NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受体）和下游信号分子，并且在神经元成熟以及突触的形成中发挥着重要作用[16]。尽管在多数神经退行性病变中，提高BDNF和PSD95的表达水平可以显著改善行为学，但是也有研究表明在生理状态下，神经元的过度激活会引起神经元的功能的减退甚至导致神经损伤。由于BDNF和PSD95与神经元兴奋性关系密切，在前期的行为学实验中，表明麻黄碱灌胃给药会引起大鼠自主活动的增加，并激活神经元，故我们在考察麻黄碱产生细胞毒性的机制时，检测了BDNF和PSD95的蛋白表达水平。结果显示，随着麻黄碱浓度的增加，BDNF和PSD95的表达水平浓度依赖性地升高，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱可以引起体外神经细胞模型的兴奋状态。
与此同时，通过观察细胞形态变化，发现一定剂量的麻黄碱会引起PC12细胞突触数量下降和长度减短，说明麻黄碱会引起突触丢失。文献研究表明，synapsin1是突触的重要标志物，可以反应突触形态上的完整性和功能[7]。由此，我们在考察麻黄碱对PC12细胞形态影响的同时，采用Western blot检测了synapsin1的表达水平。梯度浓度麻黄碱处理PC12细胞后synapsin1的表达变化结果表明随着麻黄碱处理浓度的增加，synapsin1的表达水平降低，当浓度达到500 μmol时差异具统计学意义（P<0.05），说明麻黄碱有一定的细胞毒性的同时，也可以引起神经细胞的突触毒性，突触蛋白的丢失可能也是引起神经细胞毒性的原因之一。
综上所述，本实验结果表明麻黄碱可以对PC12细胞产生毒性。与正常细胞相比，麻黄碱处理组的细胞在形态学上发生了明显的变化，BDNF和PSD95等与兴奋性相关的蛋白表达出现了明显升高，而与突触功能有关的蛋白synapsin1表达出现了明显下降，说明麻黄碱产生中枢神经系统毒副作用的机制与BDNF、PSD95及synapsin1的表达变化有关。
Effects of ephedrine on the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells
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摘要:
目的 考察麻黄碱对PC12细胞内的脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白95(PSD95)和神经突触素1(synapsin1)表达水平的影响，探讨麻黄碱对PC12细胞毒性的作用机制。 方法 通过不同浓度的麻黄碱处理PC12细胞后，采用噻唑蓝试剂(MTT)法测定细胞存活率；采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化；采用蛋白印迹(Western blot)法检测BDNF、PSD95和synapsin1的蛋白表达水平。 结果 麻黄碱呈浓度依赖性降低PC12细胞活力，其引起PC12细胞死亡的IC25和IC50分别为0.536 mmol和2.8 mmol。随着麻黄碱浓度的升高，PC12细胞体积变小，边界模糊，突触数减少，轴突长度减短；BDNF和PSD95的表达水平明显升高；synapsin1的表达水平有所降低。 结论 麻黄碱对PC12细胞的毒性作用机制可能与影响BDNF、PSD95和synapsin1的表达水平有关。 Abstract:Objective To investigate the effects of ephedrine on the expression levels of brain-derived neurotropic factor (BDNF) and postsynaptic density protein 95 (PSD95) and synapsin1 in PC12 cells, and to explore the mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12. Methods After PC12 cells were treated with different concentration of ephedrine, the cell survival rate was measured by the methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. The morphology changes of PC12 cells were observed by an inverted microscope. Western blot was used to detect the protein expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1 in PC12 cells. Results Ephedrine decreased the viability of PC12 cell in a concentration-dependent manner,with an IC25 and IC50 of 0.536 mmol and 2.8 mmol, respectively, for PC12 cell death. As ephedrine concentration increased, PC12 cells became smaller in size, with blurred boundary blurred, reduced synapses and shorter axon lengths. The expression levels of BDNF and PSD95 increased significantly. Meanwhile the expression level of synapsin1 decreased. Conclusion The mechanism of ephedrine cytotoxicity on PC12 may be related to the expression levels of BDNF, PSD95 and synapsin1. -
动脉粥样硬化（AS）作为一种慢性进行性疾病，能够引发脑卒中等一系列心脑血管疾病，从而对人类生命健康产生极大的威胁。AS发病机制复杂，目前认为主要与炎症反应、血管内皮细胞损伤、氧化应激、血小板活化等有关[1]。西药他汀类降脂药被广泛应用于治疗动脉粥样硬化，但其仍存在一定的局限性[2]。中药由于其具有多组分多靶点协同作用，在治疗慢性复杂疾病方面具有独特的优势因而受到更加广泛的应用[3]。
麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill, SBP）源于宋朝《太平惠民合剂局方》中的苏合香丸[4]，收录于2020年版《中国药典》，是国家中药保密品种，上海和黄药业公司的独家生产品种。麝香保心丸由冰片、蟾酥、人工牛黄、人参提取物、肉桂、人工麝香和苏合香组成，具有芳香温通，益气强心之功效。主要用于气滞血瘀所致的胸痹和心肌缺血所致的心绞痛、心肌梗死[5]。麝香保心丸临床上不仅作为心绞痛急性发作的治疗药物，还可以用于冠心病的长期防治[6]。临床研究证实，长期（3个月以上）服用麝香保心丸可减轻并延缓心肌缺血的发生发展，减少心血管危险事件发生，并通过保护血管内皮细胞 、减少脂质浸润和抑制炎症等，阻遏AS的发展实现[7]。动物实验证实， 麝香保心丸具有减轻新西兰大耳兔和apoE-/-小鼠AS的作用[8-9]。
网络药理学是对复方中药进行研究的有效手段，能够发现药物作用靶点、筛选生物活性成分、评价药物毒性、研究作用机制和提高质量控制[10]等。本文利用网络药理学的手段研究麝香保心丸治疗AS的作用机制，为麝香保心丸得到临床长期应用提供理论依据。
1. 材料及方法
1.1 麝香保心丸靶点数据的收集和筛选
从TCMSP（
https://tcmspw.com/tcmsp.php ）[11]、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/ ）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/ ）[12]和BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ ）[13]等数据库中获取冰片、蟾酥、人工牛黄、人参提取物、肉桂、人工麝香、苏合香等七味药材所含化合物及其对应靶点。吸收、分布、代谢、排泄（ADME）指标是筛选活性化合物的重要指标，将全方所含化合物在TCMSP数据库中进行ADME筛选，将OB≥20%且DL≥0.1的化合物视为有效活性成分[14]，对不符合ADME筛选的化合物进行检视，将已被证明为生物活性成分的化合物进行回收，去除重复项，即得麝香保心丸全方有效成分及其潜在靶点。为了提高获取数据的可信度，将所获得的靶点信息进行进一步筛选，剔除BATMAN数据库中score低于48的靶点和TCMID中score低于400的靶点，并去除仅有一个成分作用的靶点，得到全方靶点信息。1.2 动脉粥样硬化靶点的收集及筛选
从GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）[15]、OMIM（https://omim.org/ ）[16]、TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php ）、DrugBank（https://go.drugbank.com/ ）和DisGeNet（https://www.disgenet.org/search ）[17]等数据库中获取动脉粥样硬化疾病靶点。剔除DisGeNet中靶点分值低于0.02的靶点和GeneCards中分值低于1的靶点，合并各数据库靶点，得到AS相关的靶点蛋白。1.3 化合物-靶点网络的构建
将获取的麝香保心丸潜在靶点和AS相关靶点导入STRING（
https://string-db.org/ ）数据库，统一转换为基因ID。取两者交集，得到麝香保心丸治疗AS相关靶点及其对应的化合物，将获取的数据导入Cytoscape3.8.2软件中进行进一步分析，构建化合物-靶点网络，以便于分析网络中的关键节点。1.4 靶点相互作用网络（PPI）的构建
通过STRING数据库对麝香保心丸治疗AS的靶点进行分析，构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并将PPI网络导入CytoScape3.8.2软件进一步进行分析，探究麝香保心丸治疗AS靶点之间的相互作用关系。
1.5 生物功能注释（GO）基因分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
使用Metascape（
http://metascape.org ）[18]数据库对获取的麝香保心丸抗AS靶点蛋白进行GO富集分析和KEGG通路分析，设定P<0.01，取生物学过程（GOBP）、分子功能（GOMF）和细胞成分（GOCC）条目的前10项，取KEGG富集通路的前20项，分析麝香保心丸治疗AS的主要相关通路及其功能。2 结果
2.1 麝香保心丸主要活性成分及其对应靶点
各个数据库中共检索到麝香保心丸中474个化合物，对应的潜在靶点共有6158个。经筛选后共得到麝香保心丸中化合物124个，对应的潜在靶点为452个。
2.2 麝香保心丸治疗 AS 靶点的获取
结合GeneCards、OMIM、TCMSP、DrugBank和DisGeNet等数据库，经过筛选，得到AS相关靶点1786个。
2.3 化合物-靶点和PPI网络的构建与分析
取麝香保心丸潜在靶点与AS相关靶点绘制维恩图（图1），取二者交集，即得麝香保心丸治疗AS的175个靶点，相关成分114个。采用STRING数据库对获取的175个靶点进行分析，得到一个具有175个点和2303个边的PPI网络（图2），通过对该网络图进行分析，根据各靶点在网络中的度值判断该靶点在网络中的重要程度。在麝香保心丸治疗AS的过程中，ALB、INS、ACTB、AKT1、IL-6、TNF、IL-1B、PPARG、MAPK3、CREB1等靶点的度值排在前10位，表明这些靶点作为关键节点起到最主要的作用。
用CytoScape3.8.2软件构建麝香保心丸治疗AS的化合物及其对应的靶点网络（图3），得到具有289个节点和1166条边的复合网络，图中化合物节点为红色，靶点节点为绿色。依据PPI网络中各靶点度值对各化合物进行评分，每个化合物分值为其潜在作用靶点的度值之和，以分值高低为依据评判麝香保心丸治疗AS过程中的贡献度，筛选出关键的20个化合物（表1）。鹅去氧胆酸、人参皂苷Rb1、肉桂醛、胆酸、熊去氧胆酸等化合物作为关键化合物，分值为1486、925、827、809和805，分别作用63、17、42、49和31个靶点，体现了中药的多成分、多靶点协同作用特点。
