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荜茇为胡椒科植物荜茇（Piper longum L.）的干燥未成熟果穗，为常见的药食同源中药。果穗变黑时采收，除去杂质，晒干后可入药。荜茇主要产于印度、菲律宾和越南，我国云南、广东和广西等多地也有栽培[1]。荜茇具有多种生物活性，药理实验表明其具有抗癌、抗氧化、保肝和神经系统保护等作用[1,2]。荜茇含有生物碱、黄酮、木脂素、挥发油和脂肪酸等多种化学成分, 其中最重要的化学成分为酰胺类生物碱成分[1,3-5], 而胡椒碱是其中代表性的生物碱类化合物[2,5]。研究表明，荜茇中生物碱类成分具有较强的药理活性，如抗肿瘤作用[6-8]；抑制高钙高磷导致的主动脉瓣膜间质细胞钙化作用[9]；大鼠肠系膜动脉血管舒张作用等[5]。同时也有研究表明，荜茇在传统用药中常用于冠心病的治疗[10]。本实验采用HPLC法对荜茇提取物中5个生物碱类成分（胡椒碱、N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺、几内亚胡椒碱、荜茇明碱和胡椒酰胺）的含量进行同时测定，并观察了荜茇提取物灌胃给药对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响，为荜茇用于治疗冠心病提供实验依据。
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LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV-2501PC型紫外分光光度计（日本岛津公司）；CPA225D型电子分析天平（德国SARTROIUS公司）；SB-5200DT型超声波清洗仪器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BIOPAC系统16道生理记录仪（BIOPAC Systems, Inc.）；冷光单孔手术灯（上海医疗器械五厂生产）。
甲醇（色谱纯，Fisher公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯；胡椒碱对照品（自制，纯度99.5%，批号：BB-01-0105）；几内亚胡椒碱对照品（自制，纯度99.0%，批号：BB-02-0108）；胡椒酰胺对照品（自制，纯度98.3%，批号：BB-03-0115）；荜茇明碱对照品（自制，纯度98.8%，批号：BB-04-0118）；N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺对照品（自制，纯度97.3%，批号：BB-05-0123）；荜茇提取物（自制，批号081001、081002和081003）；盐酸地尔硫卓片（天津田边制药有限公司，批号170604）；氯化钠注射（（四川科伦药业股份有限公司，批号：150910223）；垂体后叶注射液（宁波第二激素厂，批号：150624）；氨基甲酸乙酯（北京化学试剂公司，批号：20161101）；Wistar大鼠（雄性，体重220~240 g，斯贝福（北京）实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2011-0004）。
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色谱柱为RP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱：0~30 min，50%~100% A；30~50 min，100% A；50~55 min，100%~50% A。检测波长260 nm和343 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃。
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对照品溶液制备：精密称取5个生物碱对照品各10 mg，加入甲醇溶解并定容于50 ml棕色容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.2 mg/ml的对照品储备液，备用。取胡椒碱溶液（浓度208.90 μg/ml）, N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺溶液（稀释5倍，浓度39.59 μg/ml），几内亚胡椒碱溶液（稀释110倍，浓度1.84 μg/ml），荜茇明碱溶液（稀释9倍，浓度21.84 μg/ml）和胡椒酰胺溶液（稀释50倍，浓度4.17 μg/ml）作为定位溶液和线性溶液1。精密量取胡椒碱溶液（208.90 μg/ml）, N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺（197.96 μg/ml），荜茇明碱（196.52 μg/ml）和胡椒酰胺（208.47 μg/ml）对照品储备液各5.0、1.0、0.55、0.1 ml和几内亚胡椒碱储备液稀释20倍后溶液（10.13 μg/ml）0.9 ml置于10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容，得线性溶液2。再将线性溶液2按2、4、8、16倍逐级稀释，摇匀，即得线性溶液3~6。
供试品溶液制备：取荜茇提取物约0.025 g，精密称定，置50 ml棕色容量瓶中，甲醇超声5 min使溶解（250 W，33 KHz），放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀。精密移取10 ml置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液即得。
空白样品溶液：将甲醇用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液即得。
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分别吸取上述对照品线性溶液1~6各10 μl依次注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表1。在线性范围之内，浓度和峰面积的线性关系良好。高效液相色谱图见图1。
表 1 线性回归方程
化合物 线性回归方程 r 线性范围（μg/ml） 胡椒碱 Y=60744550.07X+
72196.060.9995 6.53~209 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺Y=30260.88X+4536.6 0.9998 1.24~39.6 几内亚胡椒碱 Y=72122.11X+70.35 0.9998 0.058~1.84 荜茇明碱 Y=61103.03X+6392.77 0.9999 0.676~21.8 胡椒酰胺 Y=71662.81X+2764.79 0.9998 0.130~4.16 
图 1 荜茇提取物生物碱对照品（A）和供试品（B）的高效液相色谱图
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精密吸取10 μl线性溶液2，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次。胡椒碱RSD为0.37%，N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺RSD为0.62%，几内亚胡椒碱RSD为0.59%，荜茇明碱RSD为0.88%，胡椒酰胺RSD为1.2%，表明仪器精密度良好。
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精密取同一供试品（批号081001）溶液，放置在室温避光条件下，分别于0、1、2、4、8、24 h测定峰面积。结果显示：胡椒碱、N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺、几内亚胡椒碱、荜茇明碱和胡椒酰胺峰面积RSD分别为1.1%、1.2%、0.51%、0.83% 和0.46%，表明本品在室温避光条件下24 h内稳定性良好。
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取同一批荜茇提取物（批号081001）6份，按供试品溶液制备方法制成样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定。测得胡椒碱平均含量为56.1%，RSD为0.64%；N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺平均含量为4.48%，RSD为1.32%；几内亚胡椒碱平均含量为0.461%，RSD为1.03%；荜茇明碱平均含量为1.73%，RSD为0.591%；胡椒酰胺平均含量为0.554%，RSD为0.814%，表明本法重复性良好。
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取6份同一供试品粉末（批号081001）约0.0125 g，精密称定，置50 ml棕色容量瓶中，甲醇超声5 min，放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀。精密移取4.0 ml置25 ml棕色容量瓶中，并加入一定量的对照品溶液（按1∶1比例），制成样品溶液，精密吸取该样品溶液10 μl，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表2，表明回收率良好。
表 2 加样回收率试验结果（n=6）
化合物 原有量
（m/μg）加入量
（m/μg）测得量
（m/μg）回收率
（%）RSD
（%）胡椒碱 540.0 500.0 1030 98.12 0.85 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺43.74 43.50 86.95 99.33 2.11 几内亚胡椒碱 4.508 4.525 9.078 101.01 1.86 荜茇明碱 16.33 16.50 32.54 98.19 1.31 胡椒酰胺 5.308 5.560 10.862 99.89 0.96 -
取3批荜茇提取物，每一批样品平行制备3份，并按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算供试品中5个生物碱的含量。3批样品测定结果见表3。
表 3 样品含量测定结果（%）
成分 批号 平均值 RSD（%） 081001 081002 081003 胡椒碱 56.1 49.7 51.6 52.5 6.27 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺4.48 4.21 4.28 4.32 3.20 几内亚胡椒碱 0.461 0.378 0.396 0.412 10.6 荜茇明碱 1.73 1.67 1.70 1.70 1.87 胡椒酰胺 0.554 0.461 0.493 0.500 9.46 -