表 1 麝香保心丸治疗AS过程中的关键化合物化合物 分值 度值 来源 鹅去氧胆酸 1486 63 牛黄 人参皂苷Rb1 925 17 人参 肉桂醛 827 42 肉桂、苏合香 胆酸 809 49 牛黄 熊去氧胆酸 805 31 牛黄 人参皂苷Rh2 688 15 人参 油酸 674 16 肉桂 人参皂苷Rd 627 12 人参 肉桂酸 614 36 肉桂、苏合香 人参皂苷Rh1 607 13 人参 3-表齐墩果酸 603 25 苏合香 人参皂苷Rg1 583 13 人参 5-顺式-环十五烷-1-酮 547 23 麝香 5-顺式-环十四烷-1-酮 547 23 麝香 人参皂苷F1 546 12 人参 人参皂苷Rh4 546 12 人参 人参皂苷Rs1 546 12 人参 丙二酰基人参皂苷Rb2 546 12 人参 西洋参皂苷R1 546 12 人参 20-葡萄糖-人参皂苷Rf 528 11 人参 2.4 麝香保心丸治疗AS相关靶点的GO富集分析和KEGG富集分析
对GO富集条目进行分析（图4），麝香保心丸调控的靶点在质膜外侧、细胞质囊泡腔、内质网内腔、细胞顶端部分等区域富集，影响核受体活性、氧化还原酶活性、蛋白质结构域特异性结合、一氧化氮合酶调节活性等分子功能，调节血液循环、细胞对脂质的反应、细胞对激素刺激的反应、对脂多糖的反应等生物过程。KEGG通路富集显示（图5），麝香保心丸主要调节流体剪切应力与动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、胆汁分泌等通路，实现对AS的治疗效果。
3. 讨论
本研究基于网络药理学的方法探讨麝香保心丸治疗AS相关化合物及其潜在靶点和通路。本研究发现鹅去氧胆酸、人参皂苷Rb1、肉桂醛、胆酸、熊去氧胆酸可能在治疗AS时起到关键的作用。鹅去氧胆酸能够降低机体炎症反应、提高机体的抗氧化能力和缓解细胞自噬[19]。熊去氧胆酸能够促进AS模型ApoE(-/-)小鼠的胆固醇流出，降低炎症反应水平，减少AS斑块面积[20]。人参皂苷Rb1能够减轻炎症反应和氧化应激，并通过抑制细胞凋亡和促进自噬达到抑制ApoE(-/-)小鼠的早期AS的发展[21]。肉桂醛[22]能够调节IκB/NF-κB通路从而抑制炎症和氧化达到对AS的治疗效果。同时，这些关键成分也是麝香保心丸的入血成分，从侧面验证了网络药理学分析麝香保心丸治疗AS机制的可靠性[23]。
对麝香保心丸治疗AS的261个靶点进行分析，得到最主要的10个靶点。有研究证实，ALB与AS的严重程度具有显著的相关性[24]。AKT1参与代谢、细胞生长与存活、血管新生等多个过程进而防治AS[25]。INS是调节机体能量代谢的关键蛋白，胰岛素抵抗是导致AS的关键危险因素之一[26]。TNF能够调控细胞生长与凋亡[27]，且TNF能与IL-6和IL-1B协同作用诱导VEGF的生成，促进血管新生[28]。PPARG是降血脂药的关键受体之一，能够调节脂质代谢和抑制炎症[29]，对AS的防治起到重要的作用。这些关键靶点从各方面对AS进行治疗，且相互之间存在协调作用，达到了更好的治疗效果。
麝香保心丸治疗AS的靶点主要通过调节内分泌系统和信号转导系统，对炎症、免疫和氧化应激等过程进行调控，最终达到对AS的治疗作用。血管内皮剪切应力是心血管系统中的关键调控因子，低血管内皮剪切应力会诱发炎症并且使内皮细胞更容易被低密度脂蛋白和高血糖等危险因素影响，促进AS的发展[30]。钙离子作为第二信使在体内发挥重要作用，能够介导信号转导并调节生理功能，且钙离子能够促进AS斑块的形成，研究证实AS斑块中的钙离子浓度显著增加[31]。胆汁酸代谢是调节机体胆固醇水平的关键途径，且胆固醇还能通过与核受体协同作用进一步调节免疫和炎症反应，在AS的发生发展过程中发挥重要作用[32]。对这些通路进行分析发现麝香保心丸可能通过调节内分泌，调控炎症、免疫、脂质代谢，保护血管内皮细胞等作用达到对AS的治疗效果。
本研究通过网络药理学的方法全方面、多角度对麝香保心丸治疗动脉粥样硬化整体协同作用机制进行研究，发现了治疗过程中可能发挥主要作用的化合物、靶点和通路。本研究为麝香保心丸抗AS的机制研究提供了思路，为临床长期应用提供理论依据。
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图 2 麻黄碱对PC12细胞形态变化的影响
A. 空白对照；B. 10 μmol麻黄碱；C. 500 μmol麻黄碱浓度；D. 1000 μmol麻黄碱浓度；标尺：500 μm
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