将Wistar大鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别为：空白对照组、模型组、盐酸地尔硫卓组（6 mg/kg）、荜茇提取物小剂量组（10 mg/kg）、荜茇提取物中剂量组（30 mg/kg）、荜茇提取物大剂量组（60 mg/kg）。
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大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯（1000 mg/kg）麻醉，然后按2.0 IU/kg经舌下静脉注射垂体后叶素造成急性心肌缺血模型，以造模前后T波变化绝对值、心率及其变化百分率为观测指标。
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荜茇提取物3个剂量组和盐酸地尔硫卓组均按1 ml/100 g连续灌胃给药大鼠7天，空白对照组和模型组给予同体积生理盐水，荜茇提取物三个剂量组和盐酸地尔硫卓组于第7天灌胃给药后1 h造模，比较各剂量组造模后T波的变化、心率及其变化百分率。
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实验数据以均数±标准差（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ）表示，其他各组与模型组比较，采用F检验和t检验进行统计分析，P<0.05表示差异有显著统计学意义。 -
与空白对照组相比，模型组T波变化绝对值增高（表4），心率变化百分率加大（表5），差异具有显著性，表明实验造模成功；与模型组相比，盐酸地尔硫卓组（即阳性药组）T波变化绝对值降低，差异具有显著性，表明实验评价方法可行。荜茇提取物灌胃给药对垂体后叶素所致实验性心肌缺血大鼠T波变化绝对值的影响结果见表4，对心率变化百分率的影响结果见表5。
表 4 心肌缺血大鼠T波变化（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ，单位：mV，n=10）组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.008±0.003 0.007±0.004 0.007±0.003 模型组 0.033±0.018△△ 0.051±0.023△△ 0.053±0.022△△ 盐酸地尔硫卓组 0.024±0.022 0.018±0.014** 0.020±0.016** 小剂量组 0.031±0.031 0.042±0.04 0.016±0.013** 中剂量组 0.018±0.011* 0.021±0.012** 0.020±0.015** 大剂量组 0.023±0.022* 0.018±0.012** 0.022±0.016** 表 5 心肌缺血大鼠心率变化百分率变化（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ , n=10）组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.06±0.02 0.05±0.05 0.06±0.03 模型组 0.53±0.15△△△ 0.43±0.05△△△ 0.30±0.07△△△ 盐酸地尔硫卓组 0.58±0.13 0.41±0.04 0.34±0.05 小剂量组 0.52±0.16 0.42±0.15 0.35±0.15 中剂量组 0.57±0.18 0.43±0.13 0.34±0.09 大剂量组 0.73±0.11* 0.51±0.09 0.38±0.11 注：与空白对照组比较，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01 舌下静脉注射垂体后叶素后，荜茇提取物小、中、大剂量组均有降低T波变化绝对值的作用；大剂量组除在个别时间点有降低心率的作用，其他各组在各时间点对心率变化百分率没有明显影响。表明荜茇提取物有良好的抗心肌缺血活性作用。
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荜茇属于生物碱含量较高的药食同源中药材，我们研究所用药材中胡椒碱含量约为3.0%。采用大孔吸附树脂制备的荜茇提取物中胡椒碱含量高达50%左右，5个生物碱含量之和约为60%。
荜茇提取物中的5个生物碱成分主要是两种化学母核结构组成：二烯酰胺类（N-异丁基-2E，4E-十八烷二烯酰胺、几内亚胡椒碱和胡椒酰胺）和苯并二烯酰胺类（胡椒碱和荜茇明碱）。二烯酰胺类成分紫外最大吸收波长约在260 nm, 苯并二烯酰胺类最大吸收波长约在340 nm。因此，为了提高检测灵敏度，我们建立高效液相色谱分析方法时采用双波长同时检测这两类生物碱成分。荜茇中生物碱类成分因为含有共轭二烯结构导致对光稳定性很差，我们研究中发现胡椒碱对照品溶液在自然光下照射20 h，浓度下降约50%。文献报道胡椒碱固体光照含量也会有所下降，但较液体稳定性好[11]。因此，在测定荜茇中生物类成分时，供试品和对照品溶液均需要放置在棕色量瓶中避光保存。在大鼠抗心肌缺血试验中，与空白对照组相比，模型组T波变化绝对值增高，心率减慢，差异具有显著性，说明本次实验造模成功；与模型组相比，阳性药组（盐酸地尔硫卓组）T波变化绝对值降低，差异具有显著性，说明实验评价方法可行。与模型组比较，舌下静脉注射垂体后叶素后，荜茇提取物小、中和大剂量组均能够显著降低T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性；除大剂量组在1 min时可降低心率之外，荜茇提取物各组在各时间点对心率变化百分率基本没有明显影响。结果表明，荜茇提取物具有良好的抗心肌缺血活性。实验中我们也考查了胡椒碱单体抗心肌缺血的生物活性，结果显示，其也具有一定的抗心肌缺血活性，但生物活性弱于荜茇提取物。
本研究建立了荜茇提物中5个生物碱类成分含量同时测定的分析方法，同时也对高生物碱含量的荜茇提取物灌胃给药对垂体后叶素所致实验性心肌缺血大鼠的影响开展初步的药效试验。结果表明，所建立的含量测定方法可以用来有效控制荜茇提取物的质量；药效试验证明荜茇提取物具有较好的抗心肌缺血活性，其作用机制有待后续进一步研究。
Determination and effect of five alkaloids from extracts of Piper longum on rats with experimental myocardial ischemia induced by injection of pituitrin
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摘要:
目的 建立荜茇提取物中5个生物碱含量测定方法，并评估该提取物对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响。 方法 采用HPLC法同时测定5个生物碱的含量；采用经舌下静脉注射垂体后叶素造成急性心肌缺血模型，以造模前后T波变化绝对值、心率及其变化百分率为观测指标，评估荜茇提取物大、中、小三个剂量组对大鼠实验性心肌缺血的影响。 结果 3批荜茇提取物中胡椒碱平均含量依次为56.1%、49.7%、51.6%；N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺平均含量依次为4.48%、4.21%、4.28%；几内亚胡椒碱平均含量依次为0.461%、0.378%、0.396%；荜茇明碱平均含量依次为1.73%、1.67%、1.70%；胡椒酰胺平均含量依次为0.554%、0.461%、0.493%；荜茇提取物大、中、小剂量组均有降低T波变化绝对值的作用；除大剂量组在个别时间点有降低心率的作用之外，其它各实验组在各时间点对心率变化率无显著影响。 结论 所建立的生物碱含量测定分析方法可准确定量荜茇提取物中5个生物碱的含量；药效试验证明荜茇提取物具有较好的抗心肌缺血活性。 Abstract:Objective To determine the content of five alkaloids from extracts of piper longum and test the pharmacodynamic effect of them on rats with experimental myocardial ischemia induced by injection of pituitrin. Methods The content of five alkaloids was determined simultaneously by HPLC. The experimental myocardial ischemia in rats was induced by injection of pituitrin, and the absolute value of T wave change and change of heart rate before and after model establishment were chosen to be the observation index. The effects of large, medium and small dose groups were evaluated. Results Three batches of samples were analyzed, with the contents of piperine for 56.1%, 49.7%, 51.6%; N-isobutyl-(2E,4E)octadecatrienamide for 4.5%, 4.2%, 4.3%; guineensine for 0.46%, 0.38%, 0.40%; piplartine for 1.73%, 1.67%, 1.70% and piperamide for 0.55%, 0.46%, 0.49%, respectively. All dose groups from extracts of piper longum had significantly reduced the absolute value of T wave and almost have no effect on the change of heart rate, except the high dose group showed the effect of reducing heart rate at some time . Conclusion The HPLC method was suitable for the simultaneous determination of five alkaloids from extracts of piper longum. It was shown that extracts of piper longum had good bioactivity in anti-myocardial ischemia. -
Key words:
- extracts of Piper longum /
- alkaloid /
- content determination /
- anti-myocardial ischemia
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脑卒中是当前国内首位致死致残疾病，其中缺血性脑卒中占所有卒中的70%[1]，严重危害人民身体健康。缺血性脑卒中发生后尽可能快的实现缺血半暗带再灌注是治疗的关键[2]，但再灌注会使缺血半暗带区域形成强烈的免疫激活和炎症损伤[3]，可能导致缺血性脑卒中急性损伤期的二次伤害并在远期预后上增加功能恢复难度[4]。日本学者研究显示，血管内治疗后仅有约1/7的患者有较好的90天预后[5]，在我国接受再灌注治疗的患者仍有约1/3会留有终身残疾[6]，因此对脑卒中后神经保护药物的研究显得越来越重要[7]。大量研究表明，神经保护药可通过多种途径抑制致病级联反应达到急性期治疗效果，如尼莫地平、依达拉奉等[8]；也可以在长期治疗和功能恢复中发挥重要作用，包括一些“老药”新用，如右美托咪定、半胱氨酰白三烯受体拮抗剂等[9]，特别是一些活血化瘀功效中药组方及成分，如灯盏生脉胶囊、白果内酯等的研究都取得了一定的进展[10]。课题组前期研究发现：中药红花（Carthami Flos）中的黄酮类化合物菸花苷能够通过促进自噬、抗氧化等对CIRI动物发挥急性期治疗效果[11, 12]，同时菸花苷长期给药可改善CIRI大鼠生存状态[13]，但到目前为止，菸花苷发挥长期保护作用的机制尚不明确。作为延续性工作，本实验重点研究了菸花苷长期给药对CIRI大鼠神经功能的影响，并运用转录组测序等方法对其作用机制进行了初步探索，旨在为将菸花苷应用于促进CIRI大鼠神经功能恢复提供更多实验支撑，也为从传统活血化瘀中药中开发神经保护药物提供借鉴。
1. 材料
1.1 实验动物
成年雄性Wistar大鼠，体重240±10 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，许可证号为SCXK（沪）2018-0006。大鼠购入后于学校药学系SPF级动物房内饲养，自由食水，人工照明模拟昼夜变化。实验操作严格遵守动物福利和伦理原则。
1.2 药品和试剂
菸花苷注射液和菸花苷空白对照制剂由苏中药业集团股份有限公司生产加工（批号：20200331），菸花苷含量10 mg/ml。Caspase-1多克隆抗体（22915-1-AP）、GSDMD多克隆抗体（20770-1-AP）、NLRP3单克隆抗体（68102-1-Ig）、ASC多克隆抗体（10500-1-AP）均购于武汉三鹰生物科技有限公司，重组Anti-Caspase-11抗体（EPR18628）购于Abcam公司，IL-18多克隆抗体（AF5207）购于碧云天生物科技有限公司。
1.3 仪器设备
直钳、齿镊、线剪等手术器材（上海医疗器械有限公司）；MCAO线栓（250 ～ 280 g，北京西浓科技有限公司）；平衡木装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；Morris水迷宫泳池及站台（上海玉研科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（3H16RI，湖南赫西仪器装备有限公司）；扫膜仪（Tanon-
5200 ，上海天能科技有限公司）。2. 方法
2.1 分组及给药
大鼠饲养至体重270±15 g，采用随机数字表法将大鼠随机分为3组:其中模型组（M）和菸花苷组（Y）大鼠进行CIRI模型的建立，而假手术组（S）大鼠则无脑部损伤。造模后1 h，菸花苷组腹腔注射菸花苷注射液1 ml/kg[14]，模型组与假手术组腹腔注射菸花苷注射液空白对照制剂1 ml/kg，造模后常规饲养并在固定时间给药，第1周1次/日，1周后1次/2日持续至实验周期结束。
2.2 造模方法
采用MCAO/R法进行模型制备，参考文献并进行一定改进[15]，具体方法如下：术前4 h禁食水，用1%戊巴比妥钠（4 ml/kg，生理盐水配制）腹腔注射麻醉。手术部位常规备皮消毒，仰卧位，将大鼠四肢与前牙用皮筋固定于手术台板。沿颈部正中线作2 cm纵行切口，从气管偏右侧（大鼠的左侧）沿肌纤维走行向下分离，至颜色深红且明显搏动的左颈总动脉，沿该血管向上至颈总动脉分叉，近气管侧为颈外动脉，另一侧即为线栓需要进入的颈内动脉。在距分叉1.5 cm处结扎左颈总动脉近心端，用动脉夹锁闭颈内动脉及颈外动脉近心端。用眼科剪在颈总动脉近心端距分叉口1 cm处剪一斜行小口，将线栓插入左颈总动脉，用缝合线略微固定于颈总动脉，撤掉颈内动脉近心端动脉夹，将线栓缓慢深入颈内动脉直至明显阻力时停止深入（18 ～ 20 mm），撤掉颈外动脉近心端动脉夹并将固定线栓的缝合线牢固打结，逐层缝合结缔组织和皮肤。术后将大鼠放于保温垫上保持其体温至苏醒放入笼中，术后1 h根据分组腹腔注射给药，待大鼠完全苏醒后观察大鼠右前肢无法完全伸展，且大鼠行走时向右侧倾倒或前进时向右侧转圈，此即标志造模成功。术后2 h使用初次剂量1/3的1%戊巴比妥钠进行二次麻醉，将线栓向外抽出1.5 cm形成大脑缺血再灌注损伤。假手术组仅分离血管，不插入线栓。
2.3 悬尾偏转实验
在第2、4、8周进行3轮悬尾偏转实验[16]。将大鼠尾中段处固定在距地面垂直高度30 cm的实验架上，分别记录大鼠头部及躯干向左、右两侧偏转的次数，偏离中轴线10°以上计为偏转1次，每轮实验记录10次。正常大鼠会随机向左侧或者右侧进行偏转并试图攀爬，而CIRI大鼠由于一侧肢体的偏瘫及肌力减弱，向另一侧进行偏转的几率会大大提高。
2.4 平衡木实验
在第2、4、8周进行3轮平衡木实验[17]。取长2 m、宽2.5 cm、距地面高度50 cm的木条为平衡木，一端为大鼠躲避处放置黑色方盒，另一端为大鼠起步处。每轮实验测试前每只大鼠训练3次，每次间隔2小时；训练完毕后观察大鼠从起步处经过平衡木进入躲避处的过程，记录大鼠通过平衡木的情况并按以下标准进行打分。
平衡木评分标准 得分 通过平衡木，无踩空、跌倒 0分 通过平衡木，踩空、跌倒机会小于50% 1分 通过平衡木，踩空、跌倒机会大于50% 2分 通过平衡木，对侧后肢出现拖行 3分 不能通过平衡木，但能保持平衡不摔落 4分 不能在平衡木上保持平衡，伴有摔落 5分 2.5 水迷宫实验
由同一名操作人员在第2、4、8周进行3轮水迷宫实验[18]。本实验使用直径1.8 m的圆形水池，水温25±2 ℃，站台为高0.4 m、直径12 cm的圆形板，水深约0.43 m，即水位高度超过站台平面约3 cm，并在池壁四个方位上方1 m高处悬挂显著的远距离视觉参照物。每轮前5天站台放于池中固定位置，大鼠入水后找寻并记忆站台位置，第6天撤掉站台进行空间探索实验测试大鼠的空间记忆能力，记录大鼠在90 s内穿过之前站台位置的次数。
2.6 脑形态及TTC染色
8周后脱颈处死大鼠，断头取脑，吸除表面水分后将脑组织冷冻硬化，切除嗅球、脑干、小脑等部位，将大脑切成厚度均等的6片，放入2% TTC染液37 ℃水浴染色10 min，4%多聚甲醛溶液固定5 min后拍照，白色或缺如则计为梗死萎缩区，正常组织显示为红色部分。利用ImageJ软件进行图像处理，按公式计算梗死萎缩区体积百分比=[（患侧梗死体积+萎缩体积）/健侧半脑体积]×100%，其中萎缩体积=健侧半脑体积−患侧半脑体积。
2.7 转录组测序
造模8周后，提取总RNA，在RNA总量超过1 μg的基础上，以浓度超过35 ng/μl的标准，进行库的建立，并确保OD 260/280≥1.8，OD 260/230≥1.0。分离所需的mRNA后加入碎片缓冲液，使mRNA随机分裂为300bp的小片段。反转录合成cDNA，利用PCR技术扩增15 cycles，2%琼脂糖胶回收目的条带并进行精确定量，借助cBot系统通过大规模分子簇的方式达到荧光信号检测强度，IlluminaNovaseq6000平台测序，读长控制在2×150 bp。对所得数据库数据进行筛选过滤，基因差异表达分析。
2.8 蛋白印迹法测定
采用Western-blot法检测各组大鼠脑组织缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白表达。参考相关文献取缺血半暗带区域作为样品[19]，取适量样品加入RIPA裂解液进行研磨裂解，12 000 r/min、4 ℃离心取上清液，BCA法定量蛋白浓度，浓度均一化后进行蛋白变性作为待测样品。经电泳、转膜、漂洗、封闭、漂洗，一抗（Caspase-1，1∶10 000、Caspase-11,1∶4 000、GSDMD,1∶800、NLRP3,1∶800、ASC,1∶10 000、IL-18，1∶1 000、GAPDH，1∶15 000）4 ℃孵育16 h，漂洗后二抗（1∶15 000）25 ℃孵育1 h，再次漂洗后加入ECL发光液，在凝胶成像分析系统中成像。
2.9 炎症因子测定
取大鼠脑组织10 mg加入适量PBS溶液，研磨后低温离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书配置梯度浓度标准品溶液，按顺序滴加样品及各反应液，显色反应终止后，使用酶标仪测定450 nm处OD值，根据标准曲线计算各样品IL-1β、IL-18浓度。
2.10 统计学处理
应用ImageJ软件对脑组织TTC切片的照片、Western-blot图片进行图像处理，统计学分析及数据处理使用GraphPad Prism 8.0.1进行。实验数据采用（
$\bar {\mathrm{X}} $ ±SE）表示，大鼠神经行为学数据使用双因素方差分析，TTC切片及Western-blot数据应用单因素方差分析方法， P<0.05表示差异有统计学意义。3. 结果
3.1 菸花苷对CIRI大鼠神经功能的影响
在第2、4、 8周对大鼠的神经功能进行多角度评价，其中悬尾偏转实验中模型组大鼠的对侧偏转率明显高于菸花苷组（P<0.000 1）（图1A）；平衡木实验中模型组大鼠的评分始终高于菸花苷组（P<0.05）（图1B）；水迷宫实验中模型组大鼠90 s时间内穿台次数明显少于菸花苷组（P<0.05）（图1C）。以上实验显示菸花苷长期给药能够一定程度上改善CIRI大鼠的偏瘫及肌力减弱情况，提高肢体平衡性、空间学习和记忆能力。
图 1 造模后第2、4、8周大鼠神经功能评价A.大鼠悬尾垂吊实验中大鼠对侧偏转率；B.大鼠在平衡木实验中评分；C.大鼠水迷宫实验中90 s内通过原站台位置的次数n=10；**P<0.01，**P<0.01，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.000 1，与模型组比较。3.2 菸花苷对CIRI大鼠脑梗死萎缩体积的影响
TTC染色显示模型组大鼠脑组织明显变小且左侧萎缩缺如体积超60%（P<0.01）；菸花苷组大鼠脑梗死萎缩体积同模型组相比减少约25%（P<0.01）（图2A、2B、2C）。提示CIRI长期发展会导致大鼠脑组织梗死萎缩，菸花苷长期给药能减轻大鼠脑组织梗死萎缩状况。
图 2 造模8周后大鼠脑组织外观A.大鼠完整脑组织外观形态图；B.大鼠大脑切片TTC染色图；C.大鼠脑组织梗死体积n=6；****P<0.000 1，与假手术组比较；##P<0.01，与模型组比较。3.3 转录组测序结果
以总表达量为基础，利用TPM进行数据分析，以 |log2fc|>1， p adjust<0.05为显著差异标准，统计分析组间的差异基因（DEGs）。模型组对假手术组DEGs
2816 个，其中上调1900个，下调916个；菸花苷组对模型组DEGs 1 546个，其中上调343个，下调1 203个；具有反转效应的DEGs 1 416个，其中上调290个，下调1 126个（图3A、3B）。分析1 416个反转效应DEGs，基因数在前20位的GO功能注释条目与生物学过程（BP）和细胞组成（CC）相关的基因较多，主要参与生物调节、细胞过程、细胞组分（图3C）。通过KEGG功能富集分析，发现1 416个DEGs主要富集在NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等通路中（图3D），其中NOD样受体信号通路是显著性最高的信号通路，参与细胞炎症、细胞死亡过程的重要通路之一。
如表1所示， NOD样受体信号通路中GSDMD、IL-18、NLRP3等基因富集度较高，而这些基因在细胞焦亡过程均有参与，结合图3A中所标注的焦亡相关基因表达情况，推测脑缺血再灌注损伤可能与细胞焦亡有关，且菸花苷可能对细胞焦亡过程产生一定的抑制作用。
表 1 菸花苷治疗CIRI大鼠KEGG筛选的通路和富集基因通路名称 通路显著性（P值） 富集基因 NOD样受体信号通路 6.05×10−7 NF-κB、IL-18、Caspase8
NLRP3、GSDMD、Caspase4肿瘤坏死因子受体信号通路 1.12×10−6 NF-κB、p38、Bcl3、TNFR1、
TNFR2、Ccl2、、Caspase8Toll样受体信号通路 3.66×10−6 NF-κB、p38、Caspase8
TLR3、TLR4、TLR7丝裂原活化蛋白激酶信号通路 5.73×10−6 NF-κB 、P38、TNFR、IL-1R 3.4 菸花苷对CIRI大鼠焦亡相关蛋白的影响
根据转录组数据结果，采用Western-blot方法检测脑缺血半暗带中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、NLRP3、ASC、IL-18蛋白的表达情况（ASC的基因型为PYCARD，Caspase-11与Caspase-4同源）。结果显示模型组表达水平显著高于假手术组（P<0.01），菸花苷组显著低于模型组（P<0.05）（图4）。提示菸花苷长期给药能够降低CIRI大鼠细胞焦亡相关蛋白的表达量。
图 4 大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达情况A.NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD-N、ASC、IL-18蛋白条带；B.NLRP3 蛋白相对表达量；C.Cas-1 蛋白相对表达量；D.Cas-11 蛋白相对表达量；E.GSDMD-N蛋白相对表达量；F.ASC蛋白相对表达量；G.IL-18蛋白相对表达量n=4； **P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，，###P<0.001与模型组比较。3.5 菸花苷对CIRI大鼠IL-1β、IL-18的影响
利用ELISA法对炎症因子IL-1β、IL-18进行了测定，结果显示模型组IL-1β、IL-18释放量相较于假手术组明显增加（P<0.001），菸花苷组IL-1β、IL-18释放量比模型组明显降低（P<0.05）。表明菸花苷能够抑制因CIRI导致的脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量升高。
图 5 大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-18释放量A.炎症因子IL-1β的释放量；B.炎症因子IL-18的释放量n=5； ***P<0.001,与假手术组比较；#P<0.05，与模型组比较。4. 讨论
目前神经保护药物的实验研究更多集中于缺血性脑卒中的急性损伤期治疗，对缺血性脑卒中长期治疗和慢性恢复的研究相对较少[20]。本实验以菸花苷对CIRI大鼠的长期治疗和功能恢复研究为重点，对CIRI大鼠神经运动能力及脑组织外观形态进行了观察分析，结果表明，菸花苷能显著改善CIRI大鼠的神经运动功能，提高长期治疗和功能恢复效果，明显减少脑梗死萎缩体积，抑制脑缺血后梗死区域进一步扩大并改善梗死区域坏死萎缩的状况。
缺血性脑卒中涉及到细胞凋亡、铁死亡和细胞焦亡等多种病理机制[21]，其中细胞焦亡是一种依赖半胱天冬酶（caspase）的炎症性细胞死亡形式，在缺血性脑卒中神经损伤中扮演了重要角色[22]。细胞焦亡过程中GSDMD蛋白被活化caspase剪切为具有活性的GSDMD-N， GSDMD-N聚合并在细胞膜上形成孔道导致细胞膜破裂伴随细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子释放增加[23]，进一步促进炎症反应的发生和神经细胞的死亡。有研究表明，通过抑制细胞焦亡可以有效促进CIRI后的神经功能恢复[24, 25]。本实验首次将菸花苷促进缺血性脑卒中的长期恢复与其抑制细胞焦亡联系起来，利用转录组测序及蛋白免疫印记等方法对细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平进行了测定，数据显示菸花苷能够降低NOD样受体信号通路中细胞焦亡关键基因的表达量并使焦亡相关蛋白的表达水平以及炎症因子的释放量明显下降，表明菸花苷能够抑制细胞焦亡及其引起的炎症反应。
综上，菸花苷能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，显著促进CIRI大鼠的长期功能恢复，该作用可能与抑制大鼠脑组织细胞焦亡有关。随着对菸花苷治疗缺血性脑卒中研究的不断深入，其对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤的长期保护作用及机制将被进一步阐释。
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图 1 荜茇提取物生物碱对照品（A）和供试品（B）的高效液相色谱图
1.荜茇明碱; 2.胡椒碱; 3.胡椒酰胺; 4.几内亚胡椒碱; 5.N-异丁基-2E，4E-十八烷二烯酰胺
表 1 线性回归方程
化合物 线性回归方程 r 线性范围（μg/ml） 胡椒碱 Y=60744550.07X+
72196.060.9995 6.53~209 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺Y=30260.88X+4536.6 0.9998 1.24~39.6 几内亚胡椒碱 Y=72122.11X+70.35 0.9998 0.058~1.84 荜茇明碱 Y=61103.03X+6392.77 0.9999 0.676~21.8 胡椒酰胺 Y=71662.81X+2764.79 0.9998 0.130~4.16 
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表 2 加样回收率试验结果（n=6）
化合物 原有量
（m/μg）加入量
（m/μg）测得量
（m/μg）回收率
（%）RSD
（%）胡椒碱 540.0 500.0 1030 98.12 0.85 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺43.74 43.50 86.95 99.33 2.11 几内亚胡椒碱 4.508 4.525 9.078 101.01 1.86 荜茇明碱 16.33 16.50 32.54 98.19 1.31 胡椒酰胺 5.308 5.560 10.862 99.89 0.96
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表 3 样品含量测定结果（%）
成分 批号 平均值 RSD（%） 081001 081002 081003 胡椒碱 56.1 49.7 51.6 52.5 6.27 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺4.48 4.21 4.28 4.32 3.20 几内亚胡椒碱 0.461 0.378 0.396 0.412 10.6 荜茇明碱 1.73 1.67 1.70 1.70 1.87 胡椒酰胺 0.554 0.461 0.493 0.500 9.46
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表 4 心肌缺血大鼠T波变化（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ，单位：mV，n=10）组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.008±0.003 0.007±0.004 0.007±0.003 模型组 0.033±0.018△△ 0.051±0.023△△ 0.053±0.022△△ 盐酸地尔硫卓组 0.024±0.022 0.018±0.014** 0.020±0.016** 小剂量组 0.031±0.031 0.042±0.04 0.016±0.013** 中剂量组 0.018±0.011* 0.021±0.012** 0.020±0.015** 大剂量组 0.023±0.022* 0.018±0.012** 0.022±0.016**
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表 5 心肌缺血大鼠心率变化百分率变化（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ , n=10）组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.06±0.02 0.05±0.05 0.06±0.03 模型组 0.53±0.15△△△ 0.43±0.05△△△ 0.30±0.07△△△ 盐酸地尔硫卓组 0.58±0.13 0.41±0.04 0.34±0.05 小剂量组 0.52±0.16 0.42±0.15 0.35±0.15 中剂量组 0.57±0.18 0.43±0.13 0.34±0.09 大剂量组 0.73±0.11* 0.51±0.09 0.38±0.11 注：与空白对照组比较，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
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